Name: げっ歯類の外科的緑内障に対する辺縁血管神経叢の全周焼灼 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ、ラットを用いた緑内障モデルで網膜神経節細胞の変性機構を解明する方法。眼圧上昇を誘導し、視機能と組織学的変化を評価することで、神経変性疾患の病態生理学研究に貢献します。

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私たちは、検査技師のホセを認めます。ニルソン・ドス・サントス、ダイアン・マンダリーノ・トーレス、ホセ・フランシスコ・ティブルシオ、ジルド・ブリト・デ・ソウザ、ルチアーノ・カヴァルカンテ・フェレイラ。この研究は、FAPERJ、CNPq、およびCAPESから資金提供を受けました。

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著者は何も開示していません。

辺縁神経叢焼灼術(LPC)は、結膜やほぞの解剖を必要としない、簡単にアクセスできる血管構造を標的にするという利点を備えた新しい海綿後モデルです17,28。脈絡膜静脈ドレナージの外科的障害に基づく有名なOHTモデルである渦静脈焼灼モデルとは異なり、静脈うっ血はLPCモデルでは、静脈静脈が房水流出の上流に位置するため、IOPの上昇に影響を与えると予想されます。また、技術的に習得が容易で低コストであるため、主に低温の熱焼灼が必要です。さらに、OHT誘導と完全な臨床的回復率(以前に報告されたように>90%)23と関連しており、実験に必要な動物の数を減らし、電気生理学的および行動学的分析の両方を可能にします。最後に、緑内障性変性は、手術後の比較的短い時間枠でRGC層と視神経の両方に存在し、短期または中期の実験計画を可能にします23。個々の網膜層に対する全円輪状血管系焼灼の影響をさらに解明するには、今後の研究が必要です。
<p c...

