Name: オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶSARS-CoV-2唾液診断法。オープンソース液体処理ロボットとRT-qPCRを用いて、抽出・安定化バッファーなしで正確な診断結果を得られます。大規模スクリーニングに対応し、毎日数千件の検査が可能です。

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著者らは、SARS-CoV-2検査の実施と管理を支援したREDDI Labのクレムソンの行政、医療スタッフ、臨床検査員に感謝する。サウスカロライナ大学のフィリップ・バックハウツ博士とキャロリン・バニスター博士に、初期のプロジェクトコンサルティングと機器調達に関する業界との連絡に感謝します。多くの学生、教授、スタッフの皆様のサンプル収集のご協力に感謝いたします。クリエイティブ・インクワイアメントの学生に、標準曲線データ収集のご協力をお願いいたします。この研究のための資金は、国立衛生研究所助成金P20GM121342(DDおよびLGPに授与)、クレムソン運動部、クレムソン大学の研究担当副学長、およびサウスカロライナ州知事および共同債券審査委員会から受領されました。

すべての研究は、クレムソン大学およびPrisma Health Institutional Review Boards(Prisma Health IRB # Pro00099491、July 1, 2020)に準拠して実施されました。
1. オープンソースの液体処理ロボットのセットアップ
<ol><li>メーカーの指示に従って、高効率微粒子空気(HEPA)フィルターモジュール( 材料表を参照)を各液体処理ロボットの上部に取り付けます。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、マスターミックスプレート調製ロボットの左マウントに8チャンネルP20ピペットを取り付けます。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、サンプルローディングロボットの右側のマウントにP20ピペットを取り付けます。</li>
	<li>カスタム Python スクリプト (補足ファイル 1 および 補足ファイル 2) を適切なコンピューターにダウンロードします。</li>
	<li>TigerSaliva Full 384 Loading.py をデスクトップアプリケーションで開き、サンプルローディングロボットコンピュータで使用します。「キャリブレーション」をクリックし、ソフトウェアの指示に従ってピペットとプログラムの両方を設定します。</li>
	<li>マスターミックスロボットコンピューターのデスクトップアプリケーションで 12フル Plates.py を開きます。 「キャリブレーション 」をクリックし、ソフトウェアの指示に従ってピペットとプログラムの両方を設定します。</li>
	<li>コンピュータ支援設計(CAD)ファイル(https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363)を使用して、溶融堆積モデリング3次元(3D)プリンタでカスタムサンプルラックを印刷します。サンプルローディングロボットあたり16ラックを印刷し、2セットの8ラックに対して印刷します。</li>
</ol>2. 20倍マルチプレックスN1+P1プローブ/プライマーミックスの調製
<ol><li>合成SARS-CoV-2 RNAまたは患者検体から離れた滅菌環境で、50 mL 円錐管内に 20 x マルチプレックス N1+P1 プローブ/プライマーミックス (総容量 20 mL、 表 1) のバッチを調製します。</li>
	<li>血清学的ピペットを用いて混合物1.6 mLを滅菌2.0 mL遠沈管にアリコートし、適切に標識した。</li>
	<li>アリコートは、使用準備が整うまで-20°Cの冷凍庫に保管してください。</li>
</ol>3. ポジティブコントロールミックスの調製
注: ポジティブコントロールミックスは、プローブ/プライマーミックスまたは他のマスターミックス成分と同じ滅菌環境で作成しないでください。ヌクレアーゼを含まない水の別の容器を使用する必要があります。
<ol><li>990 μLのヌクレアーゼフリー水に10 μLのストック溶液を加えることにより、SARS-CoV-2合成RNA(N1)を1,000,000遺伝子コピー/μL(cpμ)から10,000cpμに希釈する。滅菌 0.2 mL チューブに 10,000 cpμ の 25 μL をアリコートし、適切に標識します。未使用のアリコートを-80°Cで保管してください。 注: 合成 RNA は、分解を防ぐために -80 °C で保存する必要があります。</li>
	<li>Hs_RPP30合成DNA(P1)を950 μLのヌクレアーゼフリー水に50 μLの原液を加えて200,000 cpμから10,000 cpμに希釈する。滅菌 0.2 mL チューブに 10,000 cpμ の 25 μL をアリコートし、適切に標識します。未使用のアリコートを-80°Cで保管してください。</li>
	<li>960 μLのヌクレアーゼ非含有水にSARS-CoV-2ストックとHs_RPP30 10,000 cpμストックの両方を20 μL加え、合計1000 μLにして、各成分を終濃度200 cpμに希釈します。アリコートは、使用できる状態になるまで-80°Cで保管してください。</li>
</ol>4. マスターミックスプレートの作製
注:合成SARS-CoV-2 RNAまたは患者検体から離れた滅菌環境でマスターミックスを作成します。すべての成分は、混合物に添加する前に完全に解凍されなければならない。適切な解凍を行わないと、濃度が正しくない可能性があります。不十分な解凍は、氷の存在または試薬の不均一な色によって示される。混合物を調製しながら冷凍庫ブロックに保管する。
<ol><li>マルチプレックスマスターミックス(総容量48mL、 表2)のバッチを50mL円錐管に調製する。</li>
	<li>チューブを3倍に回して混合物を均質化します。上下にピペッティングしたり、ボルテックスをかけたりして混合すると酵素が損傷するため、混ぜないでください。</li>
	<li>滅菌 96 ウェル深部ウェルリザーバーのカラム 1 ~ 4 を充填するには、1.48 mL のマスターミックスを各ウェルに移します。1つの50mL円錐形が4つのカラムを満たし、12プレートに十分です。</li>
	<li>深い井戸リザーバをホイルシールで覆い、専用のマスターミックス液体処理ロボットに入れます。充填された深井戸リザーバをデッキ10に置き、6つの空の384ウェルプレートをデッキ1〜6に置き、P20チップボックスをデッキ11に配置します。深い井戸プレートとチップボックスを発見し、ロボットを閉じます。</li>
	<li>カスタム Python 操作プロトコルを初期化するには、ロボットデスクトップアプリケーションで [実行の開始] をクリックします。</li>
	<li>40 分後、実行は一時停止します。充填された384ウェルプレートをロボットに保持している間にホイルシールで覆い、ローラーで押し下げて接着性を確保します。各プレートの端にバッチ識別子のラベルを付けます。</li>
	<li>6 つの新しい空の 384 ウェル プレートをデッキ 1 ~ 6 に配置し、[実行の再開] をクリックして操作プロトコル を再開します。ランが完了したら、384ウェルプレートの最終セットをホイルシールで覆います。</li>
	<li>残りのマスターのピペット 2 μL を、バッチ品質管理用の空の 384 ウェルプレートのカラム 1 ~ 3 および 22 ~ 24 に混合します。光学的に透明なシールでシールし、サーモサイクラーで走ります(セクション10.1-10.2)。いずれかのウェルにN1閾値サイクル(Ct)値がある場合、または10を超えるウェルがP1 Ct値を有する場合、バッチは汚染されており、使用できません。</li>
	<li>調製したマスターミックスプレートを4°Cで保管し、調製後7日以内に使用する。</li>
</ol>5. サンプル採取、取水、熱処理
<ol><li>唾液採取の30分前に、食事、飲酒、喫煙、または歯科衛生の実施を避けるよう参加者に指示する。参加者に、口の中に自然に溜まる少なくとも1 mLの唾液を収集し、防腐剤を含まない滅菌50 mL円錐形チューブに堆積させ、チューブにキャップをするように指示する(補足ファイル3)。</li>
	<li>唾液収集チューブの外側を70%エタノールまたは消毒用ワイプで除染し、検査室に移して試験します。</li>
	<li>各サンプルバーコードをスキャンして、毎日の摂取スプレッドシート(補足ファイル4)にサンプルの到着を記録します。</li>
	<li>スキャンしたサンプルを95°Cのオーブンで30分間熱処理します。耐熱手袋を着用したままサンプルを取り出します。 注:未処理のサンプルは、室温(23°C)で最大72時間安定しています。熱処理後、サンプルはすぐに処理されない場合は、4°Cで保存する必要があります。</li>
