Name: 乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶラベルフリー生体内イメージング法で乳腺腫瘍微小環境を腫瘍・間質・血管に分節化する技術。コラーゲン二次高調波とNAD(P)H自己蛍光を用い、マウスへの侵襲を最小限に抑えた非侵襲的解析が可能です。

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著者らは、この研究に資金を提供したNCI R01 CA216248、CA206458、およびCA179556助成金に感謝したい。また、ケビン・エリセイリ博士と彼のイメージンググループが、私たちのイントラバイタルプログラムの早期開発における技術的専門知識に感謝したいと思います。我々はまた、ベン・コックス博士及びモーグリッジ研究所のエリセイリ・ファブリケーション・グループの他のメンバーに対し、MIWの初期段階における本質的な技術設計に感謝する。エレン・ドブソン博士は、ImageJ トレーニング可能な WEKA セグメンテーション ツールに関する有益な会話を支援しました。さらに、メリッサ・スカラ博士とアレクサ・バレス・ヒートン博士の顕微鏡のタイムリーな使用に感謝します。最後に、D.V.M.のBrigitte Raabe博士に、マウスの取り扱いとケアに関するすべての思慮深い議論とアドバイスに感謝します。

著者らは、開示する利益相反はありません。

4Dイントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の空間的および時間的コンテキスト内の動的な生理学的相互作用を調査するための強力なツールです。この原稿は、第2高調波発生またはNAD(P)H自己蛍光からの内因性信号のみを使用して、腫瘍塊、隣接する間質、または血管網に近接した範囲内の動的細胞相互作用を区画化するための非常に基本的で適応可能な運用フレームワークを提供する。このプロトコルは、イメージングウィンドウの埋め込みから画像取得、解析、セグメンテーションまでの包括的で段階的な方法を提供します。この手法は、4Dのイントラバイタルデータをセグメント化して定量化するために必要な分析フレームワークに貢献すると考えています。
このプロトコルは、ラベルのないPDXモデルを含む多数の生体内マウスモデルと広く互換性があるように開発されました。PDXは信じられないほど有益なモデル45であるが、PDXモデルの性質は遺伝子操作にはり適していないため、生体内イメージングに課題をもたらす。したがって、NAD(P)Hや第二高調波発生(SHG)のような内因...

