Name: 中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶ 二次高調波発生顕微鏡を用いたチューブリン依存性欠陥におけるオリゴデンドロサイトのラベルフリー可視化法。この手法は、中枢ミエリンの微小管動態と神経疾患におけるオリゴデンドロサイト機能の理解を深めるのに役立ちます。

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この研究は、Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACYT)によって、次の助成金を通じて支援されました:VP-CIOへのインフラ構造226450、VPへのインフラ構造255277、およびFORDECYT-PRONACES/194171/2020からV.H.。私たちは、ビデオ制作におけるCIOのJuvenal Hernández Guevaraのサポートに感謝します。

記載されているすべての手順は、メキシコ政府の健康研究に関する一般健康法の規則(NOM-062-ZOO-1999)の第7タイトルで承認された法律およびコードに準拠して、および実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所ガイドの勧告に従って行われ、グアナファト大学およびベネメリタ自治大学の研究における生命倫理の制度委員会によって承認されました。 プエブラ。
1. 顕微鏡設定
<ol><li>顕微鏡システムのスイッチを入れます。</li>
	<li>パルスレーザーをオンにして、サンプルの抽出と準備後、最適で安定したパワーレベルでレイズする準備ができていることを保証します。</li>
	<li>レーザーを810nmに合わせます。骨膜微小管を研究するために、利用可能なレーザー出力の10%〜20%が使用され、これは、記載されたシステムでは、対物レンズの後焦点面で測定された13〜26mWに相当する。</li>
	<li>顕微鏡がケーラー位置合わせ(補足ファイル1)であり、SHGイメージングに使用される対物レンズであることを確認してください。 注意: この作業で使用される商用セットアップでは、検出は伝送モードでコンデンサーを介して実行されるため、これは重要です。</li>
	<li>光学検出経路から不要なフィルタを取り外します(図1A)。</li>
	<li>コンデンサーダイアフラムが完全に開いていることを確認して、このレベルで光が不必要に停止しないようにします。</li>
	<li>レンズに少量の液浸油を入れた25倍/0.8倍の開口数(NA)油浸対物レンズを用意します。 注:この対物レンズは、コンデンサーNAに最も一致するように使用され、0.55(理想的にはNAコンド≥NAOBJ)でした。</li>
</ol>2.顕微鏡予備制御
注意: セットアップが変更されない限り、予備的な顕微鏡制御を一度実行してください。
<ol><li>乾燥コーンスターチをスライドガラスで挟んだ画像をSHGパラメータで表し、レーザー偏光方向を明らかにするSHG画像を生成します。 補足ファイル2に記載されている手順に従いますが、レーザー出力はコーンスターチの場合は5%未満です。</li>
	<li>まばらなコーンスターチ粒の画像を1枚撮り、x-y平面のSHG小葉の向きをマークします。この向きはレーザーの向きに対応します(図2A)。</li>
	<li>対照として、同じサンプルの別の画像を撮影し、レーザーの発振方向を変えるために半波長板( 図1Aに示す位置)を光路に挿入します。結果の画像は、回転したSHG信号小葉を表示します(図2B、C)。</li>
	<li>SHGに異なるタイプのバンドパスフィルタを使用する場合は、ラインスキャンに沿って画像(図2D、E)と信号強度をピクセルごとに比較して、最適な伝送特性を備えていることを確認してください(図2F)。</li>
</ol>3.組織抽出
注意: 外科的処置を実行するには、常に清潔な道具を使用してください。
<ol><li>生後6〜12か月の タイエップ ラットと年齢が一致したスプレイグ-ドーリーコントロール(WT)を使用します。</li>
	<li>0.9%滅菌NaCl溶液で希釈したケタミン-キシラジン(0.125 mg / Kgおよび5 mg / Kg)の混合物のi.p.注射で動物を麻酔します。.<ol><li>痛みの反射を確認し、それらが存在しない場合にのみ続行してください。</li>
	</ol></li>
	<li>斬首 によって 動物を犠牲にします。</li>
	<li>頭が分離されたら、頭蓋冠の骨を正中線に沿って慎重に開き、上部の最も尾側の点から鼻に向かって、眼窩腔から正中線に向かって、次に最も尾側の点から脳と小脳の下まで開きます。 注:ボーンカッターとロンジャーは、脳構造に損傷を与えることなく、頭の骨を適切に除去することができます。</li>