</ol>6. サンプル割当
<ol><li>サンプルアサインメントステーションのコンピューターで、各サンプルローディングロボット(補足ファイル5)の毎日のサンプルローディングスプレッドシートを開きます。</li>
	<li>サンプル 1 ~ 48 は第 1 四半期、サンプル 49 ~ 96 は第 2 四半期、サンプル 97 ~ 144 は第 3 四半期、サンプル 145 ~ 188 は第 4 四半期と見なされます。サンプルは重複して分析されます。</li>
	<li>プレート名、日付、および四半期番号が記載されたラベルトレイ。サンプルを順番にスキャンして、サンプル読み込みスプレッドシートに入れます。 メモ: 図 3 で定義されているように、以前のプレートからのサンプルは手動で実行する必要があります。手動サンプルの割り当てとロード手順については、セクション 8.1 ~ 8.3 を参照してください。</li>
</ol>7. サンプルローディングロボットの操作
<ol><li>サンプルローディングステーションでは、ロボットのデッキ配置に対応する8つの3Dプリントラックの2つのフルセットを並べます。</li>
	<li>4分の 1 チューブのキャップを外し、ラック 1 の位置 A1 から始めて、3D プリントされたラックに入れます。各ラックを左から右、上から下まで満たします。このロード・パターンをラック 2 で続行してから、ラック 4 および 5 に進みます ( 図 2C を参照)。 メモ: ラックには、ロボットプログラムパラメータの都合上、連続した番号が付けられていません。</li>
	<li>ロードされたクォーター 1 サンプル・ラックをデッキ 1、2、4、5、7、8、10、11 に置きます。P20のヒントをデッキ3と9に置きます。セットアッププロセスを簡素化するには、材料を背面から前面までロボットにロードします。</li>
	<li>4°Cから既製のマスターミックスプレートを取り出し、プレート名でラベルを付け、鋭利な刃を使用してコントロールウェル(N23/24、O23/24、およびP23/24)の周りのホイルの線を切断します。</li>
	<li>マスターミックスプレートをデッキ6に置き、ホイルカバーを剥がして、コントロールウェルを覆う小さな長方形を残します。先端ボックスを発見し、ロボットを閉じます。</li>
	<li>カスタム Python 操作プロトコルを初期化するには、ロボット デスクトップ アプリケーションで [実行の開始] をクリックします。各四半期はプレートに積み込むのに24.5分かかります。タイマーをリマインダーとして設定します。</li>
	<li>ロボットの実行中に、セクション7.2で説明されているように、4分の1サンプルチューブのキャップを外して、3Dプリントされたラックの2番目のセットにロードします。</li>
	<li>ロボットが一時停止したら、第 1 四半期ラックを取り外し、第 2 四半期ラックと交換します。デスクトップ・アプリケーションで 「実行の再開 」をクリックします。</li>
	<li>4分の1サンプルチューブを要約し、結果を待っている間に4°Cの冷蔵庫に保管してください。 この積載プロセスを第 3 四半期と第 4 四半期に繰り返します。</li>
	<li>装填されたプレートをバイオセーフティキャビネットに移す。汚染を最小限に抑えるために、転写中はプレートを覆ったままにしてください。</li>
</ol>8. 手動サンプルローディング
メモ: ロボットの読み込みが不十分な場合は、繰り返しサンプルに対して 1 回の手動実行 (N1 Rerun または Rerun、 図 3 を参照) を実行します。
<ol><li>繰り返しサンプルを収集し、第4四半期の最後のサンプルとして割り当てます(セクション6.2を参照)。サンプルに番号を付け、バーコードをスキャンし、元のサンプルの場所と結果をサンプルローディングスプレッドシートに入力します。</li>
	<li>繰り返しサンプルをバイオセーフティキャビネットに移します。繰り返しサンプルチューブをロボットローディングラックに積み込まないでください。</li>
	<li>各反復サンプルのピペット2 μLをプレートレイアウト図(補足ファイル6)に従って正しいウェルに。患者サンプルを追加するには、指定されたピペットを使用してください。汚染を最小限に抑えるためにサンプルを追加しながら、ホイルで覆われた制御井戸を維持します。</li>
</ol>9. テストプレートへのコントロールの追加
<ol><li>鉗子を使用して制御井戸の上のホイルカバーを剥がします。</li>
	<li>N23-N24ウェルにヌクレアーゼフリー水(テンプレートコントロールなし)2 μLをピペットし、200 cpμ混合ポジティブコントロール(セクション3を参照)の2 μLをウェルO23-O24にピペットします。確認された陽性患者サンプルコントロールのピペット2 μLを、追加のコントロールとしてウェルM23−M24に入れた。ウェルP23-P24を空のままにして、マスターミックスバッチの品質を監視します。</li>
	<li>プレートを光学的に透明なシールで覆い、アプリケーターローラーを使用してすべてのウェルにシールを接着します。プレートを2500rpmで30秒間渦巻き、徹底的に混合します。プレートを500 x g で1分間遠心分離します。</li>
</ol>10. RT-qPCR の実行
<ol><li>サーモサイクラーソフトウェアで、記載された条件に従ってプロトコルプログラムを作成します(表3)。将来のプレートのためにプロトコルを保存します。密閉プレートをサーモサイクラーに置き、プロトコルを実行します。</li>
	<li>Ct 値を .xslx ファイルとしてエクスポートし、その値をサンプル読み込みスプレッドシート (補足ファイル 5) にコピーします。 メモ: これらのシートは、製造元のソフトウェアからの Ct 出力ファイル用にカスタム設計されており、他の形式を受け入れるために変更が必要な場合があります。</li>
</ol>11. プレートの有効性の決定
<ol><li>陽性対照および/または既知の陽性サンプルと陰性対照の両方を検証して、プレートの結果を有効と見なします。以下の基準で対照ウェルを評価した。<ol>
<li>陽性コントロールの場合は、少なくとも1つのポジティブコントロールウェル(O23/O24)がP1プローブとN1プローブの両方で22〜28のCt値を生成するかどうかを確認します。あるいは、既知の陽性サンプルウェル(M23/M24)は、P1およびN1プローブでP1およびN1 Ct値<33を生成します。</li>
		<li>陰性対照の場合、2つの陰性対照ウェル(N23/N24)のいずれにもN1またはP1 Ct値がないことを確認してください。プレートを無効にする前に、Ct値に有効な増幅曲線があることを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. サンプル結果の解釈
<ol><li>図(図3)に従って患者の結果を決定し、解決されたサンプルを報告します。<ol>
<li>P1 の結果を VALID または INVALID として評価します。P1 が Ct <33 の結果を生成する場合、ウェルは VALID と考え、N1 の結果に進みます。P1 が Ct >=33 の結果を生成する場合、または Ct 値がない場合、ウェルは無効であると考えてください。<ol>
<li>N1 の結果を YES、NO、または NO* として評価します。N1 が Ct <33 の結果を生成する場合、ウェルは YES です。N1 が Ct 値を生成しない場合、ウェルは NO です。N1 が Ct >=33 を生成する場合、ウェルは NO* です。すべてのN1 Ct値が実際の増幅曲線に関連付けられていることを確認します。N1 の Ct 値に増幅曲線がない場合、ウェルは NO です。</li>
			<li>繰り返しサンプルを識別し(N1再実行または再実行)、内部サンプル番号とサンプルタイプでラベルを付け、ローディングワークフローに返します(セクション8.1-8.3)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. 研究室の清掃
<ol><li>リキッドハンドリングロボット<ol>
<li>中級レベルの消毒剤ですべての側面を清掃します。エタノールはプラスチックを劣化させるので使用しないでください。</li>
		<li>ピペットチップの端とごみ箱をアルコール(70%エタノールまたは100%イソプロパノール)で優しく拭き取ります。キーボードとマウスを拭き取ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バイオセーフティキャビネット<ol>
<li>中級レベルの消毒剤ですべての表面を清掃します。UVライトを15分間オンにします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者らは開示するものは何もありません。プロトコールに記載されているアッセイは、イェール大学公衆衛生大学院が提出したSalivaDirect EUAに該当します。