腫瘍微小環境における細胞外マトリックス(ECM)は、疾患の進行をさらに促進するために、複数の細胞型によって動的に沈着および再構築されることが知られている1、2、3。これらのマトリックス変化は、細胞挙動を変化させる機械的および生物学的手がかりの両方を提供し、しばしばマトリックスリモデリングの継続的なサイクルをもたらす4。腫瘍細胞と細胞外マトリックスとの間の動的で相互的な相互作用の調査は、しばしば三次元(3D)体外培養またはマイクロ流体系を用いて行われる。これらのボトムアップアプローチはECMリモデリング5、6、7、増殖の増加8、上皮から間葉への移行9、10、11、12、および腫瘍細胞遊走および浸潤7、13、14、15、16のメカニズムを実証している。それらの焦点は、生理学的組織内に存在する相互作用の多様性および不均一性と比較して、均質な3Dマトリックス内のいくつかの細胞型(例えば、腫瘍細胞または線維芽細胞)に主に焦点を当ててきた。インビトロ系に加えて、エキソビボ腫瘍組織学はまた、これらの細胞間および細胞−ECM相互作用に関するいくつかの洞察を提供することができる17。免疫組織化学は、ECMの空間的に不均一な組成およびアーキテクチャに関して複数の細胞型を分析できるという利点を有するが、固定組織の静的エンドポイントは、細胞と微小環境との間の相互作用の動的性質を捕捉しない。イントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の生理学的文脈における多様で動的な相互作用を調査する扉を開きました。
生体内腫瘍イメージングの能力は急速に進歩しています。画像化窓の設計および窓を移植するための外科的技術の改善により、様々な解剖学的位置(すなわち、原発性腫瘍、リンパ節、転移部位)における長期縦断的腫瘍画像化が可能になった18、19、20。さらに、複数の次元(スペクトル、空間蛍光強度、および寿命)で、高解像度および速度(ビデオレート)でデータを視覚化および収集する光学機器の能力は、広くアクセス可能になりつつある。改良された技術は、生理学的環境における細胞シグナル伝達および表現型ダイナミクスの急速な変化を探求する機会を提供する。最後に、光遺伝学的ツールの拡大および広範囲の遺伝的蛍光構築物は、特定の細胞型のタグ付けを可能にし、発生または疾患進行中の腫瘍微小環境または細胞系譜トレースにおける細胞遊走を捕捉する21、22。これらのツールをCRISPR/Cas9技術と組み合わせて使用することで、研究者はユニークな動物モデルをタイムリーに生成することができます。
これらすべての進歩により、生体内イメージングは動的および生理学的細胞相互作用を探求するためのますます強力な方法となっていますが、これらの生物学的相互作用に組織レベルで空間的、時間的、および構造的文脈を提供する戦略を開発することが依然として重要です。現在、多くの生体内イメージング研究は、血管系に蛍光色素を注入するか、または外因的に蛍光タンパク質を発現して身体的特徴を描写するマウスモデルを使用することによって、血管などの視覚的ランドマークの欠如を補っている。注射可能な色素および蛍光デキストランのような基質は、生体内コレクション19、 23、 24において血管系を首尾よく標識するために広く利用されている。ただし、このアプローチには制限がないわけではありません。1つは、追加のマウス操作が必要であり、その有用性は短期的な実験に限定されています。縦断的研究の場合、蛍光デキストランは、貪食細胞におけるデキストランの蓄積または経時的な周囲の組織への拡散を観察するにつれて問題となり得る25。マウスモデルへの外因性蛍光タンパク質の取り込みは、蛍光デキストランの代替として提示されているが、それ自体の限界を提示している。マウスモデル内の外因性蛍光色素の入手可能性と多様性は、依然として限られており、作成にコストがかかります。さらに、PDXモデルなどの特定のモデルでは、遺伝子操作は望ましくなく、不可能です。また、細胞内の蛍光または生物発光タンパク質の存在は、マウス内で、および免疫担当マウスモデル内で異物として認識され、これは宿主免疫系の応答に起因する転移の量を減少させることも示されている26、27。最後に、空間的文脈または後続のデータをセグメント化するために使用される外因性蛍光タンパク質または蛍光色素は、しばしば、目的の生理学的相互作用を調査するために使用され得る光スペクトルのプライム範囲を占める。
ECMからの固有のシグナルまたは組織内の細胞からの内因性蛍光の使用は、より詳細な細胞および空間分析のためにバイタル内データをセグメント化する潜在的な普遍的なラベルフリー手段を表す。第2高調波発生(SHG)は、ECM28を視覚化するために長い間使用されてきた。繊維組織29、30、31の特性評価を支援するための重要なツールのその後の開発により、局所ECM構造に対する細胞挙動を特徴付けることができる。さらに、内因性代謝産物であるNAD(P)Hからの自家蛍光は、インビボで腫瘍微小環境を区画化するための別の標識のないツールを提供する。NAD(P)Hは腫瘍細胞内で明るく蛍光を発し、成長している腫瘍巣の境界を周囲の間質から区別するために使用することができる21,32。最後に、血管系は、腫瘍微小環境および重要な細胞型特異的相互作用の部位において重要な生理学的構造である33、34、35。赤血球(RBC)または血漿の励起は、腫瘍血管系を視覚化するために使用され、2光子または3光子励起(2P;)を使用して、血流速度の測定が可能であることが示されている36。しかし、大きな血管は内因性の蛍光シグネチャによって容易に識別できますが、微妙で可変で蛍光性の低い小さな血管の同定には、より多くの専門知識が必要です。これらの固有の困難は、最適な画像セグメンテーションを妨げます。幸いなことに、これらの内因性蛍光源(すなわち、赤血球および血漿)は、血管系のユニークな光物理的特性を利用し、成長する生命内ツールボックスへの有用な付加物を表す蛍光寿命画像化37によっても測定することができる。
このプロトコルでは、内因性蛍光やSHGなどの固有のシグナルを使用して、4次元(4D)イントラバイタルイメージングのセグメンテーションを明示的に行うためのワークフローが、取得から解析まで記述されています。このプロトコルは、PDXモデルの場合のように、外因性蛍光が実用的または不可能である可能性がある乳房イメージングウィンドウを介した縦断的研究に特に適切である。しかし、ここで概説したセグメンテーションの原則は、腫瘍生物学、組織発生、さらには正常な組織生理学を調査する生体内ユーザーに広く適用できます。報告された一連の分析アプローチにより、ユーザーは、整列またはランダムなコラーゲン線維構成の領域間で細胞挙動を区別し、腫瘍微小環境の特定の領域に存在する細胞の数または挙動を比較し、ラベルフリーまたは内因性シグナルのみを使用して血管系を腫瘍微小環境にマッピングすることができる。これらの方法を組み合わせることで、乳腺の4Dイントラバイタルイメージングから得られる情報の深さを最大化し、追加の外因性ラベルの必要性を最小限に抑えるための運用フレームワークが作成されます。