	<li>骨から脳と小脳を解放します。2つの半球は分離することができます。半球が分割されている場合は、SHGイメージングに半分を使用し、残りの半分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3.7%パラホルムアルデヒドで20分間化学フード内で固定して、その後の切片作成と染色を行います。</li>
</ol>4.ビブラトーム切片
<ol><li>温かい(37°C)ハンクスバランス塩溶液(HBSS)で満たされたビブラトームバッファートレイを準備します。</li>
	<li>マスキングテープ を介して シアノアクリレート接着剤を使用して脳を標本プレートに固定します。最も尾側の部分/領域が接着剤に接触するため、反対側の吻側部分から使用可能な冠状部分を切り取ることができます。<ol><li>接着剤が重合するまで~10秒待って、サンプルを効果的に付着させます。 注:最良の結果は、ブレードが「左右」ではなく「上から下」に切断されるように脳を向けると得られます(図1B)。</li>
	</ol></li>
	<li>試料プレートをバッファトレイ内の磁気サポートに移します。</li>
	<li>生成されたスライスが脳の表面全体を取り囲むまで、300〜500μmの切片の切断を開始します。</li>
	<li>この時点で、セクションの厚さを160μmに減らします。</li>
	<li>脳梁のレベルで160 μmの切片全体を切断したら、大きなフレームオリフィスを備えた改良ガラス製パスツールピペットで回収します(図1C)。</li>
	<li>新しい温かいHBSSで清潔なペトリ皿に移すか、顕微鏡検査用のガラスサポート(カバーガラスまたはガラス底皿)に直接移します。 注:説明されている実験条件では、サンプルの上にカバーガラスを追加すると、イメージングに悪影響を及ぼします。</li>
</ol>5.顕微鏡に移す
<ol><li>顕微鏡が別の部屋にある場合は、温度を維持しながら組織切片を移すために、温めたゲルパックを入れた断熱ボックスを用意します。ボックスは、画像化されるまでセクションを暖かく保つのにも役立ちます。</li>
	<li>サンプルを顕微鏡の下に置き、透過光で接眼レンズを通して直接観察することにより、対物レンズの下に正しく配置されていることを確認します。 注:目標は、予測された発光構造をレーザーの発振方向に合わせ、放出された(したがって検出された)SHG信号を最大化することです。</li>
	<li>薄い液体膜がサンプル全体を覆うように、余分なHBSSを取り除きます。サンプルの過度の蒸発と乾燥を避けるために、数分ごとに液膜を目視で確認してください。 注意: 説明されている条件では、セクションは20分以内使用されます。サンプルの乾燥は、劇的なアーチファクト効果を引き起こします(補足図1A)。より長いイメージング時間が必要な場合は、HBSSを追加するのではなく、切片を温かく新鮮な培地に定期的に浸すことをお勧めします。より長い実験を行う場合は、灌流チャンバーと接着剤または低融点アガロースを使用して組織を固定化することも推奨されます。</li>
	<li>暗いインキュベーションチャンバーのすべてのドアを閉めたり、インキュベーションチャンバーを黒いナイロンポリウレタンコーティングされた布で覆ったりするなど、非デススキャンイメージング用の顕微鏡ステージを準備します。</li>
</ol>6. イメージング
<ol><li>伝送経路に沿って「非スキャン」イメージングモードを選択します。このようにして、チューブリンの弱いSHシグナルの捕捉が最適化されます。</li>
	<li>LCIプラン-ネオフルアー25x/0.8 NAの目標を選択します。</li>
	<li>レーザー出力を13 mWから26 mWの間で設定し、ピクセル滞留時間を12.6 μsにします。512ピクセル×512ピクセル以下の画像を速度5、平均2で撮影し、平均取得時間は約15秒です。 注意: より高いレーザー出力および/またはより長い滞留時間を使用すると、サンプルが損傷する可能性があります(補足図1B)。</li>
	<li>最初に485 nmのショートパスフィルター(SP485)を使用して画像を撮影し、2番目のステップでシャープな405 nmバンドパスフィルター(BP405; 図3)。 補足ファイル 2 に記載されている手順に従います。 注:擬似明視野画像は、可視線の残留レーザー光を使用して同じ検出器で撮影できます(405nmまたは488nmレーザーが最適です)。</li>
</ol>7.小脳の処理
<ol><li>まず、メスで小脳を2つの半球に切断し、次に中央部分(切断後に得られる平らな部分)でビブラトムサポートに接着します。</li>
	<li>脳について説明したのと同じ方法で小脳を切片および画像化する(160μm切片、同じビブラトーム設定、同じブレード、同じ顕微鏡設定など)。 注:小脳の解剖学的構造のため、切片作成の瞬間のその向きは重要ではありません。表面から離れた場所で生成されたスライスのほとんどでは、白質によく分割された葉があります。</li>
</ol>

