Name: 単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぼう マウス交感神経節の単一核RNAシーケンシング法。バーコード化抗体による低入力核単離と多重化技術を用いて、心臓交感神経細胞の生物学的構造を解析する方法です。

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Susan L. Kloet(オランダ、ライデン、LUMC、人間遺伝学部)の実験設計と有益な議論への彼女の助けに感謝します。我々は、Emile J. de Meijer(オランダ、ライデン、LUMC、ヒト遺伝学部)に対し、単一核RNA単離およびシーケンシングのためのライブラリー調製の支援に感謝する。この研究はオランダ科学研究機構(NWO)[016.196.346 to M.R.M.J.]の支援を受けています。

このプロトコルは、マウス子宮頸部および/または子宮頸部胸部(星状)神経節のsnRNA-seqに必要なすべてのステップを記述する。雌雄のC57BL/6Jマウス(15週齢、性別毎にn=2)を用いた。さらに1匹のWnt1-Cre;mT/mGマウスを用いて、解剖目的で神経節を視覚化した17,18。この追加のマウスは、B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/JマウスとB6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/Jマウスの交配によって生成されました。すべての動物実験は、NIHが発行し、ライデン大学の動物倫理委員会によって承認された実験動物の世話と使用のためのガイド(ライセンス番号AVD1160020185325、ライデン、オランダ)に従って実施されました。プロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、および動物の詳細については、材料表を参照してください。
1. 準備
メモ: すべての手順は、細胞培養フローキャビネットで実行されます。
<ol><li>鉗子とはさみを70%エタノールに20分間浸してきれいにします。</li>
	<li>B-27プラス(1x)、L-グルタミン(2mM)、および1%抗生物質-抗真菌剤を添加した神経基礎培地からなる神経節培地を調製する。神経節培地を室温で予温する。</li>
	<li>消化液を調製する:0.25%トリプシン-EDTA(1:1)および1,400U/mLコラゲナーゼ2型を神経節培地に溶解した。</li>
	<li>核単離のために、新鮮で冷たい(4°C)細胞洗浄緩衝液(0.4%ウシ血清アルブミン[BSA])および溶解緩衝液(10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mMMgCl2、および0.1%ノニオン界面活性剤、ヌクレアーゼフリー水中の40U/mL RNAse)を調製する。</li>
	<li>核洗浄バッファー(2.0% BSAおよび0.2U/μL RNase Inhibitorを含む1xリン酸緩衝生理食塩水[PBS])を調製します。</li>
	<li>ST染色バッファー(ST-SB)(ヌクレアーゼフリー水で10 mM Tris-HCl、146 mM NaCl、21 mM MgCl 2、1 mM CaCl2、2% BSA、0.02% Tween-20)を調製する。</li>
</ol>2. 成体マウス上頸部神経節(SCG)の解剖
<ol><li>マウスを安楽死させ、氷の上に保ちます。 注:現在の研究では、合計4匹のC57BL6/JマウスがCO2 窒息によって安楽死させられた。あるいは、イソフルランは、他の研究目的のために大量の血液を採取する必要がある場合に、放血に続いて使用することができる。</li>
	<li>マウスをピンで解剖ボードに固定し、毛皮の分散を最小限に抑えるために70%エタノールで使用してください(シェービングは必要ありません)。</li>
	<li>実体顕微鏡下で、はさみで正中線を切って頸部領域の皮膚を開き、顎下腺を脇に動かし、胸骨筋を除去して総頸動脈とその分岐部を露出させ、位置を特定する(図1A、B、矢印参照)。</li>
	<li>左右の頸動脈分岐部とそれに付着した組織を解剖する。各解剖した組織片を、冷たいPBSを含む別々の3.5cmのペトリ皿に移す。</li>
	<li>頸動脈分岐部に取り付けられているSCGを探します。シャーレ内の動脈および他の付着組織を除去することによって、SCGをさらに洗浄する(図1E)。</li>
</ol>3. 成体マウス星状神経節(StG)の解剖
<ol><li>StGを解剖するには、腹部に正中線を切断し、続いて横隔膜と腹側胸壁を開きます。</li>