<table><tbody><tr><td>#1.5 12mm 丸型カバーガラス</td><td>Warner Instruments</td><td># 64-0712</td><td>MIW construction</td></tr><tr><td>1.0 mL syringe for SQ injection</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Syringe</td></tr><tr><td>20x objective</td><td>Zeiss</td><td>421452-988</td><td>水浸</td></tr><tr><td>27G needle for SQ injection</td><td>Covidien</td><td>1188827012</td><td>Needle</td></tr><tr><td>40x objective</td><td>Nikon</td><td>MRD77410</td><td>水浸</td></tr><tr><td>5-0 シルク編組縫合</td>糸 <td>Ethicon</td><td>K870</td><td>MIW 移植用縫合</td></tr>糸 <tr><td>人工涙液ジェル</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td>アイジェル</td></tr><tr><td>ベタジン溶液、5%</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>NC1558063</td><td>手術 消毒剤</td></tr><tr><td>綿先アプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>ロックタイト</td><td>1365882</td><td>MIW構造</td></tr><tr><td>蛍光デキストラン</td><td>Sigma</td><td>T1287-50mg</td>血管系鉗子の<td>静脈内標識</td></tr><tr><td></td><td>Mckesson.com</td><td>Miltex&nbsp;#18-782</td><td>ステンレス、4インチ、湾曲</td></tr><tr><td>GaAsP光電子増倍管</td><td>浜松&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブランケット</td><td>CARA 72 heating pad</td><td>&nbsp;038056000729</td><td>温度選択可能な</td></tr><tr><td>加熱チャンバー</td><td>自家製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光寿命ハンドブック</td><td>ベッカーとヒックル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks 倒立顕微鏡ベース</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アコーン</td><td>NDC 59399-106-01</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>リキノックス</td><td>フィッシャー科学的な</td><td>16-000-125</td><td>MIWのクリーニング</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>ノーブルック</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>鎮痛剤</td></tr><tr><td>のマイクロホース科学</td><td>的な商品株式会社。</td><td>&nbsp;BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>多光子スキャンヘッド</td><td>Bruker Ultima II</td><td></td><td>多光子スキャンヘッドとイメージングプラットフォーム</td></tr><tr><td>NADH FLIM フィルター</td><td>Chroma</td><td>284994</td><td>ET 440/80 m-2P</td></tr><tr><td>Nair</td><td>CVS</td><td>339826</td><td>脱毛クリーム</td></tr><tr><td>対物レンズヒーター</td><td>東海ヒット</td><td>STRG-WELSX-SET</td><td></td></tr><tr><td>SHG/FAD フィルター</td><td>Chroma</td><td>320740</td><td>ET450/40m-2P</td></tr><tr><td>スパークル ガラス クリーナー</td><td>Amazon.com</td><td>B00814ME24</td><td>MIW</td></tr><tr><td>SPC-150 フォトン カウンティング ボード</td><td>ベッカーとヒックル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サージカル ライト</td><td>FAJ</td><td>B06XV1VQVZ</td><td>磁気 LED グースネック ライト</td></tr><tr><td>手術用マイクロハサミ</td><td>エクセルタ</td><td>366</td><td>ステンレス、3 インチ</td></tr><tr><td>トリプル 抗生物質軟膏</td><td>ActavisPharma</td><td>NDC 0472-0179-34</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>テレビカテーテル</td><td>カスタム</td><td>BD 30G針:</td><td>テレビ注射用305106カテーテル</td></tr><tr><td>2光子フィルター</td><td>クロマ</td><td>320282</td><td>ET585/65m-2P</td></tr><tr><td>2光子レーザー</td><td>コヒーレントシャルメレオン</td><td></td><td>チューナブル多光子レーザー</td></tr><tr><td>超音波ゲル</td><td>パー</td><td>カーPKR-03-02</td><td>水浸ゲル</td></tr><tr><td>尿素クリスタルシ</td><td>グマ</td><td>U5128-5G</td><td>オプション:FLIM IRF</td></tr></tbody></table>