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<li>Garduno-Robles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+features+in+a+rat+model+of+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).</li>
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<li>Alata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+evaluation+of+cerebellar+signs+of+H-ABC+tubulinopathy+in+a+patient+and+in+the+taiep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model.</a> Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).</li>
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</ol>

著者は競合する金銭的利益を持っていません。

SHG顕微鏡は、2光子励起顕微鏡、第3高調波発生顕微鏡、コヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡などの非線形光学技術のグループの一部であり、従来の光学顕微鏡のライフサイエンスへの応用範囲の拡大に貢献してきました20。
具体的には、SHG顕微鏡の主な長所と短所は同じ条件に関連しています:信号発生器は非中心対称です21。このような特定の建築条件は、無機および有機結晶の領域でよく見られますが、生物学的対象物の間ではまれです。コラーゲンおよび筋肉ミオシンと共に、微小管は第2高調波信号22を生成することができ、これは平行ポリマーの束において十分な合計が起こるならば顕微鏡で検出することができる。細胞内では、チューブリンは会合して、軸索のコア(細胞種特異的位置)、有糸分裂紡錘体(時間特異的分布)、およびこの研究で提示されているように、最近記載された細管症-髄鞘低下と大脳基底核および小脳の萎縮、またはH-ABC(この種の最初に報告された病理学的分布を表す)...

組織や臓器製剤中の細胞骨格構造の光学イメージングは簡単な作業ではありません。細胞骨格フィラメントはいたるところにあるため、例えば、上皮サンプル中のα-チューブリンまたはβ-アクチン、または潜在的にケラチンに対して一般的な染色が行われる場合、シグナルはサンプル全体にかなり均一に分布する可能性があります。染色を細胞成分のより意味のあるサブセットに制限するには、標的発現1のトランスジェニックマウスを使用するか、アイソフォーム特異的抗体の使用を計画することができます。後者のほとんどが市場に出回っていませんが(そして、まったく存在しないものはほとんどありません2,3,4)、トランスジェニック動物モデルが利用可能である可能性があります。ただし、ラボで取得し、適切に収容する必要があり、プロセスにすべての費用がかかります。特定の抗体または化学物質、例えばファロイジンやパクリタキセルなどの蛍光色素結合薬物は、生細胞または組織での使用と部分的または完全に適合しない可能性があるため、固定サンプルの研究のみに適用できます。
チューブリンの場合、追加の側面、すなわち固定に対するポリマーの感受性を考慮する必要があります。ホルムアルデヒドによる従来の化学的固定は、微小管の完全性を最適に保存するのに十分ではないことが知られています5。さらに、最近の報告では、ホルムアルデヒド架橋が、GTP6などの一部の薬物または生理学的分子の結合で起こるのと同様に、微小管の微細構造に微妙な変化を誘発することが確認されています。
したがって、染色されていない、固定されていないサンプル中の微小管を直接可視化することがしばしば望ましいです。これを達成するための技術的解決策の1つは、平行な微小管の束がハーモノフォアとして機能し、強力なパルス赤外線レーザーで適切に照らされたときに周波数倍の光を放出する能力に基づく第2高調波発生(SHG)顕微鏡7です。周波数倍増が可能なことが知られている他の2つの生物学的材料であるコラーゲンとミオシンから、より強力でより安定した第2高調波信号を生成できますが、チューブリンからの信号は、これまで主に有糸分裂紡錘体再配列8,9,10および軸索微小管形態11,12,13の研究に使用されてきました。
この研究では、チューブリンベータ4A(TUBB4A)チューブリノパシーの影響を受けた中枢神経系(CNS)組織を健康な組織と区別するための診断ツールとしてのSHG顕微鏡の新しい使用法を紹介します14。この主に神経アイソフォームのチューブリンで発生する変異のいくつかは、大脳基底核および小脳(H-ABC)の髄鞘形成低下および萎縮を引き起こすものと同様に、希突起膠細胞の微小管の過剰充填を誘発します15,16;次に、細胞骨格の変化は、髄鞘形成などの下流効果に関連しており、運動経路と感覚経路の深刻な障害を伴います16,17,18,19。本研究で用いたマウスモデルは、希突起膠細胞の微小管含量の異常を示し、H-ABC患者の感覚運動症状のほとんどを再現している17。プロトコルは、健康な組織と変異組織の間のSH信号の違いを強調するために、通常は高度に有髄性であり、ヒト患者およびtaiepラット19で深刻な影響を受ける脳梁および小脳として構造を画像化する方法を説明します。