医学文献では、緑内障は、網膜神経節細胞(RGC)、樹状突起、体細胞、および軸索の進行性変性を特徴とする視神経障害の不均一なグループとして理解されており、その結果、視神経の構造的カッピング(発掘)と視神経の機能低下が起こり、眼から脳への視覚情報の伝達を中断することにより、制御されていない症例で黒内障を引き起こします1.緑内障は現在、世界中で不可逆的な失明の最も一般的な原因であり、2040年には約1億1,180万人に達すると予測されており2、患者の生活の質(QOL)に深く影響し、重大な社会経済的懸念を引き起こしています3。
眼圧の上昇(IOP)は、緑内障の発症と進行にとって最も重要で唯一の修正可能な危険因子の1つです。複数のタイプの緑内障のうち、正常緊張緑内障(NTG)を除くすべての緑内障は、疾患の病歴のある時点でIOPの上昇に関連しています。眼圧を標的とし、疾患の進行を遅らせたり止めたりするための臨床的および外科的進歩にもかかわらず、患者は依然として緑内障のために視力を失います4,5。したがって、この疾患の複雑で多因子的な病態生理学を完全に理解することは、より効果的な治療法の開発、特にRGCに神経保護を提供するために不可欠です。
疾患のメカニズムを理解するためのさまざまな実験的アプローチの中で、高眼圧症(OHT)に基づく動物モデルは、ヒトの緑内障に最もよく似ています。げっ歯類モデルは、低コストで、取り扱いが容易で、遺伝子操作が可能で、寿命が短く、房水の産生や排液など、人間に匹敵する眼の解剖学的および生理学的特徴を示すため、特に有用です6,7,8,9,10,11,12,13 .現在使用されているモデルには、強膜上静脈への高張生理食塩水の注入後の線維柱帯の硬化症14、マイクロビーズ15または粘弾性物質のカメラ内注入16、渦静脈の焼灼17、アルゴンレーザー18、辺縁周囲縫合糸19による線維柱帯網膜の光凝固、および加齢性OHT(DBA/2Jマウス)のトランスジェニックモデルの使用が含まれます8.しかし、侵襲性、角膜の術後混濁、前眼部の破壊、広範な学習曲線、高価な機器、および術後IOPの変動は、現在のモデルに関連する報告された落とし穴のいくつかであり、OHTの代替モデルの開発は、これらの問題を克服するための要求となっています20,21,22。
本プロトコルは、げっ歯類の辺縁神経叢焼灼術(LPC)に基づいて、緑内障の代理としてOHTを誘発する新しい外科的処置を形式化します23。これは、簡単で再現性が高く、アクセスしやすく、非侵襲的なモデルであり、高効率でIOP上昇の変動性が低く、完全に臨床的に回復する割合が他に類を見ないため、各実験で使用される動物の数を減らしてin vivo で機能評価を行うことができます。手術技術は亜急性OHTを誘発し、数日でベースラインレベルに徐々に戻り、急性閉塞隅角緑内障で見られる高血圧発作をモデル化します。さらに、モデルにおける眼圧回復に続いて、緑内障性神経変性が持続し、これは、眼圧の適切な制御にもかかわらず、ヒト緑内障のいくつかの症例で発生するRGCの二次変性の将来の機構研究に有用である。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>イソファー</td>ル <td>201</td><td>電子顕微鏡検査用組織調製に使用(ステップ5)</td></tr><tr><td>網膜電図用能動電極</td><td>ハンソルメディカル Co</td><td>-</td><td>ステンレス製針 0.25 mm &times; 15 mm</td></tr><tr><td>Anestalcon</td><td>Novartis Bioci&ecirc;ncias S/A</td><td>MS-1.0068.1087</td><td>Proxymetacaine 塩酸塩 0.5%</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Vetec</td><td>560</td><td>電子顕微鏡組織調製に使用(ステップ5)</td></tr><tr><td>Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td>低温眼科焼灼</td></tr><tr><td>Cetamin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>000200-3-000003</td><td>ケタミン塩酸塩 10%</td></tr><tr><td>DAKO</td><td>Dako North America</td><td>S3023</td><td>色あせ防止封入剤</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28718-90-3</td><td>ジアミジノ-2-フェニルインドール; 青色蛍光核対比染色; 452&plusmn;3 nm</td></tr><tr><td>エコフィルム</td><td>クリスト&aacute;lia Produtos Qu&iacute;micos Farmac&ecirc;uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0487</td><td>カルメロースナトリウム0.5%</td></tr><tr><td>EPON樹脂</td><td>Polysciences、Inc.