Name: ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 学ぶソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー。ハイドロゲルや細胞の硬さを測定し、オープンソースPythonソフトウェアで再現性のある解析を行います。

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GCとMAGOは、CeMiのすべてのメンバーを認めています。MSSは、EPSRCプログラム助成金(EP/P001114/1 )による 支援を認めています。
GC:ソフトウェア(ソフトウェア開発とアルゴリズムへの貢献)、形式解析(ナノインデンテーションデータの解析)、検証、調査(ポリアクリルアミドゲルのナノインデンテーション実験)、データキュレーション、ライティング(原案、レビュー、編集)、可視化(図とグラフ)。 MAGO:調査(ゲルと細胞サンプルの準備、細胞のナノインデンテーション実験)、書き込み(元のドラフト、レビューと編集)、視覚化(図とグラフ)。 NA:検証、書き込み(レビューと編集)。 IL:ソフトウェア(ソフトウェア開発とアルゴリズムへの貢献)、検証、執筆(レビューと編集)。 MV:概念化、ソフトウェア(オリジナルソフトウェアとアルゴリズムの設計と開発)、検証、リソース、執筆(原案、レビューと編集)、監督、プロジェクト管理、資金調達 MSS:リソース、ライティング(レビューと編集)、監督、プロジェクト管理、資金調達。すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。

著者は開示するものは何もありません。

このプロトコルは、市販のフェルールトップナノインデンターを使用して、ハイドロゲルとシングルセルの両方で力分光ナノインデンテーションデータを堅牢に取得する方法を示しています。さらに、ナノインデンテーションデータの分析のための正確なワークフローを含むPythonでプログラムされたオープンソースソフトウェアの使用手順が提供されます。
プロトコルの重要なステップ 次の手順は、このプロトコルに従う場合に特に重要であることが確認されています。
サンプル調製
測定を開始する前に、測定の制約を念頭に置いてサンプルを準備することが重要です。つまり、サンプルは表面に接着し、できるだけ平らでなければなりません。これは、ヒドロゲルなど、細胞のように表面に自然に付着しないサンプルを調製する場合に特に重要です。まず、サンプルは測定を妨げ、プローブを損傷する可能性があるため、溶液中に浮遊してはなりません。このためには、カバーガラスの化学的官能基化が推奨され、その...

