Name: 多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 学ぶ 多細胞スフェロイドの酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション法。蛍光顕微鏡を用いて酸素化と細胞生存率を評価し、3Dバイオプリンティングや組織工学への応用を可能にする。

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この研究は、ゲント大学(BOF/STA/202009/003)の特別研究基金助成金とEU FP7 ITNプログラム「Chebana」、助成金契約第264772号(AVK用)によって支援されています。データはご要望に応じて入手可能です。バイオプリンティング用のGコードは共有可能です。

著者らは開示するものは何もありません。

意味。組織酸素化測定は、細胞および組織特異的代謝、組織の成長および発達、生存率、腫瘍形成および細胞移動、ならびに微生物および他の病原体との相互作用に関する洞察を与える。提示された方法は、多細胞スフェロイド培養の生理機能をよりよく理解するための新しいツールを提供する:レシオメトリックナノ粒子O2プローブによる酸素化の分析および低酸素状態を評価するための手段を提供し、特定のエネルギー生産経路への依存を視覚化し、モデリング研究および代替代謝イメージングアプローチを補完する43,44 広く利用可能な低コストの蛍光顕微鏡で。レシオメトリック測定は、蛍光広視野(パルスLED励起が好ましい)、レーザー走査コンフォカル、ライトシートおよび2光子顕微鏡、理想的にはTおよびO2インキュベーターチャンバーを備えた顕微鏡で行うことができる。重要なことに、提示されたO2顕微鏡測定は、様々な生理学的パラメータおよび細胞トレーサー(異細胞スフェロイド培養の場合)、生存率(生/死染色)、脂質代謝(脂質感知蛍光プローブ)、pHの動態(色素、ナノ粒子、および蛍光タンパク質)または[Ca2+]のライブマルチパラメータ分析と容易に組み合わせることができる。]で、利用可能な蛍光スペクトルチャネルで、または並列に実施し、スフェロイド、バイオプリント構築物、および潜在的な組織移植におけるリアルタイムの細胞機能に関する拡張ビューを提供します。
スフェロイド培養物は、癌細胞、腫瘍および幹細胞ニッチ微小環境、腫瘍性、薬物効率および毒性スクリーニングの研究において、そして実際に組織バイオマブリケーションおよび自己組織化のための組織ビルディングブロックとしての使用を見出す45。それらは、様々な異なるアプローチ46によって複数の細胞型から生成され得る。回転楕円体モデルの普及は、研究の完全性とデータ解析の改善の観点から標準化が必要であり、これは最近、最初の回転楕円体データベース8の開発によって試みられた。
我々のプロトコールは、生きた回転楕円体代謝をよりよく理解し、この実験モデルを標準化し、その後、バイオプリントおよび移植可能な材料におけるそれらの長期安定性、再現性、および生存率を改善するのに役立つと期待されている。
変更。このプロトコルは、酸素化分析のためのO2プローブ負荷スフェロイドの高収率生成のためのマイクロパターン化されたアガロース低付着性表面(マイクロモールドベースの形成29)の使用を記載している。ハンギングドロップ、超低アタッチメントプレートの適用、脂質コーティング、または自由浮遊形成などのスフェロイド産生の代替方法も、提案されたO2プローブローディングプロトコルと互換性があります。提示されたプロトコルは、hDPSCスフェロイドおよびhDPSCの共培養スフェロイドとHUVECとのために最適化された(1:1)。他の細胞株は確かに適用可能である15、17、47、48;しかしながら、異なる細胞接着特性、培養条件、代謝基質要件、およびナノ粒子染色との細胞適合性のために、いくつかのプロトコル最適化が必要な場合がある。適切なレシオメトリックナノ粒子ベースのO2感受性プローブの選択は、特定の細胞モデルに応じて、および使用される顕微鏡セットアップにおけるプローブのフォトブリーチング特性(光源の強度およびタイプ、カメラのスペクトル感度)、およびプローブの対応する基準およびO2感受性スペクトルチャネルのための適切な励起/発光フィルタの入手可能性に応じて行われなければならない。
いくつかのレシオメトリックO2プローブは市販されている2。あるいは、それらは、参照およびO2感受性色素とポリマーとの共沈によって社内で調製することができる24、25、49 他の場所に記載されている。個々のモデルごとに、適切なプローブと最適な顕微鏡観察条件を決定し、レシオメトリック測定中のプローブのフォトブリーチングまたは光誘起O2消費の影響を最小限に抑えるために、予備試験を行う必要があります。O2センシングナノ粒子の以前の研究では、その低い細胞毒性が実証され、広範囲の染色濃度(1〜20μg/mL)での適用が可能であった。一部のカチオン性ナノ粒子は保存中に自己凝集する可能性があるため、回転楕円体形成に対する潜在的な影響を最小限に抑えるために、負荷濃度をできるだけ低く抑えることをお勧めします。任意選択で、ナノ粒子懸濁液を濾過(0.2μm)するか、または使用前に遠心分離(10,000 x g、5分間)によって透明化して、懸濁液からすべての凝集体を除去することができる。
BioCADおよびHMIソフトウェアは提示されたバイオプリンタに特異的であるが、このプロトコルは、バイオインクの調製、組み立て、標準カートリッジの充填、および多孔質ヒドロゲル足場の設計として、他のバイオプリンタにも適用可能である。さらに、印刷速度および温度などのバイオプリンティングパラメータは、異なる押出ベースのバイオプリンタに対して同等であるべきである。印刷圧力および支柱直径は、針の種類および直径、バイオインク組成物、温度、および結果として生じる粘度に依存するが、それらは、異なるバイオプリンタを有するバイオプリントGelMAベースのバイオインクに印刷パラメータを最適化するための出発点となり得るが、一部のバイオプリンタは、空気圧の代わりにスピンドルを使用してバイオインク50を押し出す。
重要な手順とトラブルシューティング。 重要なステップの1つは、以下の考慮事項に基づくO2 プローブの選択である:まず、利用可能な蛍光顕微鏡のセットアップ(すなわち、互換性のある励起光源、励起および発光のためのフィルタ、カメラ感度および分光透過率および対物レンズの開口数)、これは、それらの光安定性に関して利用可能なプローブの数を制限することができ、 明るさと潜在的な光毒性。また、一部のタイプの浸漬油(油浸対物レンズの場合)は、赤色および赤外蛍光シグナルを妨害する可能性があることに注意することも重要です。光安定性試験は非常に重要であり、初期セットアップと予備試験中に実行する必要があると考えています。蛍光チャネルと異なる色素との間の潜在的なスペクトルクロストークを考慮する必要があります。実際、O2 プローブおよび他の選択された色素の潜在的な暗色および光誘導毒性は、特定の細胞モデルに関連して、プロトコル最適化51の間に評価されなければならない。ナノ粒子の特定の問題は、それらの作業濃度、染色媒体の組成(例えば、血清含有量)、培地と混合する前のナノ粒子の超音波処理、またはスフェロイド形成およびコンパクト化手順中のプローブ負荷の代わりに、スフェロイド形成のために細胞を予め染色および洗浄したO2プローブを使用することによって、それらの自己凝集であり得る。
記載されたスフェロイドモデルでは光の浸透深さに関連する問題は観察されなかったが、レシオメトリック強度シグナル、スフェロイドおよび生体作製コンストラクト(組織移植片)のサイズ、および各色素による細胞染色の最適化を行う際には、これを考慮する必要がある。赤色および近赤外発光波長が密接に一致するMMIR1プローブは、他の赤色/青色または緑色発光蛍光バイオセンサプローブと比較して、最も低いバックグラウンドおよび最良の組織光透過を提供することが期待される。
比率画像(および潜在的にスペクトルアンミキシングまたはデコンボリューション)の作成と処理は、ベンダーが提供するソフトウェア、またはImageJ、Fiji52,53、napari(https://napari.org)、MATLABなどのオープンソースオプションで行うことができます。重要なステップは、バックグラウンドを減算し、線形範囲での信号強度の変化を測定することです。
O2プローブの較正:ロテノンおよびアンチマイシンAは、それぞれミトコンドリア電子輸送鎖の複合体IおよびIIIの阻害剤であり、細胞呼吸54、55、15を遮断し、スフェロイド中のO2勾配の散逸および環境O2との平衡化を誘導する。したがって、環境O2濃度(すなわち、20%、15%、10%、5%、2.5%、1%、0%O2)を変更することは、細胞内のO2感受性プローブのレシオメトリック強度またはリン光寿命較正を可能にするであろう。典型的には、O2制御インキュベーターは絶対0%O2を達成することができず、特定の状況では、脱酸素に対するプローブの応答の迅速な試験が必要である。このような場合、25〜100μg/mLのグルコースオキシダーゼまたはNa2SO3/K2HPO4混合物(蒸留水中の10x溶液に対して各化合物に対して50mg/mL)をサンプルに添加しなければならない。重要なことに、細胞株が有意な程度の非ミトコンドリアO2消費を有する場合、呼吸の阻害および較正実験を行う際にこれを考慮する。
限界と将来の研究。 提案された方法および一般的なレシオメトリック検出の主な制限は、観察された比レベルの較正および実際のO2 レベルへの変換であり、これはハードウェアおよびユーザ画像取得設定の本質的な違いのために、比較正を機器および細胞特異的にする。重要なことに、広視野蛍光顕微鏡および記載されたセットアップの場合、比画像は、理想的な光学切片およびO2 較正ではなく、結合された投影を反映しており、意味をなさないであろう。一方、我々は、半定量比測定が、様々な供給源から産生され、酸素化に差を有するスフェロイドの統計的に有意で測定が容易な比較表現型を提供することを示す。
SPIM、ライトシート、シータ、2光子、ルミネッセンス寿命イメージングなどのライブ3Dオブジェクト用に設計された、よりアクセスしやすく手頃な価格の顕微鏡アプローチを機械学習56,57,58,59,19と組み合わせる将来の研究は、マルチパラメトリックO2イメージングをさらに定量的なアプリケーションにもたらすのに役立ちます。