プロトコールに記載されたアッセイを、独立した検証研究によって評価した。同時に採取した対になった上咽頭綿棒に対して評価した場合、アッセイは98.9%の特異性(1.1%偽陽性)および90.0%の感度(10.0%偽陰性)を有することが判明した(n = 837;817陰性、20陽性)。重要なことに、TigerSalivaで陽性、鼻咽頭スワブで陰性であった3人の参加者が、48時間後に綿棒で再検査され、陽性の結果が返され、TigerSalivaが病気の経過の早い段階でSARS-CoV-2感染を検出できる可能性があることが示された。
我々は、既知の濃度のSARS-CoV-2合成RNAでウイルスフリーの唾液(熱処理および非熱処理の両方)をスパイクすることによって陽性の唾液サンプルをシミュレートし、10倍希釈を行って唾液中のCt限界を決定した。N1遺伝子は、シミュレートされた陽性サンプルにおいて10,000遺伝子コピー(約Ct=28)未満では検出できなかった。これはRNaseの分解やその他の交絡因子によるものと思われます。しかし、唾液RNaseと裸の合成RNAとの相互作用は、熱によって変性した後でも、ウイルス粒子との相互作用とは異なる可能性が高い。陽性の唾液サンプルはCt>30で同定されており、外部ラボはこれらのサンプルからSARS-CoV-2遺伝子配列データを取得しました。我々は、ウイルスタンパク質が患者の唾液サンプル中のRNA分解からの保護を提供すると推測している。
プロトコルの最も重要なステップは、マスターミックス調製と唾液サンプル処理(それぞれセクション4と7)の自動化の実装です。これにより、タスクプロセスが重複し、ターンアラウンドタイムが大幅に短縮されます。もう一つの重要なステップは、臨床結果の解釈である(セクション11および12)。中間結果カテゴリ (再実行および N1 再実行) を確立することで、決定的でないテスト結果の発生も最小限に抑えられました。
我々は、手動と自動の唾液サンプルローディング方法のばらつきはごくわずかであり(図5A)、自動化がSARS-CoV-2検出の再現性を向上させる可能性があることを実証しました(図5B)。臨床ラボの設計と拡張時にテストを容易にするために、自動化が優先されるべきです25。ラボのワークフローは、ロボットによる自動タスクの実装により改善されました26。リキッドハンドリングロボットのオープンソース機能により、プロトコル設計のためのカスタムスクリプトの実装が可能になります。これにより、液体処理ロボットは、従来の臨床自動化方法と比較して安価で高度に変更可能なシステムになります。また、反復性の高いラボタスクを実行するための理想的な戦略です。システムの高度なカスタマイズ性は、不足した場合にラボウェア(収集チューブ、ピペットチップ、384ウェルプレートなど)を自由に変更できることを意味します。したがって、液体処理ロボットを使用した自動化は、大規模および小規模の両方の監視および研究に実行可能です。
この検査戦略の主な利点は、他の臨床ラボと比較してターンアラウンドタイムがはるかに短いことです。自動液体処理ロボットの利用は、ターンアラウンドタイムの短縮に重要な役割を果たしますが、ロボットとサーモサイクラーの同時使用もテスト効率を最大化するのに役立ちます。1台のロボットとサーモサイクラーをペアで操作し、両方の機械を並行して使用して、中断のないサンプルローディングとサンプル結果分析を行う必要があります。割り当てられたサンプルの安定した流れが確立されると、すべての機械ペアを同時に操作できます。ロボットとサーモサイクラーを常時同時に使用すると、テスト能力と効率が大幅に向上し、大量のテストに対応するために不可欠です。
他の確立されたSARS-CoV-2 RT-qPCRプロトコルとは対照的に、サーモサイクラープロトコルにタッチダウンステップを組み込んで、標的遺伝子へのプローブとプライマーセットのアニーリングを改善し27、増幅失敗のリスクを低減しました。結果は、タッチダウンが特異的プライマー結合の喪失を危険にさらすことなく陽性サンプルの検出を改善したことを実証した(表 4)。我々は、広範囲のSARS-CoV-2 RNAコピー(図4A)とHs_RPP30 DNAコピー(図4B)の両方をRT-qPCRアッセイによって同時に検出できることを決定しました。
液体処理ロボットの限界の1つは、唾液移送中に陽性サンプルからの交差汚染の可能性です。唾液は粘弾性流体28であり、ピペットチップから分配された後、隣接するウェルを横切ってひもでつながれてもよい。さらに、唾液29の不均一性は、サンプル全体にわたるウイルス粒子の不均一な分布を引き起こし得る。これにより、偽陽性と陰性の両方が発生する可能性が高くなり、N1 再実行サンプルと再実行サンプルの指定が必要になります。しかし、最初にN1 Rerunとして指定されたサンプルの14.1%がSARS-CoV-2に対して陽性と判定され、Rerunサンプルよりも再検査後に陽性として解決する可能性が30倍以上高かった。その結果、RerunとN1 Rerunを区別することで(図3)、潜在的に陽性のサンプルをより正確に分離することができ、診断アッセイの感度と特異性が向上しました。診断唾液検査のための他の結果パラメータは、この区別をしなかった12,14,24,30,31。
唾液検体は、不均一性と粘度のためにピペットを流すのが難しい場合があります32。熱処理は、唾液バイオマトリックス中のタンパク質を適切に変性させ、粘度を低下させ、パンデミックの初期には不足していたRNA抽出試薬9の必要性を排除します10。延長熱処理はまた、現在のウイルスを不活性化し33、より低いバイオセーフティレベルでの実験室処理を可能にする。その結果、タンパク質の変性によって粘度を低下させるために、熱ベースのRNA抽出(セクション5.4で説明)が実施されました(図6)。この結果に基づいて、我々は、熱処理がタンパク質バイオマトリックスを変性させることに加えて、唾液サンプルを均質化する可能性があると仮定する。他のグループは、均質性を高めるために熱処理とプロテイナーゼK処理を組み合わせ9、14、34。ウイルスRNAを熱分解にさらす速度でビリオンタンパク質を変性させる可能性があるため、このステップを実施しないことを選択しました35。さらに、プロテイナーゼKによるサンプル希釈は、より少ないウイルス粒子を含む陽性サンプルをマスクし、したがって感度を低下させる可能性がある。さらに、アッセイ結果を、磁気ビーズRNA抽出を使用する市販の唾液ベースのSARS-CoV-2アッセイ(Logix Smart COVID-19)と比較した(表5)。現在のアッセイは、市販のアッセイと比較して、弱い陽性サンプルを検出するのにより適していることがわかりました。
qPCRは半定量的であるため、RT-qPCRのみを用いて唾液中のウイルスコピー数を定量することは困難である。Ct値の間には、技術的な制限に起因する固有のばらつきがあります。遺伝子コピー数は、Ct値(図4)から求めることができ、ウイルスコピー数とほぼ同等である。唾液サンプル中のウイルスコピー数を決定するための1つの可能な解決策はddPCRであり、これは反応中の遺伝子コピーの定量化を困難にする。しかし、臨床医に定性的な結果を提供することは適切であり、相対的なウイルス含有量は、当社の方法で処理されたサンプル間で比較することができると考えています。
唾液を使用する場合に生じるいくつかの制限にもかかわらず、唾液ベースのRT-qPCRによるSARS-CoV-2アッセイは、あらゆる規模の試験で迅速かつ信頼性の高いウイルスRNA検出のための効果的な方法であることが証明されています。これは、オープンソースの液体処理システムの利用と組み合わせると特に当てはまります。この検査アプローチは、感染症原体、疾患マーカー、または他のウイルスなど、診断に関連する他の核酸配列を検出するように変更することができる。これにより、アッセイは臨床および研究の両方の診断努力に適用可能になります。