生物学における力学の基本的な役割は、今日確立されています1,2。全組織から単一細胞まで、機械的特性は、調査中の生体材料の病態生理学的状態について知らせることができます3,4。例えば、癌の影響を受けた乳房組織は健康な組織よりも硬い、これは一般的な触診検査5の基礎となる概念である。特に、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされるコロナウイルス病2019(COVID-19)は、赤血球変形能の低下、リンパ球および好中球のこわばりの減少など、血球の機械的特性の変化によって強調されていることが最近示されていますSARS-CoV-2ナイーブな個人の血球と比較して6。
一般に、細胞と組織の力学は本質的に絡み合っており、各組織は構成細胞と細胞外マトリックス(ECM)のそれらに同時に影響を及ぼし、依存する特定の機械的特性を持っています5。このため、生物学の力学を研究するための戦略には、生理学的に関連する機械的刺激を備えた基板を操作して、それらの刺激に応答した細胞の挙動を解明することがよくあります。例えば、Englerらによる独創的な研究は、柔らかくて硬い2次元ポリアクリルアミド(PAAm)ヒドロゲルで研究されたように、間葉系幹細胞の系統の関与がマトリックスの弾力性によって制御されることを実証しました7。
調査中の生体材料を機械的に特徴付けるための多くの戦略が存在し、空間スケール(すなわち、局所からバルク)および変形のモード(例えば、軸方向対せん断)において異なり、その結果、慎重な解釈を必要とする異なる情報が得られる3,8,9,10。ソフトバイオマテリアルの力学は、一般的に剛性の観点から表されます。ただし、剛性は材料特性と形状の両方に依存しますが、弾性率は材料の基本的な特性であり、材料のジオメトリとは無関係です11。このように、異なる弾性率は特定のサンプルの剛性に関連しており、各弾性率は、異なる境界条件(例えば、自由膨張対閉じ込め)における特定の変形モード(例えば、軸方向対せん断)に対する材料の抵抗を包含する11,12。ナノインデンテーション実験は、生体材料が横方向に閉じ込められていない場合の一軸変形(インデンテーション)に関連するEを介した機械的特性の定量化を可能にする10,11,12。
マイクロスケールで生物学的システムのEを定量化する最も一般的な方法は、AFM13,14,15,16です。AFMは、pNレベルまでの力分解能とサブnmスケールまでの空間分解能を備えた非常に強力なツールです。さらに、AFMは、補完的な光学的および機械的ツールとの結合に関して非常に柔軟性があり、調査中の生体材料から豊富な情報を抽出する機能を拡張します13。ただし、これらの魅力的な機能には、実験セットアップの複雑さに代表される参入障壁があります。AFMは、ユーザーが堅牢なデータを取得する前に広範なトレーニングが必要であり、特にその独自の力と空間分解能が必要ない場合、生体材料の日常的な機械的特性評価に使用することは不当であることがよくあります。
このため、新しいクラスのナノインデンターは、その使いやすさから最近人気を博していますが、サブnNの力分解能とμmの空間分解能を備えたAFMに匹敵するデータを提供し、関連する長さスケールにわたって細胞によって加えられ、知覚される力を反映しています2。特に、光ファイバセンシング技術17,18に基づくフェルールトップナノインデンテーションデバイスは、メカノバイオロジーの分野で活躍する研究者の間で人気を博しています。そして、細胞19,20、ヒドロゲル8,21、および組織22,23を含む、これらのデバイスを使用した生体材料の機械的特性を報告する豊富な研究が発表されている。局所的な動的機械的特性(すなわち、貯蔵弾性率および損失弾性率)を調査するこれらのシステムの能力にもかかわらず、Eを生成する準静的実験は依然として最も一般的な選択肢である8,19,20,21。簡単に言えば、準静的ナノインデンテーション実験は、最大変位、力、または押し込み深さのいずれかによって定義される設定値まで一定の速度でサンプルをインデントし、カンチレバーの力と垂直位置の両方をいわゆる力-距離(F-z)曲線で記録することで構成されます。次に、F-z曲線は、接触点(CP)の識別によって力-インデンテーション(F-δ)曲線に変換され、適切な接触力学モデル(通常はヘルツモデル13)を取り付けてEを計算します。
フェルールトップナノインデンターの動作はAFM測定に似ていますが、検討する価値のある特異性があります。本研究では、市販のフェルールトップナノインデンターを用いて細胞や組織模倣ハイドロゲルから F-z 曲線をロバストに取得するためのステップバイステップガイドを提供し、本デバイスと他の同様のデバイスを使用した研究グループ間の実験手順の標準化を促進します。さらに、ナノインデンテーション実験を行うためのヒドロゲルサンプルと細胞の最適な調製方法に関するアドバイスと、実験経路に沿ったトラブルシューティングのヒントが提供されます。
さらに、ナノインデンテーション結果(すなわち、 E およびその分布)の変動性の多くは、データの分析に使用される特定の手順に依存し、これは自明ではない。この問題に対処するために、Pythonでプログラムされ、 F-z 曲線のバッチ分析のためのユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を備えた新しく開発されたオープンソースソフトウェアの使用手順が提供されています。このソフトウェアは、高速データスクリーニング、データのフィルタリング、さまざまな数値手順によるCPの計算、 Eの従来の計算、および弾性スペクトル24と呼ばれるより高度な分析を可能にし、細胞のバルクヤング率、アクチン皮質ヤング率、およびアクチン皮質の厚さを推定することができます。ソフトウェアはGitHubから自由にダウンロードでき、適切なデータパーサーを追加することで、他のシステムから発信されたデータを分析するように簡単に適合させることができます。このプロトコルは、他のフェルールトップナノインデンテーションデバイス、および他のナノインデンテーションデバイス全般に使用できることを強調し、いくつかのステップは特定の機器のガイドラインに従って適合されます。プロトコルを概略的に図 1にまとめます。

<table><tbody><tr><td>12 mmカバースリップVWR</td><td></td><td>631-1577P</td><td></td></tr><tr><td>35 mm細胞処理培養皿</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>アクリルシラン</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16400</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Merk</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide</td><td>Merk</td><td>110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>キアロナノインデンター</td><td>光学11 Life</td><td></td><td>&nbsp;カトローグ番号なし</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td>一般</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>高グルコース DMEM</td><td>ギブコ</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td></td><td></td><td>一般</td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>キンバリー・クラーク</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>631-1550P</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ システム</td><td>Merk Millipore</td><td>ZR0Q008WW</td><td></td></tr><tr><td>OP1550 干渉計</td><td>光学11 寿命</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>光学 11 生命プローブ (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)</td><td>光学 11 生命</td><td></td><td>カトローグ番号なし</td></tr><tr><td>光学 11 生命プローブ (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)</td> <td>光学 11 生命</td><td></td><td>カトローグ番号なし</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RainX 防雨剤</td><td>RainX</td><td>26012</td><td></td></tr><tr><td>標準シャーレ (90 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>101RTIRR</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>真空乾燥器</td><td>Thermo Scientific</td><td>531-0250</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ取得ソフトウェア (v 3.4.1)</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GitHub Desktop (オプション)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Python 3</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code (オプション)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

