フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)法を用いたグリコーゲンのグルカン鎖長分布の決定

本プロトコールでは、フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)技術を用いて、グリコーゲンの鎖長分布(CLD)および平均鎖長(ACL)を決定しています。

この方法は、グリコーゲン粒子の構造組織のよりよい理解を提供する。グルカン鎖の母集団、いわゆる鎖長分布がグリコーゲン粒子の物理化学的性質を決定するため、重要な課題である。水溶性など。

この技術の主な利点の1つは、グルカン鎖長に関係なく蛍光が一定であることです。グルカンによって結合されたAPTS分子は1つだけです。したがって、蛍光強度はグルカン鎖の数に正比例する。

アシストキャピラリー電気泳動の分野は、グリコーゲン代謝酵素の医学的メカニズムを解明するのに適している。例えば、我々は、受け入れられたグルカン上に分岐酵素によって転写されたグルカン鎖の重合度を決定することができる。反応は条件下で行わなければならない。

したがって、領域は湿気から保護されなければならない。精製グリコーゲン1ミリリットル当たり0.5〜2ミリグラムの200マイクロリットルを、pH4.8の100酢酸緩衝液200マイクロリットルと混合する。2マイクロリットルのイソアミラーゼ、および1.5マイクロリットルのプルラナーゼを加える。

上下にピペッティングして優しく混ぜる。その後、摂氏42度で1.5ミリリットルのチューブで16時間インキュベートします。摂氏95度で5分間インキュベートして反応を停止します。

16で遠心分離し、室温で5分間G'を100回、ペレット化し、任意の不溶性物質を除去した。スーパーメンテナンスをピペットで取り外し、新しい注釈付きチューブに移します。空のマイクロフュージ管に樹脂ビーズを加えた後、アニオン陽イオン交換樹脂ビーズ100マイクロリットル相当を加えて上澄み液を脱塩し、攪拌する。

ピペッティングでサンプルを収集し、新しい注釈付きチューブに入れます。サンプルをフリーズドライします。乾燥したサンプルを室温または摂氏20度で保存します。

乾燥試料を、2マイクロリットルの1モルのシアノ水素化ホウ素ナトリウムおよびテトラヒドロフラン、および2マイクロリットルの8アミノ酸1−3−6ピレントリスルホン酸と混合する。暗所で摂氏42度で16時間インキュベートする。各サンプルに46マイクロリットルの超純水を加える。

サンプルを50倍に希釈するには、100マイクロリットルのマイクロバイアル中の49マイクロリットルの超純水に1マイクロリットルのサンプルを加える。渦の中で徹底的に混ぜる。顔をセットしながら、サンプルを5〜10分間暗闇に置きます。

逆極性電気泳動を行うには、方法を設定し、注入圧力を平方インチあたり0.5ポンドの力に設定します。次に、極性を反転モードに設定して分離します。N結合型糖質分離バッファーを超純水で3分の1に希釈する。

裸の溶融シリカキャピラリー中で30キロボルトで希釈された緩衝液中でAPTS標識グルカン分離を行う。次に、射出時間を設定し、解析を開始します。電気泳動プロファイルと積分データをそれぞれ含むASCファイルとCDFファイルをエクスポートします。

ASCファイルを開き、タイムチャートに従って相対蛍光単位を描画します。CDFファイルを開きます。最初の自動積分を続行し、谷間積分と最小面積で次のパラメータを調整します。

不適切な統合イベントを手動で確認して修正します。4.13〜4.67分の間に観察された蛍光シグナルは、未反応のAPTSに由来する。標識マルトヘキサオースDP 6のアリューシャン時間は8.49分と推定された。

ウシグリコーゲンのAPTS標識グルカンをDP6のアリューシャン時間に基づいて同定した。グリコーゲンを枝切り酵素と共にインキュベートしなかった対照試料において、遊離マルトオリゴ糖の痕跡は検出されなかった。差し込みパネルは、最大44DPのグルカン鎖の分離を示しています。鎖長分布は、各DPのDPの割合として示される。平均鎖長は、対応する重合度を鎖回毎百分率を合計することにより算出した。

顔分析によると、最も豊富なグルカンはマルトースとウサギの肝臓、カキのマルトヘキサオース、ウシ肝臓のマルトヘプタオースです。野生型および変異型シアノバクテリア細菌株から精製されたグリコーゲンの鎖長分布を、顔分析を用いて決定した。減法分析は、変異体の各DPの割合から野生型の各DPの割合を差し引くことによって実施した。

シネコシスチスの野生型および変異体由来のグリコーゲンの平均鎖長分布を、各CLDについて観察される最大ピークに従って標準化した。この技術は、グリコーゲン代謝の欠陥に関連するヒト疾患、特にアンデルセン病疾患の、細胞内の異常なグリコーゲン粒子の蓄積から豊富な結果をもたらすことのよりよい理解を可能にする。