	<li>心臓と肺を取り除き、背側胸郭を露出させます。第1の肋骨のレベルで筋大腸ロンガス(MCL)の前外側の左右のStGを探します(図1C、D、破線で示されています)。</li>
	<li>左右両方のStGを鉗子で解剖し、冷たいPBSを含む3.5cmのペトリ皿に別々に移します(図1F)。 ​</li>
</ol>4. マウス神経節細胞の単離と凍結保存
ステップ 4 ~ 6 を図 2 にまとめます。
<ol><li>個々のSCGおよびStGをすべて慎重に移し、鉗子で1.5mLの微量遠心チューブを分離します。 注:神経節はプラスチック製のピペットチップの壁に付着しやすいため、ピペットチップを使用しないでください。</li>
	<li>各微量遠心チューブに500 μLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を加え、37°Cの振とう水浴中で40分間インキュベートする。 注:この工程は、コラゲナーゼ2型溶液中でのその後の消化および細胞放出を促進することを目的としている。</li>
	<li>各サンプルについて5 mLの神経節培地を含む15 mLチューブを調製する。神経節が微量遠心チューブの底に落ち着くのを許します。神経節細胞をほとんど含まない上清を収集し、その上清を調製した15mLチューブに移し、各チューブに標識する。あるいは、ある程度の時間を節約するために、解離した細胞がごくわずかしか検出できないように、トリプシン-EDTA上清を収集せずに吸引する。 注:少量のトリプシン-EDTA溶液(〜10〜30μL)を微量遠心チューブに残して、神経節の除去を避けることができます。このステップでのピペッティングは、神経節を損傷し、その後の神経節細胞の低出力につながる可能性があるため、避けてください。</li>
	<li>各微量遠心チューブに500μLのコラゲナーゼ2型溶液を加え、37°Cの振とう水浴中で35〜40分間インキュベートする。35分後に神経節を再中断してみてください。神経節がまだ無傷であり、解離しない場合は、インキュベーション時間を延長するか、必要に応じてコラゲナーゼ2型溶液の濃度を増加させる。 注:孵化時間は神経節の大きさによって異なる場合があります。</li>
	<li>コラゲナーゼ溶液に神経節を再懸濁するには、上下にピペッティングするか、組織凝集塊が検出されなくなるまでピペッティングします。</li>
	<li>細胞懸濁液を、同じ神経節からの神経節培養培地およびトリプシン−EDTA懸濁液を含む以前に使用した15mLチューブに移す。細胞懸濁液をスイングバケットローター遠心分離機で10分間スピンダウンし、室温で300× g である。細胞上清を慎重に廃棄する。 注:神経節細胞は単一の神経節から解離しているため、細胞ペレットは小さすぎて目で検出できないことがあります。少量の上清をチューブ内に残して、細胞ペレットの偶発的な除去を避けることができます。</li>
	<li>神経節細胞を270 μLのウシ胎児血清(FBS、低エンドトキシン)に再懸濁し、各細胞-FBS懸濁液を1mLのクライオビアルに移す。</li>
	<li>細胞を計数するには、5 μLの神経節細胞懸濁液を5 μLの0.4%トリパンブルー色素と混合し、混合物を血球計数器にロードする。顕微鏡下で総細胞数と生細胞数をカウントする。 注:この解離プロトコルでは、細胞生存率(生細胞数/総細胞数=生存率%)は通常90%を超えています。単一の神経節(SCGまたはStGのいずれか)の生細胞数は、神経節が12〜16週齢のマウスから単離された場合、通常9,000〜60,000細胞の範囲内に収まる。</li>
	<li>クライオバイアル中の各細胞-FBS懸濁液に30μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加え、よく混合し、クライオバイアルを室温に保たれた細胞凍結容器に移す。クライオビア装填容器を-80°Cで一晩保存し、翌日にクライオビアを液体窒素に移し、シークエンシング前に長時間保存した。</li>
</ol>5. 核の分離
注:4匹のマウスから単離した左右のSCG(計8サンプル)を、以下の核単離およびシークエンシング調製において例として使用した。手順全体を通してすべてを氷の上に保ちます。小さな核ペレットは見えないため、手順全体を通して上清の除去を容易にするために、スイングバケツを備えた遠心分離機を強くお勧めします。
<ol><li>ストレーナー(30 μm)を上に付けた15 mLチューブを準備し、1 mLの神経節培地でストレーナーを予備すすいでください。</li>
