植物-真菌相互作用におけるペクチンを検出する二重染色法

このプロトコルは、植物 - 真菌相互作用を同定することを可能にするので重要である。ペクチンを着色することに加えて、それはまた病原体細胞壁ポリマー上の欠陥を示し、真菌構造の同定を可能にする。このシンプルで単純な技術は、光学顕微鏡を使用して実行することができ、走査型電子顕微鏡などの高価な機器を必要としません。

さらに、それは組織病理学的研究のための植物構造の優れた区別を得る速い技術である。この技術は、植物 - 真菌相互作用を識別する。したがって、コーヒーサビやセルコスポリア症などの生物栄養性および壊死性真菌によって引き起こされる疾患を診断するために協力しています。

まず、メスとピンセットを用いて病変部の中央領域で約10平方ミリメートルの葉サンプルを収穫し、30ミリリットルのカルノフスキー固定液に浸漬する。葉サンプルをオイルポンプを用いて500〜600ミリバールの低真空に15分間供し、葉組織における固定液の透過性を高めるために少なくとも4倍にする。固定後、葉サンプルを蒸留水で希釈した0.5 Mカコジル酸緩衝液でそれぞれ5分間3回洗浄し、その後、各エタノール濃度で15分間、段階的なエタノール系列に移した。

サンプルをグリコールメタクリレートに徐々に移すには、1グラムのグリコールメタクリレート粉末を磁気攪拌下で100ミリリットルの塩基性樹脂と混合して溶液Aを作る。次いで、A液と100%エタノールの比率で試料を1対2で3時間浸漬する。溶液A:100%エタノールに対してサンプルを1対1の比率で3時間浸漬し、次いで純粋な塩基性樹脂に2〜4日間浸漬する。

試料を1日4回、15分間、少なくとも1日4回低真空に供し、次いで回転させる。15ミリリットルの溶液Aと1ミリリットルの硬化剤をビーカーに2分間回転させて混合し、重合溶液Bを製造し、この重合溶液Bの1.2ミリリットルをプラスチック金型に入れます。木製のピックを使用して、病変した葉のサンプルを純粋な塩基性樹脂から溶液Bに移し、ピンセットは組織破砕を引き起こす可能性があるため、ピンセットの使用を避けてください。

溶液Bがすぐに粘性になるので、葉のサンプルをプラスチック金型に対して垂直に素早く向けるようにしてください。葉のサンプルの垂直配向が達成されたら、30分間待ってから、湿気を防ぐためにシリカゲルを含むプラスチックまたはガラスチャンバにプラスチックモールドを移す。2〜3時間後に樹脂と葉サンプルが重合したら、ブロックベースをサンディングヤスリでサンディングして、得られたブロックをプラスチックモールドから取り外します。

次に、ブロックを木片に接着します。8センチメートルのスチールブレードを備えた回転マイクロトームを使用して、ブロックを5マイクロメートルの厚さのセクションに切断します。蒸留水で覆われたスライドガラスの上に切片を置きます。

その後、スライドをホットプレートに移して摂氏40度で乾燥させ、スライドガラスへの切片の接着を促進します。乾燥後、スライドガラスにブロック参照名とスライド番号のラベルを付けます。ラクトフェノールの5%コットンブルーの2ミリリットルで切片を覆い、摂氏45度のホットプレートで5分間加熱する。

蒸留水を満たしたビーカーでスライドを3回洗浄して余分な染料を除去します。2ミリリットルの0.01%ルテニウムレッドで1分間水に染めます。蒸留水を満たしたビーカーでスライドを3回洗浄して余分な染料を除去します。

切片の上に蒸留水1滴を入れ、光学顕微鏡分析を行うためのカバースリップで切片を覆う。二重染色法では、細胞壁および緻密なプロトプラスト含量を含むヘミレイア・バスタトリクス菌糸は、海綿状および柵状の実質の両方において濃い青色に見えた。ハウストリウム母細胞とハウストリアも濃い青色を呈した。

ルテニウムレッドによるカウンター染色は、細胞間空間における真菌分布を明確に定義した。相互作用の間、ヘミレイア・バスタトリックス・ハウスストリウム母細胞は宿主細胞壁を壊し、ペクティック化合物に囲まれたハウストリアルネックを発達させた。ペクチンが豊富なピンクレッド色のハウストリアルネックのカプセル化は、ハウストリアル形成を防ぐことはできません。

場合によっては、ペクチンが豊富なカプセル化がハウストリウムを不完全に包み込んだ。そして場合によっては、ハウストリアムは完全にカプセル化されています。ペクチンに富む細胞壁は、真菌が存在しない病変境界で完全性を維持する。

二重染色法は、細胞間菌糸の存在を実証した。相互作用ゾーンでは、ペクチン細胞壁は溶解のために完全性を失うように見えた。分生子などの生殖構造は、副軸表皮に見出された。

Cercospora coffeicola 菌糸は、カール構造として気底室に見出され、病変領域の柵実質は細胞壁溶解を受けるようである。ピンセットは組織の破砕を引き起こす可能性があるため、使用しないでください。錆、炭疽菌、セルコスポリオーシス、スマットおよび他の生物栄養性、ヘミ生物栄養性、および壊死性植物 - 真菌相互作用に関するさらなる組織病理学的研究を実施して、異なる病態系におけるこの技術の潜在的な使用を調査するべきである。