分子状酸素(O2)は、細胞および組織の生存率、機能、および死を調節する重要な代謝産物の1つである。生理学的条件下では、局所的な組織酸素化は、組織血管新生、血流、および細胞代謝によって動的に調節され、場合によってはO2勾配、低酸素微小環境、および/または酸化ストレスの形成につながる1,2。細胞は、シグナル伝達機能における分子O2の直接関与(低酸素誘導因子(HIF)媒介シグナル伝達、ヒストンリジンデメチラーゼKDMおよび他の手段による)、細胞酸化還元電位の変化(Nrf2/Keap1シグナル伝達または鉄調節タンパク質を介して感知する反応性O2種を介して)を介してO2勾配を感知し、その後、それらの代謝、増殖を調節し、 効力、および分化3.したがって、細胞および組織の酸素化の不均一性、その勾配、および関連する現象は、組織発生および恒常性において重要なプレーヤーである。異なる組織および細胞型は、しばしば、異なる「正常な」生理学的O2レベルを必要とし、これは、組織O2マイクログラジエント4に従って配置された細胞を有する特別な組織アーキテクチャを定義する。一部の細胞型はO2の減少に敏感であり(例えば、ニューロン、肝細胞、膵島細胞、または筋肉細胞)5,6、他の細胞は極端な低酸素症に耐え、急峻なO2勾配(例えば、腸および結腸上皮)を形成することができる7。組織生物工学およびバイオファブリケーションの進歩に伴い、微小凝集体および回転楕円体3D組織構築物におけるO2定量の必要性が重要になる。懸念事項の1つは、生理学的パラメータの多細胞スフェロイドモデルの標準化であり、これはスフェロイド生成および培養条件8の方法に依存する。さらに、機能的な血管新生を欠くミクロ組織におけるO2放出生体材料またはO2灌流の制御されない適用は、細胞に有毒であり、それらの代謝のリプログラミングをもたらし、移植後期間における生存率を低下させる可能性がある9,10。生理学的に関連する微小凝集体の効率的な培養に到達するためのO2測定アプローチおよび酸素化環境の最適化の信頼性は、実施例11として用いた多能性幹細胞由来肝臓スフェロイドの数学的モデリングによって最近証明された。組織O2レベルの知識が認識される別の分野は、癌治療12、13である。不均一な腫瘍低酸素症は、成功した抗癌療法を損なう可能性がある。患者の治療または腫瘍低酸素モデリング中に正確な酸素化レベルを測定および制御することは、個別および個別化治療戦略の改善を可能にするであろう14。したがって、生体加工コンストラクトおよび3D腫瘍モデルにおける動的酸素化の定量的モニタリングは、それらの呼吸活性、代謝、および組織培養、製造条件、または低酸素媒介性治療応答の基礎研究の最適化の生理学的分析のための重要なツールである。
多くの方法は、スフェロイドおよび微小凝集組織構築物における細胞酸素化の多重化(またはマルチパラメータ)分析を可能にする。ニューロスフェアおよび腫瘍スフェロイド15,16,17の先駆者であるリン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)ベースのアプローチは、生きたミクロ組織における細胞酸素化の直接定量化を可能にし、細胞生存率、増殖、または機能的な細胞型の分布との相関関係を確立することを可能にする。このアプローチの力にもかかわらず、PLIM顕微鏡のアップグレードは、人気のある顕微鏡ベンダーの間でもまだ広く利用できません18,19。幸いなことに、多数の細胞透過性O2感受性ナノ粒子プローブを、蛍光強度ベースのレシオメトリック測定モード15、17、20、21、22、23、24に使用することもできる。典型的には、プローブは、蛍光顕微鏡、高含有量スクリーニングイメージャ、またはマイクロプレートリーダー上で測定することができる2つの発光波長、すなわち、O2感受性および非感受性(基準)を表示するであろう。このようなO2センシングナノ粒子は、可視スペクトルおよび近赤外スペクトルにまたがる生体適合性ポリマー、O2センシング、および参照色素を用いた沈殿技術によって製造することができ、またはそれらは商業的に購入することができる2,25。厚い3Dミクロ組織の分析は、赤方偏移蛍光色素の使用から利益を得るであろうので、O2センシングPtTPTBPF26および基準アザ−BODIPY27色素からなる比重計O2センシングナノ粒子プローブマルチモーダル赤外番号1(MMIR1)28を構築した。この設計では、O2感受性信号(近赤外線、励起(exc.)=635nm、発光(em.)=760nm;Isens)は、燐光消光工程を介して[O2]濃度の影響を受け、一方、赤色基準色素強度(exc. = 580 nm, em. = 650 nm;I参照)は影響を受けないままである(図1A)。これにより、染色細胞におけるIref/Iセン比(R)がO2校正22を可能とすることができる。
ここでは、スフェロイドおよびバイオプリント構築物における生細胞酸素化をモニタリングするための半定量的アプローチについて説明し、エンドポイントおよび動力学的測定におけるO2勾配の推定に役立つ。このようなO2イメージングは、他のタイプのレシオメトリックO2プローブ(図1B)を用いて行うことができ(図1B)、利用可能な光源および蛍光フィルターの数に応じて、他の色素と共に使用して、生細胞/死細胞、ミトコンドリア機能、および他の細胞タイプのトレースに関する情報を得ることができる。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)などの高度な測定モードも使用することができます19。細胞染色色素およびO2感受性ナノ粒子の使用における最大の課題は、染色プロトコールの最適化である。MMIR1プローブおよび関連ナノ粒子の場合、細胞は、回転楕円体形成のプロセス中に予め染色されるか、または共インキュベートされる。記載されたプロトコルでは、O2プローブ染色されたスフェロイドが低接着性のアガロース表面29、30、31、32上に生成され(図1C)、これはその後のスフェロイドベースのバイオプリンティングおよびO2および細胞死のマルチパラメータ分析を可能にする。アプローチの適用性を例示するために、ヒト歯髄幹細胞(hDPSC)スフェロイド(ヒト臍帯静脈内皮細胞、HUVEC)のホモまたはヘテロ細胞における酸素化レベルを、従来の蛍光顕微鏡を用いてバイオプリンティングの前後で比較した。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>シグマ</td></tr><tr><td>12ウェル細胞培養プレート、滅菌グ</td><td>ライナーバイオワン</td><td>665-180</td>からも入手可能 <td>同様の製品は、ザルシュテット、コーニング、その他の企業からも入手可能です。</td></tr><tr><td>12ウェルチャンバースライド、取り外し可能な</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Grace Bio-Labs、ThermoFisher Scientificなどからも入手可能</td></tr><tr><td>15mL遠心分離管</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRなどの企業からも入手可能</td></tr>です <tr><td>3ccカートリッジ、UVセキュア、ルアーロック</td><td>RegenHU</td><td>C-033CC-UV</td><td>CelIinkなどからも入手可能</td></tr><tr><td>3D Discoveryバイオ</td><td>プリンターRegenHU</td><td>N/A</td><td>バイオプリンターは、押出ベースのプリントヘッド、加熱マントル、UV-LED硬化ランプ、3DディスカバリーHMIソフトウェア(直接機械制御付きCAD / CAMソフトウェア)およびBioCADソフトウェア(バージョン1.1-12)</td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート、滅菌</td><td>グライナーバイオワン</td><td>657160</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能</td></tr>です <tr><td>Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td>ミトコンドリア電子伝達鎖の複合体IIIの阻害剤として使用され、細胞呼吸を遮断します</td></tr><tr><td>B-ブラウンチップキャップ、ルアーロック</td><td>RegenHU</td><td>TC-BB-B</td><td>Regemat、Cellinkなどからも入手可能</td></tr><tr><td>セルビュー細胞培養皿、PS、35/10mm、ガラス底、1コンパートメント、滅菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>627861</td><td>バイオプリントされたスフェロイド</td></tr><tr><td>の顕微鏡観察用ヒト胎盤由来コラーゲン、IV型</td><td>シグマ</td><td>C5533</td><td>0.07mg/mLコラーゲンおよび0.03mg/mLポリ-D-リジンコーティング顕微鏡ディッシュ</td></tr><tr><td>D(+)-グルコース</td><td>メルク</td><td>8342</td>の調製用 <td>1Mストック溶液、イメージング培地(最終濃度10mM)の調製用1/100</td></tr>ダル<tr><td>ベッコ改変イーグルス培地(DMEM)、フェノールレッド、グルコース、ピルビン酸、グルタミンフリーの</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D5030-10X1L</td><td>イメージング培地の調製用</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22011</td><td>ロンザ他からも入手可能</td></tr><tr><td>内皮成長サプリメントミックス</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>ロンザ他からも入手可能</td></tr><tr><td>FCCP、シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C2920-10MG</td><td>ミトコンドリアアンカプラーとして使用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>また、シグマ</td></tr><tr><td>GelMAから</td>入手可能 <td>n/a</td><td>GelMAはPBMグループ(教授博士ピーターDubruelとサンドラヴァンVlierberghe、ゲント大学)[https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782]によって合成されましたが、Xpect Inx</td><td></td></tr>から<tr><td>も入手可能です Aspergillus nige(10000 u)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141</td><td>からのグルコースオキシダーゼ脱酸素化に対するプローブの応答をテストするために使用されます</td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x サプリメント</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>希釈 1/100 イメージング培地の調製用(最終濃度 2mM)</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>希釈 1/100 イメージング培地の調製用(最終濃度 10mM)</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>H21486</td><td>Sigma、BDBiosciencesからも入手可能その他</td></tr><tr><td>ヒト歯髄幹細胞(hDPSC)</td><td>ロンザ</td><td>PT-5025</td><td>ATCCまたは他のベンダーからも入手可能</td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)</td><td>ロンザ</td><td>CC-2517</td><td>ATCCまたは他の</td>ベンダーKH2PO4</tr><tr><td>(リン酸二水素カリウム)</td><td>メルク</td><td>4873</td><td>からも入手可能亜硫酸ナトリウム溶液(5mg / mLNa2SO3および5mg / mLKH2PO4)の調製用。毎日10倍の濃縮ストック溶液から新鮮なものを調製します。</td></tr><tr><td>Li-TPO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Li-TPO-Lは、PBMグループ(ゲント大学のPeter Dubruel教授とSandra Van Vlierberghe)によって合成されました。[https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15)、https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination]しかし、同等の光開始剤は、シグマ</td></tr><tr><td>MEMアルファ媒体+グルタマックス最小必須媒体</td>から入手可能です <td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>また、シグマなど</td></tr><tr><td>から入手可能ですマイクロパターン化された3DプリントPDMSスタンプ、直径400&microのウェル。m、厚さ、総井戸数 1585</td><td>自作</td><td></td><td>これらのスタンプは、マイクロシステム技術センター(教授博士ヤンVanfleteren、ゲント大学)によって自己製作されたが、また、メルク(Z764094、Microtissues 3Dペトリ皿マイクロモールド混合スフェロイドキット)</td></tr><tr><td>Na2SO3(亜硫酸ナトリウム)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239321-500G</td><td>から商業的に取得することができます亜硫酸ナトリウム溶液(5mg / mLNa2SO3および5mg / mLKH2PO4)の調製用。毎日10倍の濃縮ストック溶液から新鮮なものを調製します。</td></tr><tr><td>O2プローブ:MMIR1、SI-0.2+、SII-0.2+</td><td>N/A</td><td>N/A</td>準備<td>可能社内で」市販の染料、ポリマー、沈殿法を使用[https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387]。一部のナノ粒子は、[https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x</td></tr><tr><td>]ペン連鎖球菌:Pエニシリン(10,000 U / mL)/ストレプトマイシン(10,000 &mu;g/mL) 100x solution</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Sigma からも入手可能です。希釈1:100</td></tr><tr><td>ペトリ皿、滅菌</td><td>Greinerバイオワン</td><td>633181</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能</td></tr>です <tr><td>3ccカートリッジ</td><td>RegenHU</td><td>P-03CC-UV</td>用ピストン <td>Cellink、Regemat他からも入手可能</td></tr><tr><td>Poly-D-リジン</td><td>シグマ</td><td>P6407-5mg</td><td>0.07mg/mLコラーゲンおよび0.03mg/mLポリ-D-リジンコーティング顕微鏡の調製用皿</td></tr><tr><td>PVDFシリンジフィルター0.22&micro;m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能</td></tr><tr>です<td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td>ミトコンドリア電子伝達鎖の複合体Iの阻害剤として使用され、細胞呼吸を遮断します</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>希釈 1/100 イメージング培地の調製用(最終濃度 1mM)</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>S7559</td><td>Sigma、Promegaなどからも入手可能</td></tr><tr><td>テーパーチップ22ゲージ(円錐形PE針</td><td>Amada Myachi Europe</td><td>22K62222</td><td>RegenHU、Cellink、Regematなどからも同様の製品があります</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ(75cm2)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRなどの企業からも入手可能</td></tr>です <tr><td>Ultrapureアガロー</td>ス<td>Invitrogen(ライフテクノロジーズ)</td><td>16500-500</td><td>アガロース低融点(A-9414、シグマ)、ルーチン使用のためのアガロース(A-9539、シグマ)</td></tr><tr><td>広視野蛍光倒立顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>N / A</td><td>倒立蛍光顕微鏡IX81、電動Z軸制御付き、CoolLED pE4000(16チャンネル、365-770 nm)、ORCA-Flash4.0LT(浜松)cMOSカメラ、ガラス温暖化プレートOkolab、CellSens Dimension v.3ソフトウェアおよび航空目標 4x/0.13 UPlanFLN および 40x/0.6 LUCPlanFLN。(オプション、高解像度イメージング用) 60x/1.0 LUMPLFLN 水</td></tr></tbody></table>