	<li>液体窒素からクライオバイアルを取り出し、直ちに37°Cの水浴中で解凍する。 氷の小さなペレットがクライオバイアルに残ったら、クライオバイアルを水浴から取り出します。</li>
	<li>手で注意深く振盪しながら各クライオビアに1mLの神経節培地を滴下して神経節細胞を回収する。 オプション: 細胞回収率を評価するには、ステップ 4.8 で説明するように、回収後に細胞懸濁液を混合し、生細胞計数のために 5 μL の細胞懸濁液を取り出します。</li>
	<li>各神経節細胞懸濁液を別々のストレーナー(ステップ5.1で調製)にロードし、各ストレーナーを4〜5mLの神経節培地ですすいでください。</li>
	<li>緊張した細胞懸濁液を300 × gで5分間遠心分離し、上清を慎重に除去し、細胞を50 μLの細胞洗浄バッファーに再懸濁する。</li>
	<li>細胞懸濁液を低結合DNA/RNA 0.5 mL微量遠心管に移す。</li>
	<li>細胞懸濁液を500× g で4°Cで5分間遠心分離する。</li>
	<li>細胞ペレットが脱落しないように、チューブの底に触れずに45μLの上清を除去します。</li>
	<li>45 μLのチルド溶解バッファーを加え、200 μLのピペットチップを使用して優しくピペットを上下させます。</li>
	<li>細胞を氷上で8分間インキュベートする。</li>
	<li>各チューブに50 μLの冷たい核洗浄バッファーを加える。 混ぜないでください。
</li>
	<li>核懸濁液を600× g で4°Cで5分間遠心分離する。</li>
	<li>核ペレットを破壊せずに95μLの上清を除去する。</li>
	<li>45 μLの冷却核洗浄バッファーをペレットに加える。 オプション:5 μLの核懸濁液を採取し、5 μLの0.4%トリパンブルーと混合してカウントし、血球計数器で顕微鏡下で核の品質を確認します。</li>
	<li>核懸濁液を600 × g で4°Cで5分間遠心分離する。</li>
	<li>核ペレットが外れないように、チューブの底に触れずに上清を取り除きます。</li>
</ol>6. ハッシュタグオリゴ(HTO)と多重化による中核バーコード
注:HTO染色ステップは、Gaublommeらによる皮質組織における以前の適用に従って、非常に少量の(神経節)核の核標識のために修正および最適化された15。
<ol><li>50 μLのST-SBバッファーを核ペレットに加え、核が完全に再懸濁されるまで8~10回ピペットで静かにピペットする。</li>
	<li>ST-SB/核ミックス50 μLあたり5 μLのFcブロッキング試薬を加え、氷上で10分間インキュベートします。</li>
	<li>ST-SB/nuclei mixのチューブあたり1 μL(0.5 μg)の単一核ハッシュタグ抗体を加え、氷上で30分間インキュベートします。 注:インキュベーション時間が短いほど、代表的な結果に示されているように、ハッシュタグラベリングの効率が低下します。</li>
	<li>各チューブに100 μLのST-SBを加える。 混ぜないでください。
</li>
	<li>核懸濁液を4°Cで5分間、600× g で遠心分離する。</li>
	<li>核ペレットを破壊せずに145μLの上清を除去する。</li>
	<li>手順 6.4 と 6.5 を繰り返します。核ペレットが外れないように、チューブの底に触れずに上清をできるだけ取り除きます。</li>
	<li>核ペレットを50μLのST-SBに再懸濁し、核を穏やかに混合する。</li>
	<li>5 μLの核懸濁液を採取し、5 μLの0.4%トリパンブルーと混合して顕微鏡下で核を計数する。トリパンブルーと混合し、血球計数器に装填した核の代表的な画像については 、図3A を参照されたい。</li>
	<li>核懸濁液を4°Cで600× g で5分間遠心分離する。</li>
	<li>ST-SBに核を再懸濁し、対応する核数に従って各サンプルについて1,000~3,000核/μLの目標核濃度を達成する。</li>
	<li>サンプルをプールして、必要な数のセルを達成します。 注:例えば、この実験では、8つのサンプルを均等にプールして合計25,000個の核を達成し、その後すぐに10倍のゲノミクスクロムおよびsnRNA-seqに進む。核数は、通常、神経節が12〜16週齢のマウスから単離された場合、6,000〜40,000細胞の範囲内に収まる。ロードされた全核の約半分のみが液滴ベースのsnRNA-seqによって捕捉され得る。例えば、25,000核混合物を調製して、さらなるライブラリー調製およびシーケンシングに必要とされる10,000核を確実に捕捉した。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

