中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系

生体試料のセカンドハーモニックジェネレーションイメージングは、タグや色素を必要とせずに非中心対称分子とその集合体の可視化を可能にする光学技術です。この方法で生成された画像は、ハーモナル力として作用できる生体分子がほとんどないため、バックグラウンドが低くなっています。このプロトコルは、taiep動物モデルにおけるチューブリンβ-4Aの画像診断のための技術の適用を記載する。

尿細管症は最近記載されている疾患です。このため、細胞レベルでの病態生理の根底にある基本的なメカニズムについては、限られた量の情報が利用可能です。まず、パルスレーザーをオンにして、最適で安定したパワーレベルでレイズする準備ができていることを確認します。

耳膜微小管を研究するために、利用可能なレーザー出力の10〜20%が使用され、これは記載されたシステムでは、対物レンズの後焦点面で測定された13〜26ミリワットに相当する。イメージングの前に、レーザーを810ナノメートルに回します。次に、顕微鏡が第2高調波発生(SHGイメージング)に使用される対物レンズとケーラーで調整されていることを確認します。

光学検出経路から不要なフィルターを取り外し、コンデンサーダイアフラムが完全に開いていて、光が不必要に停止していないことを確認します。レンズに少量の液浸油を滴下した状態で、25倍×0.8の開口数油浸対物レンズを準備します。コーンスターチの場合は5%未満のレーザー出力を除いて、ここの表に記載されている手順に従います。

スライドガラスで挟まれた乾燥コーンスターチの画像。SHG画像を生成するためのSHGパラメータを使用すると、レーザー偏光方向が明らかになります。まばらなコーンスターチ粒子の1つの画像をキャプチャし、レーザー偏光方向に対応するXY平面内のSHG小葉の向きをマークします。

制御のために、同じサンプルの別の画像を撮影し、光路に半波長板を挿入してレーザーの発振方向を変更します。結果の画像には、回転したSHG信号小葉が表示されます。SHGに別のバンドパスフィルタを使用する場合は、スキャンラインに沿って画像と信号強度をピクセルごとに比較して、最適な伝送特性があることを確認してください。

温かいハンクスバランス塩溶液またはHBSSで満たされたビブラトームバッファートレイを準備します。マスキングテープを介してシアノアクリレート接着剤を使用して脳を標本プレートに固定します。最も尾部は接着剤に接触するため、反対側の吻側部分から使用可能な冠状切片を切断することができます。

試料プレートをバッファトレイ内の磁気サポートに移します。スライスが脳表面全体を取り囲むまで、300〜500ミクロンの切片の切断を開始します。次に、セクションの厚さを160ミクロンに減らします。

160ミクロンの切片が脳梁のレベルで切断されたら、大きなフランジ付きオリフィスを備えた修正ガラスパスツールピペットで回収します。切片を新しい温かいHBSSで清潔なペトリ皿に移すか、顕微鏡検査用のカバースリップまたはガラス底皿に直接移します。サンプルを顕微鏡下に置き、透過光で接眼レンズを通して直接観察することにより、対物レンズの下に適切に配置します。

薄い液体膜がサンプル全体を覆うように、余分なHBSSを取り除きます。サンプルの過度の蒸発と乾燥を避けるために、数分ごとに液膜を目視で確認してください。暗いインキュベーションチャンバーのすべてのドアを閉じるか、インキュベーションチャンバーを黒いナイロンポリウレタンコーティングされた布で覆うなど、非デススキャンイメージング用の顕微鏡ステージを準備します。

伝送パスに沿って非デススキャンイメージングモードを選択します。このようにして、チューブリンの弱いSHシグナルの捕捉が最適化されます。次に、目的を選択します。

次に、ピクセル滞留時間を12.6マイクロ秒のレーザー出力に設定します。512 x 512ピクセル以下の画像を速度5で撮影し、平均2つ、平均取得時間は15秒です。最初に485ナノメートルのショートパスフィルターを使用して画像をキャプチャし、2番目のステップでシャープな405ナノメートルのバンドパスフィルターを追加します。

メスで小脳を2つの半球に切り、中央部分でビブラトームサポートに固定します。脳について説明したのと同じビブラトーム、ブレード、および顕微鏡設定を使用して、小脳を切片化して画像化します。脳梁の線維を画像化すると、線維のような短い構造と丸い要素がタイエップ脳に観察されます。

対照的に、対照脳の脳梁は、脳領域全体ではるかに不均一で等方性の信号を示します。狭帯域フィルタを追加すると、制御画像からの非特異的信号強度が低下するだけであり、常に強いSH光を生成するタイエップ画像のソーマ様および短い細長い構造の周囲からこの低拡散信号を選択的に除去するため、差動信号の起源は特に第2高調波発生現象にあります。小脳白質対照組織では、SHシグナルの完全な消失が観察された。

ショートパスフィルターを使用するとプルキンエ細胞はほとんど見えず、細長く丸みを帯びた構造はタイエップ組織からのSH画像に残ります。最良の画像を得るための重要なステップは、組織切片をできるだけ薄く切断することです。さらに、急性組織切片を扱うには、組織の劣化を防ぐための迅速なプロトコルが必要です。

したがって、事前に光学系をセットアップして確認することが重要です。微小管からの第2高調波信号は、デンプンからの第2高調波信号よりも弱い。したがって、微小管のイメージングには、より多くのレーザー出力を使用する必要があります。

高い開口数対物レンズをイメージングに使用すると、サンプルの強度が急速に増加するため、レーザー出力を慎重に増やす必要があります。 第2高調波発生イメージングでは、尿細管症モデルの中心髄鞘腫の病理学的変化を迅速かつ容易に識別できます。この技術の潜在的な用途には、H-ABCチューブリノパシーの基本的なメカニズムの研究および患者を治療するための薬理学的療法の評価への使用が含まれます。長期的には、この技術は、頭蓋内または新鮮な生検で使用される補完的な診断ツールになる可能性があります。