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

生きた腫瘍微小環境内の多数の細胞型と細胞外マトリックス(ECM)との間の複雑で動的な生理学的相互作用を視覚化する能力は、腫瘍の進行を調節するメカニズムを理解するための重要なステップである。これは、現在の生体内イメージング技術によって達成することができますが、組織の不均一な性質と実験観察内の空間的文脈の必要性のために、依然として困難です。この目的のために、我々は、コラーゲン第二高調波発生イメージング、代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光、および腫瘍微小環境を腫瘍巣、周囲の間質またはECM、および血管系の基本ドメインに非侵襲的に区画化する手段としての蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)を組み合わせたイントラバイタルイメージングワークフローを開発しました。この非侵襲的プロトコルは、乳腺腫瘍モデルのタイムラプス画像の取得から後処理分析および画像セグメンテーションに至るまで、段階的なプロセスを詳述しています。このワークフローの主な利点は、代謝シグネチャを利用して、外因性蛍光標識を使用せずに動的に変化する生腫瘍微小環境をコンテキスト化することで、ヒト患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび外因性蛍光色素分子が容易に適用できない将来の臨床使用に有利になることである。

MIWのインストールと基本的な実験計画は、このプロセスの最初のステップです。この特定のMIW設計およびプロトコルは、縦断的研究19 により適しており、直立顕微鏡および倒立顕微鏡の両方で首尾よく利用されている。この場合、倒立顕微鏡は、より少ない呼吸アーチファクトで乳腺のより大きな画像安定性をもたらしたので、使用された。 図1Aでは、剛体MIWの寸法と移植プロセスのグラフィカルな概要を示しています。
ラベルフリーのMMTV-PyMT39乳腺腫瘍(図1B-E、図3A)内の典型的な視野は非常に不均一であり、コラーゲン線維、多数の間質細胞、腫瘍細胞の塊、および血管系(図3A)からなる。 一般に、コラーゲン線維は窓の近くでより豊富...

ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

生体内イメージングは、腫瘍微小環境内の生理学的相互作用を観察することを可能にします。そしてこの方法を使用することによって、観察される特定の動的挙動を、局所組織特徴を用いて区画化することができる。このプロトコルは、コラーゲン線維または自己蛍光代謝産物からのユビキタスな標識フリーシグナルのみを使用してTMEをセグメント化し、それによってマウスへの操作の量を最小限に抑えます。この方法は、細胞外マトリックス構造または血管構造に対する動的相互作用の理解が必要とされるあらゆる生体内システムに広く適用可能である。この手順を実演するのは、上級研究スペシャリストのDave Inmanと、研究室の大学院生であるErica Hoffmannです。1.5 12ミリメートルの丸いカバーガラスを100%エタノールに10分間浸すことによって乳房イメージング窓カバーガラスの準備を開始し、次にヒートランプの下でカバーガラスを乾燥させ、シアノアクリレート接着剤を使用してガラスを金属乳房イメージング窓枠に固定する。接着剤を一晩硬化させる。翌日、アセトンを浸した綿棒を使用して、余分な接着剤の組み立てられた乳房造影窓を洗浄してから、乳房造影窓を70%エタノールに少なくとも10分間沈めてクレンジングを補助する。乾燥後、洗浄した乳房画像窓を滅菌ペトリ皿に保管する。窓移植の手術を開始する前に、手術器具をオートクレーブし、70%エタノールで表面を消毒する。滅菌フィールドで覆われた温かい毛布で手術のために消毒された卓上を準備します。滅菌フィールドの上部で測定された温度が摂氏40度になるように温め毛布をセットします。外科手術には補助的な冷たい照明と虫眼鏡を使用してください。滅菌使い捨てのラボコート、手術用スリーブ、手袋、目の保護具、フェイスマスクからなるPPEを着用してください。次に、第4鼠径乳腺の麻酔マウスの毛皮を脱毛クリームで除去し、滅菌水浸しガーゼで手術部位をすすいだ。次に、脱毛した手術部位を3つの交互のベタジンおよびエタノールスクラブで皮膚表面を消毒することによって手術用に準備する。完了したら、鉗子を使用して乳腺番号4の皮膚を優しく持ち上げます。皮膚が体壁から引き離されたら、外科用マイクロハサミで鉗子の先端にある真皮層の1ミリメートルの部分を取り除く。下腺を切断することなく、10ミリメートルの切開を作成し、鉗子の穏やかな動きで真皮層から乳腺を解放する。PBSを追加して、露出した腺を覆います。5-0の絹編組縫合糸を使用して、開口部の周囲に沿って財布の紐縫合糸を作成し、真皮層が乳房画像窓の受容ノッチに係合するように乳房画像窓の端を挿入する。乳房造影窓の反対側の端で上皮を伸ばしながら、真皮層が乳房造影窓周全体の周囲に受容ノッチを完全に係合するように金属製の乳房造影窓を所定の位置に押し込む。次に、財布の紐を締めて真皮層をノッチに引き込み、層を結び付けて窓を固定します。乳腺イメージングウィンドウの真皮層に局所抗生物質を塗布し、マウスを継続的に監視する。胸骨臥位を維持するのに十分な意識を取り戻した後、ケージに入れたイグルーでマウスを柔らかい寝具に別々に移植した乳房イメージングウィンドウを収容し、マウスがイメージングする前に48時間回復できるようにします。イメージングには、摂氏 30 度に設定された強制空気システムを使用します。追加の対物ヒータを使用してZフォーカスのドリフトを回避し、イメージング前にシステムが摂氏30度で少なくとも1時間平衡状態になるようにします。その後、顕微鏡ステージ上に加熱室を設置します。つま先ピンチ法で麻酔を確認した後、マウスに眼軟膏を加える。適切な水分補給を維持するために、イメージングセッションの間、2時間ごとに0.5ミリリットルのPBSを皮下に注入します。水の代わりに水性ゲルを対物レンズに塗布し、マウスを予め温めた顕微鏡ステージに移す前に、綿アプリケーターとガラスクリーナーで乳房イメージング窓ガラスの外側をきれいにする。顕微鏡ステージ上にマウスを置いた後、乳房撮像窓の襟をステージインサートの14ミリメートルの受け穴に押し込んで画像を安定させ、イソフルランホースをフィットさせる。その後、顕微鏡眼球とブライトフィールド照明を用いて撮像視野を合焦させ、血流を伴う血管系を観察した。視野の安定性を確認します。呼吸運動アーチファクトが存在する場合は、小さなフォームブロックとチンキのような粘着テープで腺の裏側に穏やかな圧縮を適用します。圧縮を適用した後、視野全体で血流が維持されていることを確認します。マウスを鎮静させ、倒立顕微鏡ステージ上にしっかりと配置したら、関心領域の位置決めを開始します。乳腺の画像化窓に向けられた光源を使用して、顕微鏡の眼球を使用して、調査のための潜在的な領域を特定する。焦点は血管系と血流を見ることであるべきです。ソフトウェアにXY位置を追加して保存します。適切なパワーレベルを設定したら、Zスタックをセットアップし、乳房イメージングウィンドウのガラス表面下20〜50マイクロメートルで豊富なコラーゲン線維の外観を観察します。コラーゲンは、顕微鏡が腫瘍の奥深くに切片化するにつれて、り普及しなくなります。第二高調波発生またはSHGの空隙は、腫瘍塊の位置を明らかにする。50〜100ミクロンで現れる最初のコラーゲン線維を有する孤立細胞の層の下に上部Zスライスを設定する。下部のZスライスを250マイクロメートルに設定し、ファイバがフェードアウトして信号不良が支配的になります。次に、保存されたすべての XY ポジションに対してこの手順を繰り返します。Zスタック範囲を設定したら、滞留時間を8マイクロ秒に増やし、電力と検出器の設定を最適化します。各実験で組織を励起するために必要な電力レベルを最適化し、目標の背面開口部で750ナノメートルで最大90ミリワット、または890ナノメートルで70ミリワットの電力を使用します。次に、ほとんどの重要内移行ムービーの収集ポイント間の 10 分間隔から開始し、実験目標に従って時間間隔を調整します。細胞のブレビングや自己蛍光の急激な増加、過剰なフォトブリーチングなどの光毒性の兆候が観察された場合は、条件が示すようにレーザー出力を減らすか、タイムラプス間隔を増やしてください。NADPHの蛍光寿命イメージングまたはFLIMの場合、プレビュースキャンを開始し、定分率弁別器またはCFDの読み出しが10〜5番目、10〜6番目になるまでレーザーパワーを調整します。CFDを10を超えて6番目を超えると、光子の蓄積と全体的な結果が悪くなります。電力レベルを設定したら、積分時間を90~120秒に設定し、FLIMコレクションを開始して、割り当てられた時間の間、視野から光子を取得します。ラベルのない乳腺腫瘍内の典型的な視野は、窓の近くに豊富なコラーゲン線維および腫瘍の奥深くまでの存在量の減少を示した。蛍光寿命またはNADPHの使用は、血管系の同定に役立った。画像内のいくつかの暗い領域は、腫瘍のひだまたは隣接する腫瘍葉の突き合わせであった。血管系を同定するために、NDPH FLIMを用いた合成画像を、蛍光デキストランの尾静脈注入前後の生体内スタックの最大強度投影を比較することによって検証した。代表的な解析は、4匹のマウスの定量化と視野を示す。標識のない腫瘍塊の境界を描くために、NADPH自己蛍光が用いられた。画像は、細胞の代謝シグネチャと血管の位置を報告した。AFDの自己蛍光はまた、マクロファージを同定した。セグメンテーションスキームを用いて、標識のない腫瘍を、SHGおよびNADPH自己蛍光のみを用いて腫瘍巣、間質、および血管系のための区画にセグメント化した。さらに、間質およびコラーゲン線維を、整列した線維の局所領域に分類することもできる。このプロトコルで覚えておくべき最も重要なことは、視野がイメージングに対して安定したままであるように、マウスが適切に鎮静化および拘束されていることを確認することです。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