多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

多細胞スフェロイドは、組織および癌生理学を3Dで研究するための重要なツールであり、バイオファブリケーションのための組織組立ユニットとして組織工学において頻繁に使用されている。回転楕円体モデルの主な力は、組織マイクロスケールでの物理化学的勾配を模倣することにあるが、スフェロイド内部の実際の生理学的環境(代謝活性、酸素化、細胞死、および増殖のダイナミクスを含む)は一般に無視される。同時に、得られたスフェロイド表現型に対する増殖培地組成物および形成方法の影響は十分に文書化されている。したがって、研究成果の再現性と透明性を確保するためには、回転楕円体表現型の特性評価と標準化が求められています。平均スフェロイド酸素化および3次元(3D)におけるO2勾配の値の分析は、スフェロイド表現型特性評価のための簡単で普遍的な方法であり得、それらの代謝活性、全体的な生存率、およびインビボ組織微小環境を再現する可能性を指摘する。3D酸素化の視覚化は、追加の生理学的パラメータ(細胞死、増殖、細胞組成など)のマルチパラメトリック分析と簡単に組み合わせることができ、継続的な酸素化モニタリングおよび/またはエンドポイント測定に適用できます。O2プローブの装填は、スフェロイド形成の段階で行われ、スフェロイド生成の様々なプロトコルと互換性がある。このプロトコルには、導入された赤色および近赤外発光レシオメトリック蛍光O2ナノセンサによるスフェロイド生成のハイスループット法と、バイオプリンティング前後のスフェロイド酸素化および細胞死のマルチパラメータ評価の説明が含まれる。実験例は、ホモおよびヘテロ細胞スフェロイドならびにスフェロイドベースのバイオプリント構築物における比較O2勾配分析を示す。このプロトコルは、複数の蛍光フィルターと発光ダイオードを光源として有する従来の蛍光顕微鏡と互換性がある。