ナノインデンテーションとは、マイクロメトリックフォースプローブを使用してソフトバイオマテリアルや細胞の局所的な機械的特性を定量化する実験技術のクラスを指します。このアプローチは、メカノバイオロジー、生体材料設計、組織工学の分野で中心的な役割を果たし、単一細胞サイズ(μm)に匹敵する分解能でソフトマテリアルの適切な機械的特性評価を取得しています。このような実験データを取得するための最も一般的な戦略は、原子間力顕微鏡(AFM)を使用することです。この装置は、力(pNまで)と空間(サブnmまで)において前例のない分解能を提供しますが、その使いやすさは、ヤング率(E)などの機械的特性の積分指標の日常的な測定を妨げる複雑さによって制限されることがよくあります。光ファイバセンシング技術に基づくものなどの新世代のナノインデンターは、μmの空間分解能でサブnN力を加えることを可能にしながら、統合が容易であることから最近人気を博しているため、ヒドロゲルや細胞の局所的な機械的特性を調べるのに適しています。
このプロトコルでは、市販のフェルールトップ光ファイバセンシングナノインデンターを使用してヒドロゲルおよびセルに関するナノインデンテーションデータを取得するための実験手順を詳述するステップバイステップガイドが提示されます。いくつかのステップは本明細書で使用される器具に固有であるが、提案されたプロトコルは、他のナノインデンテーションデバイスのためのガイドとしてとらえることができ、いくつかのステップが製造業者のガイドラインに従って適合されることを前提とする。さらに、ナノインデンテーションデータを分析するためのユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイスを備えた新しいオープンソースのPythonソフトウェアが提示され、誤って取得された曲線のスクリーニング、データのフィルタリング、さまざまな数値手順による接触点の計算、 従来のEの計算、および特にシングルセルナノインデンテーションデータに適したより高度な分析が可能になります。

プロトコルに従って、F-z曲線のセットが得られます。データセットには、適切な曲線と、分析を続行する前に破棄する曲線が含まれている可能性があります。一般に、曲線の形状が図 4A に示すものと異なる場合は、曲線を破棄する必要があります。図5AIは、NanoPrepare GUIにアップロードされた予想されるE 0.8 KPa35のソフトPAAmヒドロゲルで得られた~100個の曲線のデータセットを示しています。ほとんどの曲線は、明確で平坦な基線、遷移領域、および材料13 の見かけの剛性に比例する傾斜領域を示します。ただし、少数の曲線は、ベースラインがない、接触がない、ベースラインが傾斜しているなど、図4Aに示す形状からの変更を示しています。これらの曲線は、NanoPrepare (図 5AII、赤い曲線) と、標準の JSON 形式で保...

このプロトコルは、ヒドロゲルや細胞を含むソフトマテリアルナノインデンテーション実験のための完全なワークフローを提供します。まず、力分光法データを取得するための実験手順が詳述されています。次に、そのようなデータの分析は、GitHubから無料でダウンロードできる新しく開発されたオープンソースのPythonソフトウェアを通じて詳細に説明されます。

