オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略
February 11th, 2022
このプロトコルは、オープンソースの自動化を利用して唾液サンプルのRT-qPCR分子検査を実行するSARS-CoV-2診断方法を記述しています。このスケーラブルなアプローチは、臨床公衆衛生サーベイランスや小規模な大学研究所の能力向上にも適用できます。
低コストの唾液ベースのCOVID 19診断テストとワークフローを開発し、大規模なコミュニティスクリーニングアプリケーション向けに実装とスケールアップが容易です。ここでは、オープンソースの液体処理ロボット、標準サーモサイクラー、ソフトウェアを使用して、抽出バッファーや安定化バッファーを使用せずに唾液の直接テストを実行しながら、正確な診断結果を提供します。シンプルな自動化された並列ワークフローにより、システムをスケールアップして、最小限の機器、スペース、人員要件で毎日何千ものテストを実行できます。
カイリーキングに加えて、レイチェルハム、私たちの臨床検査スーパーバイザーとオースティンSmothers私たちの教育コーディネーターは、手順を実証するのに役立ちます唾液収集チューブの外側を70%エタノールで除染し、テストのためにそれらを実験室に移すことから始めます。各サンプルバーコードをスキャンして、毎日の摂取量スプレッドシートにサンプルの到着を記録します。スキャンサンプルを摂氏95度のオーブンで30分間熱処理し、耐熱性手袋を使用してサンプルを取り出します。
サンプルアサインメントステーションで各サンプルローディングロボットの毎日のサンプルローディングスプレッドシートを開きます。次に、各384ウェルプレートに188サンプルを割り当てます。プレート名、日付、四半期番号が記載されたラベルトレイ。
サンプルを順番にスキャンして、サンプル読み込みスプレッドシートに入れます。サンプルローディングステーションでは、ロボットのデッキ配置に対応する8つの3Dプリントラックの2つのフルセットを並べます。チューブのキャップを外し、ラック 1 の位置 A1 から始めて、3D プリントされたラックに入れます。
各ラックを左から右、上から下まで満たします。このロード・パターンをラック 2 で続行してから、ラック 4 および 5 に進みます。ロードされた 4 分の 1 サンプル・ラックをデッキ 1、2、4、5、7、8、10、11 に置きます。
P20のヒントをデッキ3と9に配置します。セットアッププロセスを簡素化するために、材料をロボットに背面から前面にロードします。マスターミックスプレートは専用のロボットで製造され、摂氏4度で保存されます。
一度に1枚のプレートが使用され、プレート名でラベル付けされ、鋭利な刃を使用して、コントロールウェルの周りのホイル内の線を切断する。マスターミックスプレートをデッキ6に置き、ホイルカバーを剥がして、コントロールウェルを覆う小さな長方形を残します。先端ボックスを発見し、ロボットを閉じます。
カスタム Python 操作プロトコルを初期化するには、ロボット デスクトップ アプリケーションの実行の開始をクリックします。各四半期は、プレートにロードするのに24.5分かかります。タイマーをリマインダーとして設定します。
ロボットが動作している間に、キャップを外し、2分の1のサンプルチューブを3Dプリントされたラックの2番目のセットにロードします。ロボットが一時停止したら、4 分の 1 ラックを取り外して 4 分の 2 ラックと交換し、デスクトップ アプリケーションで [実行の再開] をクリックします。4分の1のサンプルチューブを要約し、結果を待っている間に摂氏4度の冷蔵庫に保管します。
この積載プロセスを 4 分の 3 と 4 に繰り返します。装填されたプレートをバイオ安全キャビネットに移します。汚染を最小限に抑えるために、転送中はプレートを覆ったままにしてください。
繰り返しサンプルを収集し、第4四半期の最後のサンプルとして割り当てます。サンプルに番号を付け、バーコードをスキャンし、元のサンプルの場所と結果をサンプルローディングスプレッドシートに入力します。繰り返しサンプルをバイオ安全キャビネットに移します。
繰り返しサンプルチューブをロボットローディングラックにロードしないでください。各繰り返しサンプルの2マイクロリットルのピペットを正しいウェルに。指定されたピペットを使用して、患者サンプルを追加します。
汚染を最小限に抑えるためにサンプルを追加しながら、制御井戸をホイルで覆ったままにしておきます。鉗子を使用して制御井戸の上のホイルカバーを剥がします。確認された陽性患者サンプルの2マイクロリットルをウェルM23およびM24にピペットで打ち込む。
ウェルN23〜N24に2マイクロリットルのヌクレアーゼ自由水をピペットし、ウェルO23〜O24にマイクロリットル当たり200コピーの2マイクロリットルを混合した陽性対照。ウェル P23 ~ P24 を空のままにしておくと、マスターミックスバッチの品質が監視されます。プレートを光学的に透明なシールで覆い、アプリケーターローラーを使用してすべてのウェルにシールを接着します。
プレートを2, 500 RPMで30秒間渦巻きにして十分に混合し、次にプレートを500倍Gで1分間遠心分離します。サーモサイクラーソフトウェアでプロトコルプログラムを選択し、将来のプレート用にプロトコルを保存します。密閉プレートをサーモサイクラーに置き、プロトコルを実行します。
CT 値をエクスポートし、サンプル読み込みスプレッドシートに値をコピーします。陽性コントロールの場合は、少なくとも 1 つの陽性コントロールが P1 プローブと N1 プローブの両方で 22 ~ 28 の CT 値を生成するかどうかを確認します。あるいは、既知の陽性サンプルウェルは、P1およびN1プローブ上で33未満のP1およびN1CT値を産生する。
陰性対照の場合、2つの陰性対照ウェルのいずれにもN1またはP1 CT値がないことを確認します。プレートを無効にする前に、CT値に有効な増幅曲線があることを確認してください。P1が33未満のCTの結果を生成する場合、井戸も有効であると考え、N1からの結果に進む。P1 が 33 より大きいか等しいか、または CT 値のない CT の結果を生成する場合、well は無効であると見なします。
N1が33未満のCTの結果を生じる場合、その井戸をyesと評価する。N1がCT値を生じない場合、無いとしても評価する。N1 が 33 以上の CT 値を生成する場合は、ウェルに星がないと評価します。