マイクロパターン化アガロース法を用いて予め染色されたスフェロイドのO2プローブのハイスループット生産を、予め染色されたスフェロイドを有さずかつそれを用いたアガロースマイクロウェルの例を示す図1Cに模式的に示されている。アガロースコーティング上の回転楕円体形成の効率およびそれらの形状/真球度は、細胞特異的であり得る。例えば、ヒト結腸HCT116細胞は、脂質コーティングされた表面17とは対照的に、アガロースマイクロウェル法を用いて理想的な球状構造を形成することはなかったが、hDPSC単独でHUVECと共培養すると、細胞組成、初期細胞数、およびスフェロイド形成/増殖の持続時間に比例した再現性の高い形状およびサイズのスフェロイドが常に産生された。試験されたすべての細胞型は、スフェロイド形成中にO2プローブナノ粒子を効率的に蓄積し(図1B)、この染色を少なくとも5日間にわたって保存し、バイオプリンティングおよびその後のバイオプリント組織酸素化のモニタリングにそれらを使用することを可能にする(図1D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig01.jpg"> 図1:O2プローブ機能の原理とスフェロイド染色およびバイオプリンティングへの応用 (A)燐光発光ナノ粒子(NP)プローブによるO2センシングの原理を説明する単純化されたヤブロンスキー図。禁制三重項励起状態(T)中の分子O2へのエネルギーの移動は、励起から一重項状態(S1)への励起と基底状態(G0)42との間の時間であるリン光寿命τ(0%O2のτ1から21%O2への変化)に反比例するリン光強度の減少をもたらす。定量的O2測定は、レシオメトリック測定またはτの測定(リン光寿命測定)によって行うことができる。(b)異なる種類のナノ粒子O2プローブで染色されたヒト歯髄幹細胞(hDPSC)スフェロイドの染色の一例を、透過光、参照、およびO2感受性色素蛍光チャネルに示す。(C)マイクロパターン化アガロース法を用いて予め染色されたスフェロイド生成のハイスループットO2プローブの概略図。左から右へ:培養プレートのウェルに入れたPDMSシリコンスタンプ、アガロースでマイクロウェルパターンの例(倍率4倍)、およびマイクロパターンアガロース上に播種後2日目にHCT116ヒト大腸癌細胞から産生されたMMIR1プレ染色スフェロイドの例(倍率4倍)。(D)左から右へ:バイオプリントワッフルコンストラクトと、バイオプリント後の1日目および5日目にMMIR1プレ染色されたスフェロイドバイオプリントコンストラクトの顕微鏡分析。蛍光シグナルは、MMIR1ナノ粒子中のO2感受性燐光発光色素(例:635nm/em. = 760nm)に対応する。スケール バーは 400 μm です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
記載された顕微鏡セットアップ(光源として発光ダイオード(LED)を搭載した従来の広視野蛍光顕微鏡)では、赤色/近赤外MMIR1プローブは、その基準および感度色素の光安定性の点で最高であることが判明しました。)連続照明の12サイクル後。これにより、電子輸送鎖の複合体Iのミトコンドリアアンカプラ(FCCP)および阻害剤による治療時のhDPSCスフェロイドにおける迅速な呼吸応答の動的リアルタイム研究にMMIR1プローブを使用せた(図2A、B)。幹細胞由来スフェロイドでは、FCCPは、DPSC40の以前に報告された代謝特性と一致して、この薬物を添加した後〜80秒以内に細胞呼吸のわずかな減少を伴う軽度の脱共役効果しか示さなかった。一方、ロテノンは、刺激後〜80秒以内のスフェロイド間O2勾配のスフェロイド再酸素化(Rp−スフェロイド周辺比およびRc−スフェロイドコア比の増加として反映される)および周辺コアO2勾配の散逸をもたらす呼吸を強く阻害した(図2A)。高(大気)および低(イメージング媒体中の亜硫酸ナトリウムおよびグルコースオキシダーゼ存在下)におけるMMIR1プローブ比(R)の2点半較正により、アンチマイシンA/ロテノンカクテル処理による予備呼吸を伴うスフェロイドにおける酸素化の減少に関連するRの減少が確認された(図2C)、MMIR1プローブRの測定が、3Dにおける長期定常状態および迅速な酸素化応答の半定量的モニタリングにどのように適用できるかを示す。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig02.jpg"> 図2:異なる刺激に対するO2 プローブ応答の速度論的解析。 (a)安静時およびFCCPおよびロテノン処置に応答したhDPSCスフェロイド酸素化画像化の代表的な結果。(B)初期フォトブリーチング強度比速度論と比較したFCCPおよびロテノン処理に対するMMIR1強度比の速度論的応答(%)。(c)酸素化(アンチマイシンA+ロテノン添加)および脱酸素化(グルコースオキシダーゼ添加)状態におけるhDPSCスフェロイドにおけるMMIR1プローブの強度比の変化画像。カラーバーは、画像全体のO2 プローブ強度比(R=Iref /Iセン)分布を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
生代謝イメージングのためのMMIR1プローブの適用を説明するために、ホモセルhDPSC対ヘテロセルhDPSC/HUVEC(1:1)スフェロイドにおけるO2勾配の比較分析を行った。フリーの青色および緑色蛍光スペクトルチャネルの利用可能性を利用して、ヘキスト34580(HXT)およびSYTOX Green(SYTOX)との共染色を行い、マルチパラメトリック研究のためのO2プローブの適用を実証した(図3)。イメージングソフトウェアによって提供されるピクセルごとの強度比計算の自動プロトコルを使用して、スフェロイド中のR分布の偽色比画像が作製され、すべてのタイプのスフェロイドにおいてリアルタイムで検出された周辺からコアへのO2勾配を視覚化する:酸素化された周辺および低酸素ニッチを中央に有する(図2および図3A)。しかしながら、RpおよびRc値、ならびに中央断面におけるO2勾配の急峻さは、異なる回転楕円体タイプについて変化した:hDPSC対hDPSC/HUVECスフェロイドおよびhDPSC対バイオプリントhDPSCスフェロイドにおける中央断面の線プロファイルを参照されたい(図3B、C)。O2勾配を記述する広く受け入れられている方法はなかったので、我々は、一般的な回転楕円体酸素化の容易な比較および詳細な説明を可能にするいくつかのパラメータを導入した:RpおよびRc、ならびに酸素化ゾーンと低酸素ゾーンとの間の差としてのO2勾配のそのような特性(Rp−Rc)、およびμm当たりの酸素化の平均変化を(Rp−Rc)/ rとして、 ここで、rは周辺コアと低酸素コアの間の距離であり、中央断面において回転楕円体半径と相関する(図3D)。これらのパラメータを、スフェロイド中のSYTOXによって視覚化された壊死死細胞からのデータと共に統計的に比較することは、スフェロイド細胞型特異的O2分布勾配の起源に関する予備的な結論を引き出すのに役立った。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig03.jpg"> (A)印刷前後のホモセルhDPSCスフェロイド、およびヘテロセルラーhDPSC/HUVEC(1:1)スフェロイドにおける酸素化のライブ顕微鏡(MMIR1のレシオメトリック蛍光顕微鏡)および生/死細胞染色(ヘキスト34580、HXT、ブルーおよびSYTOX Green、SYTOX)の代表例。全てのタイプのスフェロイドにおけるhDPSCsは、同じ細胞培養物由来であった。スフェロイドは、形成中に5μg/mLのMMIR1プローブで2日間予備染色された後、イメージングまたはバイオプリンティング(hDPSCスフェロイドのみ)に使用され、バイオプリンティング後1日目にその後のイメージング分析が行われた。MMIR1染色されたスフェロイドの強度比(Iref/Iセン)画像の偽色画像は、それらの周辺対コアO2勾配に対応する。スケールバーは100μmである。カラーバーは、画像全体のO2プローブ強度比(R = Iref/Iセン)分布を表す。