新型コロナウイルスである重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)は、2019年後半に出現し、世界人口全体に急速に広がりました1。SARS-CoV-2感染は、潜在的に重度の呼吸器および炎症症状を伴う伝染性の高い疾患であるコロナウイルス病2019(COVID-19)を引き起こす。高い伝染性と低い死亡率は、ウイルスが集団を通じて急速に広がり、診断検査の増加が必要であることを示しました2,3。公衆衛生上の勧告は、症例を隔離し、その後感染率を低下させるための大規模な集団スクリーニングを奨励した4,5,6。さらに、集団サーベイランスのモデルから、検査頻度の増加と報告時間の短縮は、検査感度の向上よりも感染伝播の減少に大きな効果があることが明らかになりました7。これは、感染者が早期に隔離され、感染の連鎖が断ち切られる可能性があるためです。
元の核酸増幅試験(NAAT)標準は、RT-qPCR8によって処理された鼻咽頭(NP)綿棒であった。しかし、この形態の検査では、相対コストの増加やサプライチェーンの圧力の悪化など、非常に大規模な集団に対するこの形式の検査で複雑さが生じます9,10。さらに、一般的なNAAT法(NPスワブ、中咽頭スワブ、中甲介スワブ、および鼻スワブを含む)の検体収集と処理の両方が、特殊な機器、試薬、および医療従事者に依存しています9,10。
NPスワブRT-qPCR検査の適切な代替品は、SARS-CoV-2検出のための正確な診断ツールである唾液ベースの検査です11,12,13,14。唾液サンプルに対してRT-qPCRを直接実行すると、NPスワブと同様の感度と特異性が得られます15。唾液検査がNP綿棒検査よりも優れている大きな利点の1つは、検体の自己収集を可能にすることです16。これにより、医療従事者の必要性が最小限に抑えられ、NP綿棒よりも侵襲性が低いため、患者のサンプル収集の容易さが最大化されます。さらに、唾液サンプルは綿棒からサンプルを除去するために緩衝液を必要としないため(NPサンプルの場合のように)、唾液ベースの検査では熱ベースのリボ核酸(RNA)抽出を直接利用することができ、追加のバッファー、輸送媒体、および/またはRNA抽出試薬の必要性を排除することで検査コストを削減できます14,17。
クレムソン大学の疾患診断と介入の研究と教育(REDDI)ラボは、COVID-19の検査とサーベイランスに対する大学のニーズに対処するために設立されました。大学を含む閉鎖的な集団では、頻繁なサーベイランス検査と社会的距離が相まって、疾患罹患率の疫学的モデルにおいて最も好ましい結果がもたらされました18。統合されたCDC 2019-nCOV RT-qPCR19およびSalivaDirect14プロトコルが適応され、自動化が臨床ワークフローで利用され、コストを削減し、ターンアラウンドタイムを改善しました。これまでのグループは、SARS-CoV-2 RNA抽出ステップ20,21にオープンソースの液体処理ロボットを使用していましたが、テストプレートの作製と試料のロードにロボットを最大限に活用しました22。ここでは、適応されたプロトコルとオープンソースの液体処理システム(図1)の利用により、迅速かつ正確な唾液ベースのRT-qPCRが可能になり、大規模な公衆衛生サーベイランスに効果的な戦略であることを示しています。