ここでは、i)成体マウス上頸部および星状交感神経節の解剖、ii)神経節細胞の単離および凍結保存、iii)核単離、およびiv)多重化目的のためのHTO標識およびsnRNA-seqによる核バーコードに焦点を当てた詳細なプロトコルが記載されている。
このプロトコールにより、交感神経節細胞は、一般的に使用されるトリプシンおよびコラゲナーゼを用いて個々の神経節を解離させることによって容易に得ることができる。単離された神経節細胞の長期保存は、10%DMSOを添加したFBSで細胞を凍結することによっても容易に達成され、融解後の回収率の高さを示した。さらに、従来の単一細胞RNAシーケンシングと比較して、単一マウス交感神経節の液滴ベースのsnRNA-seqの使用とHTO染色ベースの核バーコードの適用を組み合わせると、以下の利点を有する:i)すべてのサンプルがさらなる核単離の準備が整うまでサンプルを長期間保存することができる。ii)複数の小型神経節から単離された良質の核を、分離された試料調製によって引き起こされるバッチ効果なしにシーケンシングのために一緒にプールすることができる;iii)核バーコードを...

自律神経系(ANS)は、環境条件や病態への適応を含む身体の恒常性を維持する末梢神経系の重要な部分です1。これは、心臓血管系、呼吸器系、消化器系、および内分泌系などの全身の複数の臓器系の調節に関与しています。ANSは交感神経と副交感神経の枝に分かれています。交感神経系の脊髄枝は、交感神経鎖の神経節においてシナプスし、傍椎体の位置で両側に位置する。両側頸部および胸部神経節、特にStGは、心臓交感神経支配に関与する重要な構成要素である。心臓虚血などの疾患状態では、ニューロンリモデリングが起こり得、交感神経オーバードライブ2をもたらす。ニューロンリモデリングは、ヒトおよびいくつかの他の動物種における複数の組織学的研究において実証されている3、4、5、6。心臓交感神経節における心臓虚血誘発ニューロンリモデリングの詳細な生物学的特徴付けは現在欠如しており、心臓交感神経系(SNS)内の特殊なニューロン細胞型またはサブタイプの基本的な生物学的特徴は、健康および疾患においてまだ完全には決定されていない7。
scRNA-seqなどの新しい技術は、単一細胞レベルでの小組織の遺伝的特徴付けのためのゲートウェイを開いた8,9。しかしながら、ニューロンのサイズが比較的大きいことは、ヒトにおけるこれらの単一細胞技術の最適化された使用を妨げる可能性がある10。さらに、単一細胞シーケンシングでは、シーケンシングプロセスにおける高い損失のために十分な細胞数を回復するために、高スループットの細胞が必要です。これは、1 回のセッションで捕捉するのが難しく、シーケンシングに十分な単一細胞を導入するために複数のサンプルを必要とする小さな組織を研究する場合、困難になる場合があります。最近開発された液滴ベースのsnRNA-seq技術(すなわち、10倍クロムプラットフォーム)は、単一核間の生物学的差異の研究を可能にする11,12。snRNA-seqは、エマルジョン中のゲルビーズ(GEM)では捕捉できない可能性のある大型細胞(>30μm)に対してscRNA-seqよりも優位に立つだけでなく、広範な解離および/または長期保存との適合性も向上しています13,14,15。
不均一性、神経細胞の数、および心臓SNSにおいて富化された他の細胞は、健康および疾患状態におけるANSの特性評価にとって重要な側面である。さらに、各交感神経節による臓器特異的または領域特異的な神経支配は、SNSの複雑さに寄与する。さらに、交感神経連鎖の子宮頸部、星状、および胸部神経節は、心臓の異なる領域を神経支配することが示されている16。そのため、個々の神経節に由来する神経節細胞の単一核解析を行い、その生物学的構造を研究する必要がある。
液滴ベースのsnRNA-seqは、プレートベースのシーケンシングプラットフォームよりも低コストで、一度に複数のサンプルからの数千の細胞のプールのトランスクリプトーム全体の発現プロファイリングを可能にします。このアプローチにより、液滴ベースのsnRNA-seqは、SCGおよびStG内の細胞の細胞表現型分類および新しい亜集団同定により適しており、特に、このプロトコルは、交感神経外因性心核の同定、単離、および単一核RNAシーケンシングのための簡潔な段階的アプローチを提供し、他の関連器官および組織を神経支配する神経節の特性評価の研究において幅広い応用の可能性を秘めた方法を提供する。 健康と病気。