直径断面の番号1および2は、BおよびCに示す強度プロファイルに対応する(B,C)バイオプリンティングの前後の均質hDPSC/HUVECスフェロイド(B)および均質hDPSC スフェロイド間の強度比プロファイルの比較(C)。プロファイルは、(A)に示す回転楕円体の断面について測定した。(d)スフェロイドにおける周辺コアO2勾配の説明に用いたパラメータの概略図、ここでrは回転楕円体の半径であり、RpおよびRcは、それに対応して回転楕円体の周辺およびコア領域の強度比である。カラーバーは、理想的には球面回転楕円体における高(赤)レベルから低(青)レベルまでのO2勾配の分布を模式的に表す。(E,F)hDPSC/HUVECおよびhDPSCスフェロイド(E)およびバイオプリンティング後1日目の前後のhDPSCスフェロイド(F)における末梢-コアO2勾配(Rp-Rc)/r値の比較分析。統計解析は、1回の実験反復(n=18〜23)について行った。ボックスは標準偏差に対応します。アスタリスクは、グループ間の統計的差を示す(p = 0.05)。** = p &lt; 0.0005 です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ホモセルhDPSCスフェロイドと比較して、hDPSC/HUVECスフェロイドは有意に急な勾配を有していた:(Rp−Rc)/rパラメータおよび範囲(Rp−Rc;図3F)。同時に、それらは、周囲(Rp)およびコア(Rc)のより高い酸素化を示した(図4A、表1)。興味深いことに、それらは統計的にも大きく(図4A、表1)、酸素化のそのような差異は、それらの異なる細胞生体エネルギープロファイルによって引き起こされたことを示唆している。これらのデータは、ATPおよびNAD(P)H41の主な生体エネルギー源として解糖系およびペントース - リン酸経路に強い依存を有する細胞の呼吸活性が一般的に低いHUVEC細胞の周知の代謝特性と一致している。同時に、不均一なスフェロイドに形成された顕著な末梢-コアO2勾配は、それらの組成中のhDPSCによって生成される可能性が高く、過分極ミトコンドリアおよび活性電子輸送鎖40を特徴とし、hDPSCスフェロイドの酸素化に関する結果によれば、強い呼吸活性を有する(図3、図4A、および表1).したがって、一般的に、SYTOXによる死細胞染色の強度が低いことによって確認されたhDPSC/HUVECスフェロイドのより高い生存率は(図3A)、それらのより高い酸素化レベルと潜在的に関連している。
バイオファブリケーションにおけるスフェロイド酸素化のライブ顕微鏡イメージングの適用性を説明するために、MMIR1O2プローブプレ染色スフェロイドをGelMAバイオインク中のバイオプリンティングに使用し、バイオプリンティング後1日目の前後のhDPSCスフェロイド中のO2勾配を以下のように比較した(図3A、C、F、図4B、および表2)。バイオプリントされたhDPSCスフェロイドは、バイオプリント前に測定されたスフェロイドと比較して、周辺部を有意に酸素化(より高いRp)していたが、それらのコア酸素化は同様の値を有していた(図4B)。それらの周辺酸素化の変化は、バイオプリンティング前に測定されたhDPSCスフェロイドとは統計的に異なっていた、それらの周辺からコアへのO2勾配の範囲((Rp−Rc)および急峻さの増加(Rp−Rc)/rの増加)に影響を及ぼす(図3Fおよび図4B)。死細胞染色は、バイオプリントされたスフェロイドにおいて一般により明るく、スフェロイド生存率の低下がスフェロイド酸素化の変化に関与していることを示唆している(図3A)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig04.jpg"> 図4:MMIR1染色スフェロイドの直径および強度比の比較解析。 (A)ヘテロhDPSC/HUVECとホモセルhDPSCスフェロイドとの比較。(b)バイオプリンティング前後のホモセルhDPSCスフェロイドの比較。RpおよびRc-スフェロイドの周囲およびコアにおける強度比は、それに対応して;(Rp-Rc)-強度比の差は、スフェロイドにおけるO2勾配の範囲に対応する。統計解析は、1つの実験反復について行った(n=18〜23)。ボックスは標準偏差に対応します。アスタリスクは、グループ間の統計的差(p = 0.05)を示し、* = p &lt; 0.005、** = p &lt; 0.0005です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>回転楕円体の種類(N)</td>
			<td>直径 [μm]</td>
			<td>Rp [a.u.]</td>
			<td>Rc [a.u.]</td>
			<td>Rp-R c [a.u.]</td>
			<td>(Rp-R c)/r [a.u./μm]</td>
		</tr>
<tr>
<td>hDPSC / ヒューベック (18)</td>
			<td>113.2 ± 10.6</td>
			<td>0.779 ± 0.034</td>
			<td>0.398 ± 0.055</td>
			<td>0.982 ± 0.051</td>
			<td>0.00677 ± 0.00091</td>
		</tr>
<tr>
<td>hDPSC (18)</td>
			<td>88.1 ± 9.9</td>
			<td>0.558 ± 0.025</td>
			<td>0.331 ± 0.034</td>
			<td>0.227 ± 0.032</td>
			<td>0.00520 ± 0.00090</td>
		</tr>
<tr>
<td>p値</td>
			<td>1.5 x 10-8 *</td>
			<td>1.5 x 10-21 *</td>
			<td>1.3 x 10-4 *</td>
			<td>1.4 × 10から12 *</td>
			<td>9.2 x 10-6 *</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1. 回転楕円体径は、スフェロイドのコア(Rc)および周辺部における強度比(Rp)および(Rp−Rc)および(Rp−Rc)/r値の差を、不均一なhDPSC/HUVECおよび均質なhDPSCスフェロイドにおける。N個の回転楕円体上のt検定のp値は統計的差を示し、同様にアスタリスクで示される。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>回転楕円体の種類(N)</td>
			<td>直径 [μm]</td>
			<td>Rp [a.u.]</td>
			<td>Rc [a.u.]</td>
			<td>Rp-R c [a.u.]</td>
			<td>(Rp-R c)/r [a.u./μm]</td>
		</tr>
<tr>
<td>hDPSC (18)</td>
			<td>88.1 ± 9.9</td>
			<td>0.558 ± 0.025</td>
			<td>0.331 ± 0.034</td>
			<td>0.227 ± 0.032</td>
			<td>0.00520 ± 0.00090</td>
		</tr>
<tr>
<td>バイオプリントhDPSC (23)</td>
			<td>80.9±12.5</td>
			<td>0.584 ± 0.023</td>
			<td>0.323 ± 0.038</td>
			<td>0.261 ± 0.039</td>
			<td>0.00658 ± 0.00144</td>
		</tr>
<tr>
<td>p値</td>
			<td>0.054</td>
			<td>0.0024 *</td>
			<td>0.46</td>
			<td>9.9 X 10-4 *</td>
			<td>6.3 x 10-6 *</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2. スフェロイド径は、スフェロイドのコア(Rc)および周辺部(Rp)における強度比、バイオプリント前後の均質なhDPSCスフェロイドにおける強度比(Rp−Rc)および(Rp−Rc)/r値の差である。統計解析のp値(N個の回転楕円体)。統計的な違いはアスタリスクで示されます。