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

このプロトコルは、市販のナノインデンターを使用してヒドロゲルと細胞の剛性を測定するためのステップバイステップガイドを示し、取得したデータを再現的に分析するためのオープンソースソフトウェアも提供します。しかし、このプロトコルにより、原子間力顕微鏡のようなデータを数分の一の複雑さで取得できます。したがって、このプロトコルは、健康なサンプルと病気のサンプルの機械的特性の研究に関心のある科学者にとって有用ですが、ソフトマテリアルのナノインデンテーションのコンテキストでより広く適用できると考えています。装置の電源を入れ、実験用に選択したプローブを取り付けたら、プローブのキャリブレーションを開始します。ソフトウェアのメインウィンドウで[初期化]をクリックします。表示されるキャリブレーションメニューで、入力ボックスにプローブの詳細を入力します。次に、底が平らな厚いガラスのペトリ皿にサンプル皿と同じ培地を満たし、培地の温度をサンプルの温度と一致させます。次に、キャリブレーション皿をプローブの下に置きます。液体中での校正の場合は、ピペットの端をガラスフェルールに軽く接触させた状態で、プローブを70%エタノールまたはイソプロパノールの液滴で事前に濡らし、液滴がカンチレバーと球形の先端上を滑るようにします。次に、プローブが完全に水没するまでナノインデンターのアームを手動で下にスライドさせますが、それでもペトリ皿の底から遠く離れています。液体中で平衡状態に達するまで5分間待ちます。次に、ソフトウェアの初期化メニューで、[波長のスキャン]をクリックします。干渉計の画面にプログレスバーが表示されます。干渉計ボックスの波長スキャンパネルに移動して、光学スキャンが成功したかどうかを確認します。次に、[初期化]メニューで[サーフェスの検索]をクリックして、プローブを徐々に下げます。プローブは、ガラスのペトリ皿に接触すると動きを停止します。プローブが表面に接触したら、メインソフトウェアウィンドウのy下向き矢印ボタンを使用してプローブを1マイクロメートル下に移動します。ライブウィンドウの緑色の信号を観察して、各1マイクロメートルステップでのベースラインの変化を確認します。次に、[初期化]メニューから[キャリブレーション]をクリックします。キャリブレーションが完了したら、表示されるポップアップウィンドウで新旧のキャリブレーション係数を確認します。原稿で説明されているように、新しいキャリブレーション係数が正しい範囲内にある場合は、[新しい係数を使用]をクリックします。次に、ピエゾを500マイクロメートル上に移動します。次に、干渉計デスクトップの[復調]タブに移動して、復調円が正しく調整されているかどうかを確認します。光学テーブルまたはナノインデンターを軽くたたいて、十分なノイズを誘発します。不連続データポイントの白い円は、赤い円をほぼ覆う必要があります。サンプルが入ったペトリ皿を顕微鏡ステージにセットし、ナノインデンターのプローブをサンプルの上の目的の位置に手動で移動します。プローブとサンプルの表面の間に1〜2ミリメートル離すように注意しながら、プローブを溶液中にスライドさせます。プローブが溶液中で平衡化するまで5分間待ちます。光学顕微鏡でプローブに焦点を合わせます。軟質材料のヤング率を測定するには、[実験の構成]をクリックします。変位制御に[サーフェス検索]ステップと 1 つのくぼみを追加して、後で自動マトリックス スキャンに使用する実験パラメータを決定します。単一のインデントが成功した場合は、10〜100マイクロメートルの間隔で50〜100ポイントを含むマトリックススキャンを構成します。[サーフェスの自動検索]ボックスにチェックマークが付いていることを確認したら、[ステージ位置を使用]をクリックして、現在のステージ位置からマトリックススキャンを開始します。変位制御でマトリックススキャンプロファイルを設定します。セグメントの数は 5 のままにして、デフォルトの変位プロファイルを使用します。必要に応じて、傾斜した各セグメントの変位プロファイルと時間を変更します。毎秒10マイクロメートルを超えるひずみ速度を超えないようにしてください。構成した実験を目的の実験パスに保存します。[実験を実行]をクリックし、完了するのを待ちます。すべてのデータが取得されたら、プローブを清掃し、本文の説明に従って機器の電源を切ります。力-変位曲線のスクリーニングとJSON形式のクリーニングされたデータセットの作成については、prepareを起動します。ラボ コンピューターのコマンド ラインから py を実行します。ドロップダウン リストから Optics11 データ形式を選択します。データが正しくロードされていない場合は、グラフィカル ユーザー インターフェイスを再起動し、[Optics11 Old] を選択します。次に、[フォルダーの読み込み] をクリックし、分析するデータを含むフォルダーを選択します。グラフィカル・ユーザー・インターフェースの右側にあるタブを使用して、データ・セットをクリーンアップします。次に、[JSON の保存] をクリックし、クリーニングされたデータ セットの適切な名前を入力します。