<table><tbody><tr><td><強>化学薬品および試薬</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0.4% トリパンブルー色素</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 2 型</td><td>ワージントンLS004176</td><td></td><td>1,400 U/mL</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアブソリュート &ge;99.5%</td><td>VWR</td><td>VWRC83813.360</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (低エンドトキシン)</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベース 培地</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>細胞洗浄バッファー</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+、Mg2+フリー)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Cell wash buffer</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液、1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Nucleus Lysis buffer</td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Nucleus Lysis buffer</td></tr><tr><td>Nuclease free water (not DEPC treated)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>Nucleus Lysis buffer</td></tr><tr><td>プロテクターRNase阻害剤、40 U/&micro;L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>核溶解バッファー</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム溶液、5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>核溶解バッファー</td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩溶液、1 M、pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>核溶解バッファー</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>核洗浄</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+、Mg2+無料)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Nucleus</td></tr><tr><td>wash Protector RNase Inhibitor,40 U/&micro;L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Nucleus wash</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>ST 染色バッファー (ST-SB)</td></tr><tr><td>塩化カルシウム溶液、1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>ST 染色バッファー (ST-SB)</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液、1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>ST 染色バッファー (ST-SB)</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水 (DEPC 以外)処理済み)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>ST 染色緩衝液 (ST-SB)</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム溶液、5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>ST 染色緩衝液 (ST-SB)</td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩溶液、1M、pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>ST 染色緩衝液 (ST-SB)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Millipore</td><td>822184</td><td>ST 染色緩衝液 (ST-SB)</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0451 抗核細孔複合体タンパク質 ハッシュタグ1 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>682205</td><td>ハッシュタグ抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0452 抗核細孔複合体タンパク質 ハッシュタグ2</td>抗体バイオ<td>レジェンド</td><td>682207</td><td>ハッシュタグ抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0453 抗核細孔複合体タンパク質 ハッシュタグ3</td>抗体バイオ<td>レジェンド</td><td>682209</td><td>ハッシュタグ抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0461 抗核細孔複合体タンパク質 ハッシュタグ11 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>682225</td><td>ハッシュタグ抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0462 抗核細孔複合体タンパク質 ハッシュタグ12 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>682227</td><td>ハッシュタグ抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0463 抗核孔複合体タンパク質 ハッシュタグ13</td><td>抗体バイオレジェンド</td><td>682229</td><td>ハッシュタグ抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0464 抗核細孔複合体タンパク質 ハッシュタグ14 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>682231</td><td>ハッシュタグ抗体</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0465 抗核細孔複合体タンパク質 ハッシュタグ15 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>682233</td><td>ハッシュタグ</td></tr><tr><td>抗体 TruStain FcX (ヒト)</td><td>バイオレジェンド</td><td>422302</td><td>FC受容体遮断液</td></tr><tr><td><強力>装置および消耗品</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブライトライン&nbsp;血球計算盤</td><td>Merck</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702/R A-4-38</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp;</td><td></td>EP022629905</tr><tr><td>CoolCell LX Cell 凍結容器</td><td>Corning</td><td>CLS432003-1EA</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Thermo Scientific</td><td>479-6840</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108035-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC処理されていないペトリ皿</td><td>Corning</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>ファルコン 15 mL 円錐形遠心分離管</td><td>フィッシャー科学</td><td>10773501</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 デュモン #5</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>硬化ファイン ハサミ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;アイスパン、長方形 4 L オレンジ</td><td>コーニング</td><td>CLS432106-1EA</td><td></td></tr><tr><td>ライカ MS5</td><td>ライカ</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>モリア MC50 はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15370-50</td><td></td></tr><tr><td>ノイズ スプリングシザー</td><td>ス ファインサイエンスツール</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス CK2 ULWCD</td><td>オリンパス</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>P10</td><td>ギルソン</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Preseparation フィルター (30 &micro;m)</td><td>Miltenyi biotec</td><td>Miltenyi biotec130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>振とうウォーターバス</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>シリコンプレート</td><td>RubberBV</td><td>3530</td><td>解剖板</td></tr><tr><td>ソフトウェアとパッケージ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell ranger</td><td>V4.0.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R programming</td><td>V4.1.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R sudio</td><td>V1.3.1073</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>V4.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tydiverse</td><td>V1.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX 株 #022501</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX 株 #007576</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>チャールズ川</td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ分析用コード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE</tr></tbody></table>