</td><td>-</td><td>電子顕微鏡に使用されるエポキシ樹脂で、4つの試薬の混合物で構成されています:Poly/Bed 812樹脂(CAT#08791);DDSA - 無水ドデセニルコハク酸 (CAT#00563);NMA - 無水ナディックメチル (CAT#00886);DMP-30 - 2,4,6-トリス(ジメチルアミノメチル)フェノール (CAT#00553)</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16110</td><td>電子顕微鏡組織調製に使用 (ステップ5)</td></tr><tr><td>Hyabak</td><td>Uni&atilde;o Qu&iacute;マイカFarmac&ecirc;utica Nacional S/A</td><td>MS-8042140002</td><td>ヒアルロン酸ナトリウム 0.15%</td></tr><tr><td>Icare Tonolab</td><td>Icare Finland Oy</td><td>TV02 (型番)</td><td>リバウンド手持ち眼圧計</td></tr><tr><td>IgG ロバ 抗マウス抗体 + Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31570</td><td>二次抗体溶液</td></tr><tr><td>液晶モニター 23インチ</td><td>サムスン電子株式会社</td><td>S23B550</td><td>モデルLS23B550、網膜電図記録用、</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta</td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>共焦点落射蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>Maxiflox</td><td>Crist&aacute;lia Produtos Qu&iacute;micos Farmac&ecirc;uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0489</td><td>Ciprofloxacin 3.5 mg/g</td></tr><tr><td>MEB-9400K</td><td>日本光電株式会社</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルIgG1マウス抗Brn3a</td><td>ミリポアシグマ</td><td>MAB-1585</td><td>Brn3a 一次抗体溶液</td></tr><tr><td>Neuropack Manager v08.33</td><td>日本光電株式会社</td><td>-</td><td>網膜電図信号処理</td></tr><tr><td>用ソフトウェアOptomotry</td><td>CerebralMechanics-System</td><td></td> <td>for optomotor response analysis</td></tr> 四<tr><td>酸化オスミウム</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>19100</td><td>電子顕微鏡組織調製に使用(ステップ5)</td></tr>フェ<tr><td>ロシアン化カリウム</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>20150</td><td>電子顕微鏡組織調製に使用(ステップ5)</td></tr><tr><td>網膜電図検査用の参照電極と接地電極</td><td>Chalgren Enterprises</td><td>110-63</td><td>ステンレス鋼針 0.4 mm &times; 37 mm</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム緩衝液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12300</td><td>電子顕微鏡組織調製に使用 (ステップ 5)</td></tr><tr><td>Ster MD</td><td>Uni&atilde;o Qu&iacute;マイカFarmac&ecirc;utica Nacional S/A</td><td>MS-1.0497.1287</td><td>プレドニゾロンアセテート 0.12&percits</td></tr> <tr><td>Terolac</td><td>Crist&aacute;lia Produtos Qu&iacute;micos Farmac&ecirc;uticos Ltda</td><td>MS-1.0497.1286</td><td>Ketorolac trometamol 0.5%</td></tr><tr><td>Terramicina</td><td>Laborat&oacute;rios Pfizer Ltda</td><td>MS-1.0216.0024</td><td>オキシテトラサイクリン塩酸塩 30 mg/g + ポリミキシン B 10,000 U/g</td></tr><tr><td>Tono-Pen XL</td><td>Reichert Technologies</td><td>230635</td><td>デジタル圧平ハンドヘルド眼圧計</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T3605</td><td>遠赤色蛍光核対比染色; 661 nm で発光</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>22400</td><td>電子顕微鏡組織調製に使用(ステップ5)</td></tr><tr><td>Xilazin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>7899</td><td>塩酸キシラジン 2%</td></tr><tr><td></td><td>カールツァイス</td><td>-</td><td>手術および網膜解剖用のステレオ顕微鏡</td></tr></tbody></table>