このプロトコルは、標準的な蛍光顕微鏡での酸素化および細胞死のマルチパラメトリック分析を使用して、バイオプリンティングのためのハイスループットスフェロイド生成を記述している。このアプローチは、スフェロイドの生存率を制御し、3D組織、腫瘍微小環境、および成功した(マイクロ)組織バイオファブリケーションのモデリングにおいて重要な標準化を実行するために適用することができる。

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

私たちのプロトコルは、従来の蛍光顕微鏡を使用して多細胞スフェロイドの酸素化をイメージングするのに役立ちます。この方法を使用すると、何千もの酸素プローブ染色されたスフェロイドミクロ組織を生成し、その後3D印刷アプリケーションで使用することができます。例えば、血管新生骨組織移植片。近赤外酸素プローブは、最終的に緑色蛍光染色などの他の色素の使用と互換性があり、これにより、ライブおよびマルチパラメータの長期分析が可能になります。マイクロパターン化されたPDMSスタンプを貯蔵バイアルから滅菌ペトリ皿に移し、滅菌層流気流条件下で滑らかな表面を上にして10分間空気乾燥させる。各スタンプを12穴滅菌組織培養プレートのウェルの中央に置く。開いた蓋で1〜2分間空気乾燥させます。50ミリリットルの3%均質アガロース溶液を調製し、挿入されたPDMSスタンプを覆うために、12ウェルプレートの各ウェルに約2ミリリットルのホットアガロース溶液を直ちに加える。アガロースを滅菌気流下でインキュベートして20分間固化させる。滅菌ヘラを使用して、埋め込まれたPDMSスタンプでアガロースを各ウェルに逆さまにします。スタンプの滑らかな上面に約200マイクロリットルの滅菌水を加えます。ヘラでアガロースから切り離し、井戸から取り除きます。直接使用するために、対応する滅菌細胞培養培地をアガローススタンプに1ミリリットル加える。プレートを蓋で覆い、摂氏4度で一晩インキュベートします。使用前に、アガロースマイクロパターンプレートを二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で1時間温めます。70%〜90%コンフルエント細胞培養物を予め加温したPBSですすいでください。解離酵素溶液を加え、摂氏37度で3〜5分間インキュベートする。その後、10%FBSを含む完全な細胞培養培地でトリプシンを中和する。単一細胞懸濁液を得るために、血清学的ピペットの上部にある1,000マイクロリットルのピペットチップを用いて細胞凝集塊を解離させる。計数チャンバーを用いて、細胞懸濁液のミリリットル当たりの細胞数を計数する。細胞懸濁液を1ミリリットルあたり500,000細胞に希釈し、それに濃縮酸素プローブ溶液を加える。12ウェルアガロースコーティング細胞培養プレートのマイクロパターン化されたウェルから古い培地を除去し、調製した細胞懸濁液をウェルに1ミリリットル加える。スフェロイドを二酸化炭素インキュベーター内で酸素プローブの連続存在下で2〜5日間培養し、スフェロイドの形成および圧縮中にスフェロイドが装填されていることを確認します。チップキャップで滅菌された3立方センチメートルのカートリッジの端を閉じ、ピペッティングによってバイオインクで充填する。プランジャーをカートリッジに挿入し、逆さまに保持します。チップキャップを取り外し、カートリッジからの空気がすべて取り除かれるまでプランジャーをバイオインクの方に押し込みます。バイオプリンターの加熱マントル内のバイオインクを摂氏23度で冷却します。バイオプリンターに70%エタノールをスプレーし、吸収紙で乾燥させます。カートリッジ上部の圧力アダプタをねじ込みます。カートリッジに22ゲージの円錐形ポリエチレン針を取り付けます。カートリッジを押出成形プリントヘッドの加熱マントルに取り付けます。圧力インレットを差し込み、インレットのクリップを開きます。デザインのGコードファイルを印刷ソフトウェアにロードします。針の長さ測定を開始します。滅菌したシャーレに少量のバイオインクを分配して印刷圧力を調整します。6ウェルプレートを取り付け、ウェルプレートを開き、フードを閉じて印刷します。印刷後、足場を摂氏5度で10分間物理的に架橋させます。印刷した足場に紫外線LEDランプを60秒間照射します。二重抗生物質溶液を含む対応する成長培地を、バイオプリントされたグリッドを有するすべてのウェルに直ちに加える。足場を二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で培養する。顕微鏡観察のために、印刷されたワッフルグリッドをイメージングメディアで顕微鏡の皿カバーに移します。1ミリリットルのピペットを使用して、アガロースマイクロウェルから予め染色されたスフェロイドの酸素プローブを静かに洗い流し、それらを15ミリリットルの円錐形底管に移します。マイクロパターン化されたウェルからすべてのスフェロイドを確実に収集するには、追加の1ミリリットルの培養培地でウェルを1〜3回すすぎ、すべてのスフェロイド懸濁液を1つのバイアルに組み合わせます。バイアルを垂直に最大10分間放置して、回転楕円体が底に落ち着くようにします。回転楕円体を乱さないようにチューブからメディアを慎重に取り出します。サンプルディッシュあたり少なくとも20個のスフェロイドに十分な新鮮な培養培地を加え、ピペッティングによってスフェロイドを穏やかに再懸濁する。直ちに等量の回転楕円体懸濁液を各プレコート顕微鏡観察ウェルに加える。回転楕円体を摂氏37度で1時間放置し、顕微鏡の表面によく付着させる。顕微鏡から培地をウェルに取り出し、イメージングメディアで1回すすいでください。正確な量のイメージングメディアをサンプルに追加します。顕微鏡検査ステージ上に染色された回転楕円体で顕微鏡検査をうまくセットアップします。10倍の倍率の対物レンズを使用して、透過光でサンプルをプレビューします。回転楕円体に予備的に焦点を合わせ、それらを画像の中心に配置し、必要な高倍率の対物レンズを作業位置に持って行きます。回転楕円体の赤道断面における透過光モードに焦点を合わせます。