単一核rnaシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

心臓自律神経系は、心拍数や心収縮などの心機能を制御する上で重要であり、交感神経と副交感神経の枝に分かれています。通常、恒常性を維持するためにこれら2つの枝の間にはバランスがあります。しかし、心筋梗塞、心不全、高血圧などの心臓病状態は、心臓神経支配に関与する細胞のリモデリングを誘導する可能性があり、これは有害な臨床転帰と関連している。
心臓自律神経系の組織学的構造と機能に関する膨大な量のデータがあるが、健康と疾患におけるその分子生物学的構造は、依然として多くの面で謎めいている。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)などの新しい技術は、単一細胞分解能での組織の遺伝的特性評価に有望です。しかしながら、ニューロンのサイズが比較的大きいことは、これらの技術の標準化された使用を妨げる可能性がある。ここで、このプロトコルは、液滴ベースの単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)を利用し、健康および疾患における心臓交感神経ニューロンの生物学的アーキテクチャを特徴付ける方法である。段階的なアプローチは、成体マウスから解剖された両側上頸部(SCG)および星状神経節(StG)のsnRNA-seqを行うことが実証される。
この方法により、長期間のサンプル保存が可能となり、短期間に複数の個人/実験からのサンプルを一度に採取できない場合でも、適切なRNA品質を維持できます。ハッシュタグオリゴ(HTO)で核をバーコードすることで、シーケンシング後の個別の神経節サンプルの多重化解除とトレースバックが可能になります。その後の解析により、交感神経節のニューロン、衛星グリア、および内皮細胞の核捕捉が成功し、snRNA-seqによって検証された。要約すると、このプロトコルは、交感神経外因性心核のsnRNA-seqに対する段階的なアプローチを提供し、他の器官および組織の神経支配の研究においてより広範な適用の可能性を有する方法である。

単一核cDNAライブラリー調製およびsnRNA-seqの品質管理解析 代表的な結果は、25,000読み取り/核遺伝子発現ライブラリと5,000読み取り/核ハッシュタグライブラリを備えた単一のプール内の10,000個の捕捉された核のシーケンシング結果を記述します。 図3B は、バイオアナライザーで確認した1本鎖 cDNA、遺伝子発現(GEX)ライブラリー、及びHTOライブラリーの品質管理結果を示す。HTO由来cDNAは180bpより小さく、mRNA由来cDNAは300bpより大きいと予想される。高品質のGEXライブラリは300~1,000 bpのブロードなピークとして検出でき、HTOライブラリは194 bpの特定のピークとして検出されます。セルレンジャーは、デフォルト設定で多重化解除、fastqファイル生成、および読み取りアライメントに使用されました。スーラトRパッケージ19 は、その後、品質管理と下流分析に使用されました。
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このプロトコルは、マウス上頸部および星状神経節の解剖、細胞解離、凍結保存、核単離、ハッシュタグバーコーディングなど、単一核シーケンシングのための詳細で低入力のサンプル調製について説明しています。