すべてのN1 CT値が実際の増幅曲線に関連付けられていることを確認します。N1のCT値に増幅曲線がない場合、ウェルはいいえです。繰り返しサンプルを特定し、内部サンプル番号とサンプルタイプでラベルを付け、ローディングワークフローに戻します。
代表的な画像は、N1またはSARS CoV−2合成RNAおよびP1またはHSRPP30合成DNAのRTQ PCR検出を示す。標準曲線を標準偏差でプロットし、このプローブプライマーの組み合わせを用いて正確な検出の範囲を決定した。それぞれの希釈液で得られた平均CT値を、合成RNAおよび合成DNAの推定量に対してプロットした。
どちらの場合も、線形曲線は、広範囲の遺伝子コピー濃度にわたって良好な相関係数を示した。ロボットと手動サンプルローディングの両方を使用して一意のサンプルから得られたN1 CT値を転置して、手動ローディングとロボットローディングの間のアッセイ間変動性を決定しました。手動法と自動法の間の線形関係は、両方の方法が機能的に同等であることを示す高い相関係数を生成した。
アッセイ内変動性は、ロボットおよび手動サンプルローディングの両方から得られた転置複製N1 CT値を用いても決定した。唾液の粘度低下に対する熱処理方法の評価をここに示す。SARS CoV-2陰性唾液を単一の供給源から採取し、アリコートを摂氏95度で0分、30分または60分間熱処理した。
各条件の技術的反復からP1 CT値をプロットし、処置方法間の変動性を決定した。30分および60分の熱処理方法はどちらも、処理対照なしと比較してサンプル変動性を有意に減少させた。30分と60分の治療の間に有意差はなかった。
そこで30分間熱処理法を実施し、処理時間を短縮した。適切な無菌技術を使用して、特に手動サンプルやコントロールをロードする場合は、テストプレートの汚染を最小限に抑えます。手や袖で皿を横切らないでください。
臨床結果が得られたら、サンプルをバイオハザード廃棄物に処分するか、特定の株を決定するための全ゲノムシーケンシングなどのさらなる分析のために保存することができます。この手法により、広範なコミュニティテストが可能になり、テストカバレッジの影響とCovid 19の無症状の広がりを調査できます。
概要
このプロトコルは、唾液サンプルのRT-qPCR検査のためのオープンソース自動化を利用した、スケーラブルなSARS-CoV-2診断方法を概説しています。公衆衛生の監視と検査室の能力を向上させることを目指しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 診断
- 公衆衛生
- 分子生物学
背景
- COVID-19パンデミックは迅速かつ効率的な検査方法を必要としました。
- 唾液サンプルは診断のための非侵襲的な代替案を提供します。
- 自動化は検査プロセスを効率化し、処理能力を高めることができます。
- オープンソースのソリューションはコストを削減し、アクセシビリティを向上させることができます。
研究の目的
- 低コストでスケーラブルな唾液ベースのCOVID-19診断テストを開発すること。
- 効率的なサンプル処理のための自動化ワークフローを実装すること。
- 抽出や安定化バッファーを必要とせずに正確な結果を提供すること。
使用された方法
- サンプル処理のためのオープンソース液体処理ロボットの利用。
- RT-qPCRを使用した唾液サンプルの直接検査。
- 安全性と信頼性を確保するためのサンプルの熱処理。
- 効率的なワークフロー管理のための自動化されたデータ記録と分析。
主要な結果
- この方法により、1日に数千回の検査を実施することができます。
- 複雑なサンプル準備なしに正確な診断結果が達成されました。
- 標準曲は信頼性の高い検出能力を示しました。
- 自動化により汚染リスクを最小限に抑え、効率を向上させました。
結論
- このプロトコルは大規模なCOVID-19検査のための実行可能なソリューションを提供します。
- オープンソース自動化は検査室の能力を向上させることができます。
- このアプローチは様々な公衆衛生アプリケーションに適応可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the need for scalable, cost-effective diagnostic solutions in pandemic response by leveraging open-source automation for saliva-based RT-qPCR testing. It enables high-throughput community screening with minimal infrastructure, supporting surveillance programs in academic and public health settings. The approach reduces reliance on complex clinical automation while maintaining diagnostic accuracy for viral load quantification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of viral detection assays through quantitative measurement of SARS-CoV-2 RNA in saliva.
- Operational Value: Supports assay standardization by reducing pre-analytical variability via heat treatment and automated sample handling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reproducible workflow for generating CT values that correlate with viral RNA concentration across a wide dynamic range.
- Operational Value: Enables assay scalability through parallel processing on open-source liquid handling robots, allowing thousands of tests daily with minimal personnel.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates quantitative viral load data useful for correlating with infection status and transmission risk in population studies.