現在のコンピューターと異なる場合は、NanoAnalysis ソフトウェアがインストールされているコンピューターに JSON ファイルを送信します。ナノを起動します。コマンドラインからpyファイルを作成します。グラフィカル ユーザー インターフェイスの左上にある [実験の読み込み] をクリックし、JSON ファイルを選択します。これにより、ファイルリストと、力-変位曲線の観点からデータセットを示す生の曲線グラフが入力されます。[統計] ボックスで、3 つのパラメーター (アクティブ化された N、失敗した N 、および除外された N の値) を確認します。特定の曲線をより詳細に視覚化するには、曲線をクリックします。これにより、緑色で強調表示され、現在の曲線グラフに表示されます。1つのカーブを選択すると、Rとkのパラメータが統計ボックスに入力されます。データセットをさらにクリーンアップしたら、[フィルタリング]ボックスに実装されているフィルターを使用して、曲線内のノイズをフィルタリングします。次に、現在の曲線グラフでフィルタリングされた曲線を調べます。フィルタリングされた曲線は黒で表示され、フィルタリングされていないバージョンは緑で表示されます。接触点を見つけるには、[接触点]ボックスから、ソフトウェアに実装されている一連の数値手順のいずれかを選択します。原稿で説明されているように、接触点が正しく配置されるように、データセットに合わせてアルゴリズムのパラメータを調整します。接触点が 1 つのカーブ上のどこにあるかを表示するには、カーブをクリックして選択します。次に、[検査] をクリックします。表示されるポップアップウィンドウをチェックして、接点が配置されている場所を特定します。次に、ヘルツ分析をクリックします。これにより、3つのグラフが生成されます。データセット内の各曲線の力のインデントデータと、赤で示されている平均ヘルツフィットを確認します。次に、1標準偏差を示す誤差バンドを持つ平均力押し込み曲線と、赤で示されている平均ヘルツフィットを確認します。次に、ヘルツモデルを個々の曲線に当てはめることから生じるヤング率の散布図を確認します。計算された平均ヤング率とその標準偏差について結果ボックスを調べ、それらが特定の実験に対して妥当であることを確認します。次に、[保存] ボックスで [Hertz] をクリックします。ポップアップウィンドウで、ファイル名とディレクトリを入力し、[保存]をクリックします。tsv ファイルが作成されます。統計分析とさらなるプロットのために、追加のソフトウェアでtsvファイルを開きます。細胞ナノインデンテーションデータについては、弾性スペクトル分析をクリックしてください。生成された2つのプロット、すなわち、各曲線のくぼみの深さの関数としてのヤング率と、二層モデルによって適合された押し込みの関数としての平均ヤング率を調べます。分析が終了したら、[保存] ボックスの [ES] をクリックします。これにより、指定したディレクトリにtsvファイルがエクスポートされ、他の任意のソフトウェアで開いてプロットできます。実験が成功すると、力-変位曲線のアプローチセグメントが得られ、明確で平坦な基線、遷移領域、および傾斜領域があります。この形状からの変化を示す曲線は、NanoPrepareを使用してデータセットから簡単に削除できます。ここでは、軟質ポリアクリルアミドヒドロゲルと硬いヒドロゲルの平均力-押し込み曲線と平均ヘルツモデルを示します。ヤング率の個々の値をプロットすることによって、両方のヒドロゲルについて予想される平均ヤング率を検索した。細胞ナノインデンテーション実験の場合、平均力-圧痕曲線と対応する平均ヘルツモデルは、ヘルツモデルが細胞ナノインデンテーション実験の押し込み深さの増加に伴う力の進化を完全には捉えていないことを示しています。ここでは、200ナノメートルのくぼみまで適合した平均弾性スペクトルを示します。平均弾性スペクトルは、200ナノメートルのくぼみの深さで増加し始め、プローブされた見かけのヤング率に対する基板の寄与を示しています。このため、ヘルツモデルと二層モデルの両方のフィッティング範囲として200ナノメートルが選択されました。二分子膜モデルを当てはめると、本文で説明されているように、細胞のアクチン皮質の厚さ、細胞のアクチン皮質弾性率、細胞の体積弾性率など、細胞の機械的状態に関するより多くの情報を抽出できます。ヤング率分布の観点からヘルツモデルと弾性スペクトルアプローチを直接比較すると、同等の平均で重複する分布が明らかになり、弾性スペクトルアプローチの実現可能性が実証されます。接触点を正確に特定し、比較したいデータセット間で選択したアルゴリズムパラメータの一貫性を維持することは、サンプル間の信頼できる比較を得るために最も重要です。この方法は、スフェロイド、オルガノイド、組織、および一般にすべてのソフトマターを含む生物学的サンプルの局所弾性特性を定量化するための一般的な適用性です。

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ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー

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