<table><tbody><tr><td>100% EtOH</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>20 uL フィルター付きピペットチップ</td><td>Opentrons</td><td>20uL チップ</td><td></td></tr><tr><td>2mL マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-666-313</td><td>代替製品を使用できます</td></tr><tr><td>アルマジロ PCR プレート、384ウェル、クリア、ホワイトウェル</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>AB3384</td><td>代替製品を使用できます</td></tr><tr><td>セルトリート2mL 96ディープウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-828-743</td><td>マスターミックス調製用</td></tr><tr><td>クリアPCRシーリングシート</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td>代替製品を使用できます</td></tr><tr><td>DPEC処理水</td><td>アンビオン(Thermo Scientific)</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>フリップキャップ 50 mL コニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>75845-210</td><td>サンプル収集用</td></tr><tr><td>ホイルPCRシーリングシート</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0626</td><td>マスターミックスプレートの保管には、代替製品を合成</td></tr><tr><td>DNA HS_RPP30</td>使用できます <td>統合DNAテクノロジー</td><td>299788131</td><td>P1ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction New</td><td>England Biolabs</td><td>M3006B</td><td></td></tr><tr><td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M3002B</td><td></td></tr><tr><td>nCOV_N1 Forward Primer、100 nmol</td><td>統合DNA技術</td><td>10006830</td><td></td></tr><tr><td>nCOV_N1プローブ アリコート、50 nmol</td><td>統合DNA技術</td><td>10006832</td><td>プローブは、SYBRまたはFAMフルオフォア</td></tr><tr><td>nCOV_N1リバースプライマー、100 nmol</td><td>統合DNA技術</td><td>10006831</td><td></td></tr><tr><td>Opentron HEPAフィルターモジュール</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>必須ではありませんが、削減するのに便利です。汚染</td></tr><tr><td>Opentron マルチチャンネルアタッチメント、P20</td><td>Opentrons</td><td>999-00005</td><td>マスターミックス調製用</td></tr><tr><td>Opentron OT-2 リキッドハンドリングロボット</td><td>Opentrons</td><td>OT-2</td><td></td></tr><tr><td>Opentron ピペットアタッチメント、P20</td><td>Opentrons</td><td>999-0000215</td><td>サンプルローディング用</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>Memmert</td><td>UF450 PLUS 208V-3PH</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブ (rnase, dnase フリー)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-230-225</td><td>ポジティブコントロールおよびネガコントロールのアリコート用</td></tr><tr><td>PolarSafe アルミニウム冷却ブロック、15 ウェル (1.5/2.0 mL チューブ)</td> <td>VWR</td><td>10808-952</td><td></td></tr><tr><td>PolarSaf アルミニウム冷却ブロック、24 ウェル (0.5 mL チューブ)</td> <td>VWR</td><td>10808-956</td><td></td></tr><tr><td>RNAse P (ATTO 647) プローブ、50 nmol</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td>10007062</td><td>プローブは、Cy5 を使用して他のベンダーによって合成できます蛍光色素</td></tr><tr><td>RNAse P フォワードプライマー、100nmol</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>10006836</td><td></td></tr><tr><td>RNAse P リバースプライマー、100 nmol</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>10006837</td><td></td></tr><tr><td>Sars-CoV-2 合成 RNA コントロール 2</td><td>ツイストバイオサイエンス</td><td>102024 / 103907 / 103909</td><td>N1 ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>スキャナー</td><td>コード</td><td>CR1500</td><td>スケールアップ時にのみ必要</td></tr><tr><td>小型HEPAフィルター付きフード</td><td>Erlab</td><td>Captair Bio 321</td><td>マスターミックス調製用</td></tr><tr><td>サーモサイクラー CFX384 タッチ</td><td>バイオラッド</td><td>CFX384 タッチ</td><td>代替モデル、例えばCFX384 Opus</td></tr><tr><td>X-acto ナイフセット</td><td>ステープル</td><td>ズ N/A</td><td>コントロールウェルを覆うための箔をカットする</td></tr></tbody></table>

オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なsars-cov-2定量逆転写酵素pcr唾液診断戦略

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

最近のSARS-CoV-2グローバルヘルス危機の出現は、疫学研究と臨床試験に重要な課題をもたらしました。COVID-19のパンデミックは、高い感染率と低い死亡率を特徴とする、特に住宅大学などの閉鎖的な集団において、正確で効率的な診断検査を必要としました。上咽頭スワブのような核酸検査の初期の利用可能性は、サプライチェーンの圧力のために制限され、検査結果の報告も遅れました。唾液ベースの逆転写酵素定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)試験は、感度および特異性において他の試験方法に匹敵することが示されており、唾液採取は参加者に対する物理的侵襲性が低い。その結果、クレムソン大学とその周辺コミュニティの集団サーベイランスのためのマルチプレックスRT-qPCR診断アッセイを開発しました。このアッセイでは、複雑な臨床自動化システムの代わりにオープンソースの液体処理ロボットとサーモサイクラーを使用して、ワークフローとシステムの柔軟性を最適化しました。唾液ベースのRT-qPCRの自動化により、大規模および小規模の両方の試験要求に対して、幅広いウイルスRNA濃度を迅速かつ正確に検出できます。自動システムの平均ターンアラウンドは、サンプルの95%で9時間<、サンプルの99%で24時間<でした。1回の試験のコストは、すべての試薬を一括購入した場合、2.80ドルでした。