酸素プローブの基準スペクトルチャネルおよび高感度スペクトルチャネルの蛍光またはリン光シグナルを収集するための設定を調整し、イメージングプロセスを開始します。参照チャンネルと高感度スペクトルチャンネルからの酸素プローブ強度データを含むvsiファイルをマージモードで開きます。メジャーメニューから比分析機能ウィンドウを開きます。参照チャンネルの強度を分子として選択し、感度チャンネルの強度をR計算の分母として選択します。比解析ウィンドウで、対応する強度しきい値設定を各スペクトルチャンネルに適用して、マージされた強度画像から背景を減算します。回転楕円体画像に適用されるROIマスクは、回転楕円体の境界を決定する。画像の背景が均一に黒くなるまでしきい値を増やします。比率分析ウィンドウで、プレビュー画像が R グラデーションの望ましい解像度を提供するまで、比率画像に対するスケーリング係数を調整します。強度比分布の画像は、元のマルチチャンネル画像にレイヤーとして追加されます。マルチチャンネル画像のウィンドウで、偽カラーバーでレイヤーをアクティブにします。比率分布ヒストグラムのリンク制限とリンク解除限界は、表示調整ウィンドウの固定スケーリングオプションを使用して手動で決定します。スフェロイドの対応する透過光画像を開きます。線形定規関数を選択し、回転楕円体の直径を測定します。データをスプレッドシートのテーブルファイルとしてエクスポートします。必要なサイズと形状のROIを選択し、回転楕円体の周囲および低酸素コアに適用します。ROIを測定対象に変換して、選択したROI内の平均Rを分析します。スプレッドシートと互換性のある表形式でデータをエクスポートします。回転楕円体の各顕微鏡セクションに測定値を適用して、回転楕円体直径RCおよびRPのデータセットを取得し、さらなる計算および統計的比較を実行します。すべてのデータを 1 つのスプレッドシート ファイルに結合します。MMIR1プローブは、フォトブリーチングが低く、異なるミトコンドリア刺激に対するhDPSCスフェロイドにおける迅速な呼吸応答のリアルタイム研究に適している。FCCPは、いくつかの領域において軽度の脱共役効果のみを示し、その後、細胞呼吸をわずかに減少させた。一方、ロテノンは呼吸を強く阻害し、刺激後約80秒以内に回転楕円体再酸素化および周辺からコアへの酸素勾配の散逸をもたらした。イメージングソフトウェアが提供するピクセル単位の強度比計算の自動プロトコルを使用して、すべての回転楕円体タイプでリアルタイムで検出された周辺からコアへの酸素勾配が、酸素化された周辺と低酸素ニッチを中心に視覚化されます。本明細書のグラフは、異なるスフェロイドタイプに対する赤道スフェロイド断面の比プロファイルを描写する。ホモセルhDPSCスフェロイドと比較して、ヘテロセルhDPSCからHUVECスフェロイドへは有意に急勾配を有していた。ヘテロセルラースフェロイドにおける末梢からコアへの酸素勾配は、強い呼吸活性を有するhDPSCスフェロイド酸素化によるそれらの組成物中のhDPSCによって生成される可能性が高い。グラフは、バイオプリントされたhDPSCスフェロイドがバイオプリント前に測定されたスフェロイドよりも有意に酸素化された周辺部を有し、それらのコア酸素化が同様の値を有していたことを示している。時折プローブが沈殿して均一なスフェロイド形成が妨げられる場合は、使用前にプローブ溶液を高速でろ過または遠心分離してください。針長測定および圧力調節の補正は、バイオプリント速度および支柱径およびバイオプリント微細凝集体を多孔質足場に一致させるために不可欠なステップである。酸素に敏感なプローブイメージング用の顕微鏡設定を選択し、プローブの光安定性への影響を考慮してください。酸素イメージングは、多くのタイプのライブ顕微鏡測定と互換性があります。イメージング後、免疫蛍光、ウェスタンブロッティング用のタンパク質の抽出、または遺伝子発現解析を行うこともできます。

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Research

JoVE Journal

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ここでは、腫瘍スフェロイドの迅速、堅牢、低コストな作製とそれに続くハイドロゲルカプセル化を可能にするプロトコルを紹介します。特殊な機器を必要としないため、広く適用できます。特に、スフェロイドとマトリックスの相互作用を探索したり、 in vitro 組織生理学や病理学モデルを構築したりするのに有用です。...

スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化

ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。...

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

この研究では、アガロース型にマイクロウェルを作製するためのスタンプベースのシステムを使用して、3D細胞構造を生成するための費用対効果が高く効率的な方法論を提示します。このシステムは、均一なスフェロイド/オルガノイドの形成を促進し、細胞相互作用を改善します。このアプローチは、実験のばらつきを減らし、薬物試験や組織工学への応用をサポートします。...

新規スタンプデバイスを用いた二次元細胞培養からの三次元スフェロイド/オルガノイドの作製

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

学ぶ 多細胞スフェロイドの酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション法。蛍光顕微鏡を用いて酸素化と細胞生存率を評価し、3Dバイオプリンティングや組織工学への応用を可能にする。

多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

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