単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

このJoVEプロトコルでは、液滴ベースの単一核RNAシーケンシングを使用して、健康と疾患における心臓交感神経ニューロンの生物学的アーキテクチャを特徴付けます。この方法は、一定期間にわたるニューロンサンプルの大規模なコレクションのシーケンシングを可能にする。ハッシュタグオリゴでバーコード化された核を引っ張ることによって、この方法は、サンプルの多重化を可能にする。この方法は、細胞サイズが大きく、サンプルの同時収集が困難なため困難であったヒト神経節のニューロンのシーケンシングに拡張される可能性を秘めています。手順を実証するには、研究技術者のConny van Munsterenと、私たちの研究室の博士課程の学生であるLieke van Roonが、解剖に必要なすべての材料を集めることから始め、解剖ボードにマウスを固定します。毛皮の分散を最小限に抑えるために70%エタノールでマウスを濡らします。はさみで正中線カットをして首領域の皮膚を開きます。実体顕微鏡下で、下顎下腺を脇に動かし、胸骨乳様筋を除去して総頸動脈とその分岐部、ならびに上頸部神経節を露出させ、それに付着した組織を除去する。左右の頸動脈分岐部とそれに付着した組織を解剖する。解剖した各組織片を、冷たいPBSを含む別々の3.5センチメートルのペトリ皿に移す。頸動脈分岐部に取り付けられた上頸部神経節を見つける。動脈と付着組織を除去して上頸部神経節をきれいにする。星状神経節を解剖するには、腹部に正中線の切断を行い、続いて横隔膜と腹側胸壁を開きます。肺を取り除き、続いて心臓を取り除き、背側胸郭を露出させる。最初の肋骨のレベルで、筋大腸ロンガスの前外側の左右の星状神経節を見つけます。周囲の組織を除去することによって鉗子で両方の星状神経節を解剖する。冷たいPBSを含む3.5センチメートルのペトリ皿にそれらを移す。鉗子を使用して、上頸部神経節および星状神経節を1.5ミリリットルの微量遠心管に分離し、500マイクロリットルの0.25%トリプシン-EDTA溶液を各管に加え、振とう水浴中でインキュベートする。神経節が微小遠心チューブの底に沈むのを許します。上清を5ミリリットルの神経節培地を含む15ミリリットルのチューブに移す。マイクロ遠心チューブに、500マイクロリットルのコラゲナーゼタイプ2溶液を加え、振とう水浴中でインキュベートする。インキュベーション後、組織凝集塊が検出されなくなるまでピペッティングによりコラゲナーゼ溶液に神経節を再懸濁する。細胞懸濁液を、トリプシン-EDTA懸濁液と共に神経節培養培地を入れて予め使用した15ミリリットルチューブに移す。細胞懸濁液を遠心分離し、細胞上清を廃棄する。ペレットを270マイクロリットルのウシ胎児血清に再懸濁し、1ミリリットルのクライオビアルに移す。細胞を数えるために、5マイクロリットルの神経節細胞懸濁液を5マイクロリットルの0.4%トリパンブルー色素と混合する。混合物を血球計数器にロードし、顕微鏡下で総細胞数と生細胞数をカウントする。次に、各クライオビアルに30マイクロリットルのジメチルスルホキシドを加え、よく混ぜる。クライオバイアルを細胞凍結容器に移し、一晩マイナス80°Cに置きます。15ミリリットルのチューブを用意し、上部に30マイクロメートルのストレーナーを取り付けます。ストレーナーを1ミリリットルの神経節培地で予備すすいでください。クライオバイアルを液体窒素から取り出し、すぐに37°Cの水浴中で解凍し、小さな氷のペレットがクライオバイアルに残るまで解凍します。各クライオビアルに1ミリリットルの神経節培地を加えながら、バイアルを注意深く振って神経節細胞を回収する。神経節細胞懸濁液をストレーナーにロードし、4〜5ミリリットルの神経節培地ですすいでください。緊張した細胞懸濁液を遠心分離する。上清を除去し、細胞を50マイクロリットルの細胞洗浄緩衝液に再懸濁する。細胞懸濁液を0.5ミリリットルの低結合マイクロ遠心チューブに移す。細胞懸濁液を遠心分離する。スイングバケツローターを備えた遠心分離機は、これからも不可欠です。遠心分離後、細胞ペレットを脱落させることなく45マイクロリットルの上清を除去する。45マイクロリットルのチルド溶解緩衝液を加え、ピペッティングにより穏やかに混合し、細胞を氷上で8分間インキュベートし、次いで50マイクロリットルの冷核洗浄緩衝液を各チューブに加える。核懸濁液を遠心分離し、核ペレットを破壊することなく95マイクロリットルの上清を除去する。