このプロトコルは、オープンソースの自動化を利用して唾液サンプルのRT-qPCR分子検査を実行するSARS-CoV-2診断方法を記述しています。このスケーラブルなアプローチは、臨床公衆衛生サーベイランスや小規模な大学研究所の能力向上にも適用できます。

オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

低コストの唾液ベースのCOVID 19診断テストとワークフローを開発し、大規模なコミュニティスクリーニングアプリケーション向けに実装とスケールアップが容易です。ここでは、オープンソースの液体処理ロボット、標準サーモサイクラー、ソフトウェアを使用して、抽出バッファーや安定化バッファーを使用せずに唾液の直接テストを実行しながら、正確な診断結果を提供します。シンプルな自動化された並列ワークフローにより、システムをスケールアップして、最小限の機器、スペース、人員要件で毎日何千ものテストを実行できます。カイリーキングに加えて、レイチェルハム、私たちの臨床検査スーパーバイザーとオースティンSmothers私たちの教育コーディネーターは、手順を実証するのに役立ちます唾液収集チューブの外側を70%エタノールで除染し、テストのためにそれらを実験室に移すことから始めます。各サンプルバーコードをスキャンして、毎日の摂取量スプレッドシートにサンプルの到着を記録します。スキャンサンプルを摂氏95度のオーブンで30分間熱処理し、耐熱性手袋を使用してサンプルを取り出します。サンプルアサインメントステーションで各サンプルローディングロボットの毎日のサンプルローディングスプレッドシートを開きます。次に、各384ウェルプレートに188サンプルを割り当てます。プレート名、日付、四半期番号が記載されたラベルトレイ。サンプルを順番にスキャンして、サンプル読み込みスプレッドシートに入れます。サンプルローディングステーションでは、ロボットのデッキ配置に対応する8つの3Dプリントラックの2つのフルセットを並べます。チューブのキャップを外し、ラック 1 の位置 A1 から始めて、3D プリントされたラックに入れます。各ラックを左から右、上から下まで満たします。このロード・パターンをラック 2 で続行してから、ラック 4 および 5 に進みます。ロードされた 4 分の 1 サンプル・ラックをデッキ 1、2、4、5、7、8、10、11 に置きます。P20のヒントをデッキ3と9に配置します。セットアッププロセスを簡素化するために、材料をロボットに背面から前面にロードします。マスターミックスプレートは専用のロボットで製造され、摂氏4度で保存されます。一度に1枚のプレートが使用され、プレート名でラベル付けされ、鋭利な刃を使用して、コントロールウェルの周りのホイル内の線を切断する。マスターミックスプレートをデッキ6に置き、ホイルカバーを剥がして、コントロールウェルを覆う小さな長方形を残します。先端ボックスを発見し、ロボットを閉じます。カスタム Python 操作プロトコルを初期化するには、ロボット デスクトップ アプリケーションの実行の開始をクリックします。各四半期は、プレートにロードするのに24.5分かかります。タイマーをリマインダーとして設定します。ロボットが動作している間に、キャップを外し、2分の1のサンプルチューブを3Dプリントされたラックの2番目のセットにロードします。ロボットが一時停止したら、4 分の 1 ラックを取り外して 4 分の 2 ラックと交換し、デスクトップ アプリケーションで [実行の再開] をクリックします。4分の1のサンプルチューブを要約し、結果を待っている間に摂氏4度の冷蔵庫に保管します。この積載プロセスを 4 分の 3 と 4 に繰り返します。装填されたプレートをバイオ安全キャビネットに移します。汚染を最小限に抑えるために、転送中はプレートを覆ったままにしてください。繰り返しサンプルを収集し、第4四半期の最後のサンプルとして割り当てます。サンプルに番号を付け、バーコードをスキャンし、元のサンプルの場所と結果をサンプルローディングスプレッドシートに入力します。繰り返しサンプルをバイオ安全キャビネットに移します。繰り返しサンプルチューブをロボットローディングラックにロードしないでください。各繰り返しサンプルの2マイクロリットルのピペットを正しいウェルに。指定されたピペットを使用して、患者サンプルを追加します。汚染を最小限に抑えるためにサンプルを追加しながら、制御井戸をホイルで覆ったままにしておきます。鉗子を使用して制御井戸の上のホイルカバーを剥がします。確認された陽性患者サンプルの2マイクロリットルをウェルM23およびM24にピペットで打ち込む。ウェルN23〜N24に2マイクロリットルのヌクレアーゼ自由水をピペットし、ウェルO23〜O24にマイクロリットル当たり200コピーの2マイクロリットルを混合した陽性対照。ウェル P23 ~ P24 を空のままにしておくと、マスターミックスバッチの品質が監視されます。プレートを光学的に透明なシールで覆い、アプリケーターローラーを使用してすべてのウェルにシールを接着します。プレートを2, 500 RPMで30秒間渦巻きにして十分に混合し、次にプレートを500倍Gで1分間遠心分離します。サーモサイクラーソフトウェアでプロトコルプログラムを選択し、将来のプレート用にプロトコルを保存します。密閉プレートをサーモサイクラーに置き、プロトコルを実行します。CT 値をエクスポートし、サンプル読み込みスプレッドシートに値をコピーします。陽性コントロールの場合は、少なくとも 1 つの陽性コントロールが P1 プローブと N1 プローブの両方で 22 ~ 28 の CT 値を生成するかどうかを確認します。あるいは、既知の陽性サンプルウェルは、P1およびN1プローブ上で33未満のP1およびN1CT値を産生する。陰性対照の場合、2つの陰性対照ウェルのいずれにもN1またはP1 CT値がないことを確認します。プレートを無効にする前に、CT値に有効な増幅曲線があることを確認してください。P1が33未満のCTの結果を生成する場合、井戸も有効であると考え、N1からの結果に進む。P1 が 33 より大きいか等しいか、または CT 値のない CT の結果を生成する場合、well は無効であると見なします。N1が33未満のCTの結果を生じる場合、その井戸をyesと評価する。N1がCT値を生じない場合、無いとしても評価する。N1 が 33 以上の CT 値を生成する場合は、ウェルに星がないと評価します。すべてのN1 CT値が実際の増幅曲線に関連付けられていることを確認します。N1のCT値に増幅曲線がない場合、ウェルはいいえです。繰り返しサンプルを特定し、内部サンプル番号とサンプルタイプでラベルを付け、ローディングワークフローに戻します。代表的な画像は、N1またはSARS CoV−2合成RNAおよびP1またはHSRPP30合成DNAのRTQ PCR検出を示す。標準曲線を標準偏差でプロットし、このプローブプライマーの組み合わせを用いて正確な検出の範囲を決定した。それぞれの希釈液で得られた平均CT値を、合成RNAおよび合成DNAの推定量に対してプロットした。どちらの場合も、線形曲線は、広範囲の遺伝子コピー濃度にわたって良好な相関係数を示した。ロボットと手動サンプルローディングの両方を使用して一意のサンプルから得られたN1 CT値を転置して、手動ローディングとロボットローディングの間のアッセイ間変動性を決定しました。手動法と自動法の間の線形関係は、両方の方法が機能的に同等であることを示す高い相関係数を生成した。アッセイ内変動性は、ロボットおよび手動サンプルローディングの両方から得られた転置複製N1 CT値を用いても決定した。唾液の粘度低下に対する熱処理方法の評価をここに示す。SARS CoV-2陰性唾液を単一の供給源から採取し、アリコートを摂氏95度で0分、30分または60分間熱処理した。各条件の技術的反復からP1 CT値をプロットし、処置方法間の変動性を決定した。30分および60分の熱処理方法はどちらも、処理対照なしと比較してサンプル変動性を有意に減少させた。30分と60分の治療の間に有意差はなかった。そこで30分間熱処理法を実施し、処理時間を短縮した。適切な無菌技術を使用して、特に手動サンプルやコントロールをロードする場合は、テストプレートの汚染を最小限に抑えます。手や袖で皿を横切らないでください。臨床結果が得られたら、サンプルをバイオハザード廃棄物に処分するか、特定の株を決定するための全ゲノムシーケンシングなどのさらなる分析のために保存することができます。この手法により、広範なコミュニティテストが可能になり、テストカバレッジの影響とCovid 19の無症状の広がりを調査できます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