我々は、抗癌治療への応答のイメージングのための方法を説明...

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

トランスジェニックレポーターマウスと注射可能な蛍光標識を使用することにより、長期の生体内スピニングディスク共焦点顕微鏡法は、ApcMin/+結腸直腸癌モデルにおける骨髄細胞の挙動を腸腺腫に直接可視化することを可能にします。...

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージングのApc最小/ +腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

このプロトコルは、単一細胞の解像度で、生体内で 、リアルタイムで多細胞相互作用の延長タイムラプスイメージングを実行するための多光子顕微鏡の使用を記載しています。...

腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

このプロトコルは細胞特異的蛍光マーカーを発現するトランスジェニック マウスの生体イメージングを説明します。生体イメージングは、プロセスの顕微可視化が可能な埋込型の windows...

腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

マウスにおける高分子量(155kDa)デキストランの静脈注射を用いて、転移(TMEM)戸口機能および癌細胞イントラバシスの腫瘍微小環境に関連する一過性血管透過性を評価する2つの方法について述べた。この方法には、生きた動物におけるインビタルイメージングと免疫蛍光を用いた固定組織分析が含まれる。...

インビタルイメージングと固定組織解析を用いた癌細胞播種に伴う転移戸管媒介血管透過性の腫瘍微小環境の評価

ここでは、血液脳関門転移性腫瘍微小環境を調製し培養し、共焦点イメージングと人工知能(機械学習)を用いてその状態を定量化するためのプロトコルを提示する。...

臓器オンAチップ3Dモデル、機械学習、共焦点断層法による脳転移性腫瘍微小環境の定量化

このプロトコルは、交換可能な蓋(R.MIW)を備えた新しい乳房イメージングウィンドウを記述しています。R.MIWの移植後の生体内顕微鏡検査は、異なる発達段階の間に細胞分解能を有する健康および罹患した乳腺の縦方向および複数日のイメージングを可能にする。...

交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを使用した縦方向のバイタル内顕微鏡

本プロトコルは、授乳中のマウス乳腺の生体内イメージングのための容易な技術を、レーザー走査型共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡法によるものとして記述している。...

乳腺の生体内細胞内顕微鏡検査

この原稿は、同所注射された乳房腫瘍からの自然肺転移の確立および縦断的成長モニタリングの方法論を説明しており、転移カスケードのすべての段階での介入に適しています。...

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。...

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

学ぶラベルフリー生体内イメージング法で乳腺腫瘍微小環境を腫瘍・間質・血管に分節化する技術。コラーゲン二次高調波とNAD(P)H自己蛍光を用い、マウスへの侵襲を最小限に抑えた非侵襲的解析が可能です。

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

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