げっ歯類の外科的緑内障に対する辺縁血管神経叢の全周焼灼

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

緑内障は、世界の失明原因の第2位であり、視神経と網膜神経節細胞(RGC)の変性に構造的損傷があり、眼から脳への視覚情報の伝達が遮断されることにより視覚機能障害を引き起こす不均一な眼疾患群です。眼圧の上昇は最も重要な危険因子です。したがって、高眼圧症のいくつかのモデルは、病気の原因と影響を調査するために、遺伝的または実験的アプローチのいずれかによってげっ歯類で開発されています。それらの中で、外科的侵襲性、不十分な機能評価、広範なトレーニングの必要性、網膜損傷の非常に変動の大きい拡張など、いくつかの制限が報告されています。本研究は、房水ドレナージの主要成分である辺縁血管神経叢の低温全円焼灼に基づく、げっ歯類に高眼圧症を誘発する単純で低コストかつ効率的な方法を特徴付ける。この新しいモデルは、進行性のRGCおよび視神経変性に関連する、技術的に簡単で非侵襲的で再現性のある亜急性高眼圧症と、電気生理学的および行動学的方法の両方による in vivo 機能研究を可能にする独自の術後の臨床回復率を提供します。

量的変数は、平均±平均の標準誤差(SEM)として表されます。OHT群と対照群の眼圧動態の比較(図1F)を除き、統計解析は二元配置ANOVAとそれに続くSidakの多重比較検定を用いて行った。p値&lt;0.05は統計的に有意であると見なされました。
図1 は、全円輪姦焼灼術(LPC)モデルの外科的手順を示しており、360°の熱による辺縁血管の消失や、手術終了時の手術眼の軽度から中等度の散瞳などの重要なランドマークがあります。
131匹のラットの現在のシリーズでは、全円輪部神経叢焼灼術(LPC)により、手術直後にベースラインで13.0 ± 0.2 mmHgから22.7 ± 0.4 mmHgまでIOP上昇が誘発されました。.術後IOPのピークは手術初日(25.3 ± 0.6 mmHg)に観察され、その後、術後6 日目にベースラインレベルに徐々に戻りました(統計分析:Holm-Sidak法を使...