TruTipは、多孔質モノリシック結合マトリックスがピペットチップ内に挿入される単純な核酸抽出技術である。これにより、試料調製フォーマットは、ほとんどの液体ハンドリング機器と互換性があり、高スループットの臨床応用およびサンプルタイプに多くの媒体を用いることができる。...

共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出

この作業では、2色ddPCRシステムを使用したSARS-CoV-2検出のためのさまざまなアッセイを開発する手順を要約しています。手順は精巧であり、アッセイと実験のパフォーマンスを改善する方法に関するメモが含まれています。これらのアッセイは、複数のSARS-CoV-2...

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市民科学プロジェクトは、SARS-CoV-2の環境サンプルを収集するためにサンディエゴの住民を募集するように設計されました。多言語 Web ベースのプラットフォームは、使いやすいモバイル デバイス...

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廃水および大気サンプル中のSARS-CoV-2 RNAの定量と全ゲノム特性評価

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逆転写ループを介した等温増幅によるSARS-CoV-2ウイルスの検出

一般的な呼吸器系ウイルス用の2つのプローブベースのワンステップRT-qPCRキットを紹介します。最初のアッセイは、SARS-CoV-2(N)、インフルエンザA(H1N1およびH3N2)、およびインフルエンザBに対するものです。2つ目は、SARS-Cov-2(N)とMERS(UpEとORF1a)です。これらのアッセイは、あらゆる専門ラボでうまく実施できます。...

SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoVを検出するためのマルチプレックスリアルタイムRT-qPCRアッセイの開発

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HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

ここでは、実証の原則二価のアデノウイルス5型（Ad5）ベクトルを生成するためのプロトコルを提示するAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6抗原キャプシド取り込み戦略を利用することによって。このベクターは、定性的フィットネス、Ad5の陽性in vitroでの血清、および抗原性ならびに組み込まれた抗原に対する免疫原性を脱出する能力を示すことが実証されました。...

アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

ここでは、馬の呼吸液中のEHV-2 DNAの検出と定量に使用される定量的PCR法の開発と検証のためのプロトコールを紹介します。EHV-2...

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

ナノスケールPCRによってDNA及びRNAベースの病原体のハイスループット試験は、症候性イヌおよびウマの呼吸PCRパネルを用いて説明します。...

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

学ぶSARS-CoV-2唾液診断法。オープンソース液体処理ロボットとRT-qPCRを用いて、抽出・安定化バッファーなしで正確な診断結果を得られます。大規模スクリーニングに対応し、毎日数千件の検査が可能です。

オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略

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