- Operational Value: Produces standardized, contamination-controlled output suitable for longitudinal monitoring and strain analysis via downstream sequencing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-translation continuum by providing a reliable input for epidemiological modeling and therapeutic efficacy assessment in preclinical and clinical studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing regarding viral kinetics and host response through longitudinal saliva sampling.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts enabling compound or intervention effect assessment in antiviral studies.
- Analytics: Outputs CT values and amplification curves that support statistical comparison of viral load across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects discovery-phase detection to preclinical validation by providing clinically relevant viral quantification data.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, open-source automation framework adaptable to other nucleic acid-based assays beyond SARS-CoV-2.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in viral detection through linear standard curves and high correlation between manual and automated methods.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via automated liquid handling and sealed plate processing, minimizing user-dependent variability.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted decision-making in public health programs through rapid (<24h) turnaround and low per-test cost ($2.80).
- Portfolio Impact: Supports prioritization of surveillance initiatives by delivering scalable, accurate incidence data for resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in liquid handling robot programming and RT-qPCR assay design.
- Depends on access to open-source liquid handling platforms, standard thermocyclers, and 3D-printed sample racks.
- Necessitates cross-team protocol standardization for sample tracking, heat treatment, and contamination control.
- Involves adaptation considerations for varying saliva viscosity and sample volume across donor populations.
- Limited by the need for biosafety cabinet use during plate transfer and seal application to prevent aerosol contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Sample Intake, Heat Treatment, and Sample Assignment
1:52
Operating Sample Loading Robots
4:09
Manual Sample Loading
4:52
Addition of Controls to Testing Plates
5:54
Performing RT-qPCR and Determining Plate Validity
7:00
Interpreting Sample Results
8:08
Results: RT-qPCR Detection of N1 (SARS-CoV-2) Synthetic RNA and P1 (Hs_RPP30) Synthetic DNA, Comparison Between Manual and Automated Saliva Transfer N1 Ct Values, and Evaluation of Heat Treatment Methods for Viscosity Reduction in Saliva
10:26
Conclusion