45マイクロリットルのチルド核洗浄バッファーをペレットに加え、遠心分離を繰り返し、上清を除去した。核ペレットに、50マイクロリットルのST-SBを加え、核が完全に再懸濁されるまで静かにピペットし、次いで5マイクロリットルのFCブロッキング試薬を加え、氷上で10分間インキュベートする。次に、1マイクロリットルの単一核ハッシュタグ抗体を加え、氷上で30分間インキュベートする。インキュベーション後、100マイクロリットルのST-SBを各チューブに加える。懸濁液を遠心分離し、核ペレットを破壊することなく145マイクロリットルの上清を除去する。遠心分離を繰り返し、上清を除去する。核ペレットを50マイクロリットルのST-SBに再懸濁し、穏やかに混合する。5マイクロリットルの核懸濁液を採取し、それを5マイクロリットルの0.4%トリパンブルーと混合して、顕微鏡下で核を数える。再度、核懸濁液を遠心分離し、核ペレットをST-SBに再懸濁して、マイクロリットル当たり1,000~3,000核の目標核濃度を達成する。サンプルを引っ張って、所望の細胞数を達成します。ライブラリー調製のための品質管理分析は、180塩基対未満のハッシュタグオリゴ由来cDNAを示した。300から1,000塩基対までのブロードなピークは高品質の遺伝子発現ライブラリーを表し、一方、194塩基対の特異的ピークはハッシュタグオリゴライブラリーを示した。単一核RNAシーケンシング解析により、UMAPによって可視化された12のクラスターが明らかになり、ハッシュタグ抗体がすべてのクラスターに分布しました。ハッシュタグオリゴによる特異的な標識は、Xistの発現により確認した。ハッシュタグは1〜4で女性にラベルを付け、5〜8は男性サンプルにラベルを付けた。シーケンシングデータの品質および分解能は、交感神経細胞のクラスター5および7のTH、DBH、およびSNAP25、サテライトグリア細胞のクラスター0~3のS100B、内皮細胞のクラスター4のPECAM 1、間質細胞のクラスター8のACTA2などの主要な転写産物によって検証された。この方法を試すときは、適切な準備と、細かい解剖はさみ、鋭いピンセット、スイングバケットローターを備えた遠心分離機などの適切な機器が不可欠であることを覚えておくことが重要です。交感神経外因性心核の単一核RNAシーケンシングのための段階的なアプローチは、健康および疾患における他の関連器官および組織を神経支配する神経節を特徴付ける上で広範な適用の可能性を秘めている。

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Medicine

医学

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洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。...

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シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

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単一核の配列のための凍結した哺乳類ティッシュからの単一核の隔離のための簡単で、速く、部分的に自動化されたプロトコル

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ヒト筋肉間脂肪組織からの核の単離と下流の単一核RNAシーケンシング

これは、マウスの総頚動脈のintraplaque新血管形成（4週間）と（二週間で）乱流の条件とその後のアテローム性動脈硬化症の発展の原因となる部分的な頸動脈結紮術を、説明します。我々はまた、高純度内皮RNAを提供する、頸動脈内膜からのRNA分離の新しい方法を説明します。...

部分的ライゲーションによるマウス頸動脈における乱流誘発アテローム性動脈硬化症と頸動脈内皮からのRNA単離の方法における簡便な方法のモデル

学ぼう マウス交感神経節の単一核RNAシーケンシング法。バーコード化抗体による低入力核単離と多重化技術を用いて、心臓交感神経細胞の生物学的構造を解析する方法です。

単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

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