このプロトコルの目的は、緑内障性神経変性の新しいモデルを特徴付けることです 辺縁血管神経叢の360°熱焼灼に基づいて、亜急性高眼圧症を誘発します。

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

我々は、一時的な眼圧上昇に基づいて、強固で進行性の緑内障変性を誘発する簡単な方法を開発しました。これは、緑内障の病態生理学のキーポイントを研究するまたとない機会です。本モデルは、1回の実験で少ない数で生体内機能解析や短期間の実験計画を可能とする、学習が容易で非侵襲的、低コスト、再現性の高いモデルです。網膜と視神経は中枢神経系の評価可能な部分であるため、これらの構造の進行性の障害をモデル化することで、他の神経変性疾患に関する貴重な洞察を得ることができます。実験的および対側対照眼の両方のベースライン眼圧(IOP)を測定するには、麻酔をかけたラットをベンチトップの腹側褥瘡の位置に置き、角膜表面が眼圧計の先端に簡単にアクセスできるようにします。.眼圧計の先端が角膜中央部に垂直にわずかに接触するように配置します。次に、測定ボタンを押して測定値を取得します。次に、実体顕微鏡下でラットをわずかに側方褥瘡の位置に置き、40倍の倍率で実験眼を検査します。処置中は、カルメロースナトリウムまたはヒアルロン酸ナトリウムを一滴点滴注入して、反対側のコントロールアイを潤滑状態に保ちます。次に、湾曲した鉗子を使用して、実験眼球をそっと前方に押して、辺縁部の360度を取り巻く血管系を露出させます。次に、もう一方の手で、低温の眼科用焼灼を使用して、角膜の周りの血管全体を優しく焼灼します。角膜末梢を焼灼しないように注意してください。強膜辺縁部に焼灼の小さな円形の痕跡が現れ、辺縁血管系が抹消され、手術眼の瞳孔が散大していることを観察して、外科的処置の成功を確認します。手術後、先に示したように、両眼の術後直後の眼圧を確認します。次に、眼科用酢酸プレドニゾロンを実験眼の前面に一滴塗布します。40秒後、眼科用抗生物質軟膏と交換します。非ステロイド性抗炎症薬と抗生物質軟膏で構成される局所薬による実験眼の毎日の臨床フォローアップを適用します。視運動反応解析では、4台のコンピューターモニターを四角形に並べたプラットフォームに、馴化用のラットを置きます。赤い十字カーソルは、仮想円柱の中心を示すため、自由に動くネズミの目の間のビデオフレームに保持します。回転するグレーディングによって誘発されるラットの頭頸部の反射的追跡からなる視運動反応を観察します。最初に、空間周波数の低い刺激を導入し、その後、トラッキングの動きに気づかなくなるまで周波数を徐々に上げます。パターン網膜電図を記録するには、ラットに麻酔をかけた後、角膜の側頭末梢に活性電極を慎重に挿入する。さらに、参照電極を同側側頭骨の皮下組織に挿入し、接地電極を後肢の1つに挿入します。次に、ラットを刺激スクリーンから20cmの位置に配置し、信号ベースラインをモニターし、アクイジションシステムのAnalysisボタンを押してアクイジションを開始します。網膜を単離した後、網膜内を上向きにした状態で、1ミリリットルのPBSを含む24ウェル培養プレートに網膜を移します。PBSで希釈した0.5%非イオン性界面活性剤で洗浄することにより、組織を透過処理します。次に、組織とブロッキング溶液を室温で穏やかに振とうしながら1時間インキュベートします。インキュベーション中に、Brn-3a一次抗体溶液を調製し、摂氏4度で保存します。組織ブロッキング後、網膜を200マイクロリットルの一次抗体溶液中で摂氏4度で72時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。次に、組織をPBSで洗浄します。200マイクロリットルの二次抗体溶液中で組織を室温で2時間インキュベートし、次いで核カウンター染色液で10分間インキュベートして蛍光核染色を行います。PBSを3回洗浄した後、硝子体側を上にしたまま、2つの小さなブラシを使用して網膜をガラス顕微鏡スライドに移します。網膜背側象限を顕微鏡スライド上に配置します。最後に、200マイクロリットルの褪色防止剤をガラスカバースリップに塗布し、平らに取り付けられた網膜に置いて顕微鏡分析を行います。共焦点落射蛍光顕微鏡下で、40倍の拡大対物レンズを使用して、網膜神経節細胞を推定するためにフラットマウントを調べます。眼球摘出術後、眼内部分の一部を含む視神経の眼窩内部分の近位部分を切除する。次に、サンプルを200〜300マイクロリットルの低温固定剤を含むバイアルまたはチューブにすぐに入れます。2時間後、冷たい100マイクロモルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で組織を洗浄します。次に、1%四酸化オスミウムと5ナノモルの塩化カルシウムに4°Cで1時間、穏やかに振とうしながら組織を固定します。冷たいカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄した後、視神経断片を冷たい蒸留水で洗浄してから、摂氏4度で一晩、尿中の酢酸1%をインキュベートします。翌日、水で3回洗浄した後、アセトン濃度を上げて組織を徐々に脱水します。次に、組織を純粋なエポキシ樹脂に包埋する前に、包埋とエポキシ樹脂アセトン溶液を3回行い、24時間行います。翌日、試料担体からサンプルを取り出し、60°Cで48時間包埋型に移します。重合後、ウルトラミクロトームを使用して、視神経片の横方向の半薄切片を切断します。次に、切片を採取し、顕微鏡スライドガラスに転写します。切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で100倍の倍率で画像化します。超微細構造解析では、極薄断面を実行し、銅グリッド上に収集します。次に、便器の酢酸とクエン酸鉛で切片を染色し、透過型電子顕微鏡検査を行います。全周焼灼は、対照眼と比較して、手術直後に眼圧上昇を誘発した。術後眼圧のピークは1日目に観察され、6日目にベースラインレベルまで徐々に減少しました。さらに、網膜機能は、それぞれ視運動反射とパターン網膜電図を使用して行動学的および電気生理学的に評価されました。手術後、両方のパラメータは、3日目の高眼圧急性期と30日目の二次変性期という2つの異なる段階の障害を示しました。対照視神経と比較して、軸索数および半薄の横視神経切片は手術後に徐々に減少した。対照眼からの視神経の透過型電子顕微鏡写真は、薄いグリア細胞突起と明らかな軸索微小管およびニューロフィラメントによって分離された密集した有髄線維を示しました。対照的に、高眼圧症の3日後には、いくつかの変性線維、グリア細胞プロセスにおける細胞質空胞化、およびグリア細胞核における凝縮クロマチンが観察された。7日後、変性軸索線維および高張性グリア細胞突起が増加した。そして14日後、軸索間のグリア細胞突起の侵入に関連する視神経線維のさらなる乱れが観察された。さらに、網膜神経節細胞の密度は、主に背側および側頭網膜象限において経時的に減少した。この手順を実行している間、焼灼の先端で辺縁血管にそっと触れるようにし、臍帯の周辺を温存し、強膜の辺縁全体に継続的な焼灼の跡が観察されるようにします。この手順に続いて、眼構造の機能的生化学的および免疫組織化学的評価、および緑内障の生理病理学を認める可能性のある他の方法など、さまざまな方法を適用できます。

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