<table><tbody><tr><td>405/10 nm BrightLine(R) シングルバンドバンドパスフィルター&nbsp;</td><td>セムロック</td><td>FF01-405/10-25</td><td>直径32mm、ハウジングリング付き</td></tr><tr><td>ブラックナイロン、ポリウレタンコーティング生地</td><td>ソーラブス</td><td>BK5</td><td>5フィート x 9フィート(1.5 m x 2.7 m)x 0.005インチ(0.12 mm)厚さ&nbsp;</td></tr><tr><td>ビブラトーム用ブレード</td><td>あらゆるコマーシャル。例:ウィルキンソンソード</td><td></td><td>&nbsp;クラシックなステンレス鋼の両刃カミソリの刃</td></tr><tr><td>細胞培養皿、35 mm</td><td>あらゆるコマーシャル。例:ファルコン</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>倒立顕微鏡、使用される対物レンズはLCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA&nbspです。</td></tr><tr><td>クーラー</td><td>あらゆるコマーシャル</td><td></td><td>断熱されたポリスチレンの箱であれば、サンプルを約 37 度に維持することができます。C</td></tr><tr><td>トウモロコシのスタック</td><td>例:マイゼナ</td><td></td><td>スーパーから</td></tr><tr><td>カバースリップ #1.5</td><td>あらゆるコマーシャル</td><td></td><td>直角の</td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>例:ロックタイト</td><td></td><td>脳をマスキングテープに接着するには</td></tr><tr><td>細い鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11412-11</td><td>髄膜からの取り扱いによる組織切片の操作</td></tr><tr><td>細かいはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14370-22</td><td>皮膚を切るには&nbsp;</td></tr><tr><td>細いはさみの曲がった先端</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14061-09</td><td>正中線に沿ってカットするには</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37%</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>252549</td><td>PBSで1:10に希釈するには</td></tr><tr><td>フリードマン・ロンジャー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16000-14</td><td>骨を切るには</td></tr><tr><td>ジェルパック</td><td>あらゆるコマーシャル</td><td></td><td>37°Cに予熱。C、クーラー内の温度を維持するのに役立ちます</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット、改質</td><td>あらゆるコマーシャル</td><td></td><td>組織切片を移すには</td></tr><tr><td>ハンクス&プライム;平衡塩溶液(HBSS)</td><td>ギブコ</td><td>14025-076</td><td>粉末から調製可能</td></tr><tr><td>ケリー止血剤</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>13018-14</td><td>ボーンを分離するには&nbsp;</td></tr><tr><td>マスキングテープ</td><td>あらゆるコマーシャル</td><td></td><td>試験片プレートの表面を保護するため</td></tr><tr><td>NDDモジュール, タイプC</td><td>ツァイス</td><td>000000-1410-101</td><td>信号を検出し、光損失を低減します。SP485 に 000000-1935-163 フィルターセットを収納</td></tr><tr><td>オフセットボーンニッパー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16101-10</td><td>骨を切るには</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>ギブコ</td><td>10010-031</td><td>粉末またはタブから調製可能</td></tr><tr><td>パルスレーザー</td><td>コヒーレント</td><td>カメレオンビジョンII</td><td>680&ndash;1080nm波長可変レーザー</td></tr><tr><td>メス</td><td>あらゆるコマーシャル</td><td></td><td>鋭利な先端のストレートブレード</td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>ヴァンナススプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15018-10</td><td>ビブラトーム切断から得られたスライスと標本プレートに接着されたセクションの両方に結合されたままの髄膜を切断します。</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>あらゆるコマーシャル。例:ライカ</td><td>VT1200</td><td></td></tr></tbody></table>

中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

脳内の細胞骨格成分を十分に可視化することは困難です。すべての神経組織における微小管、マイクロフィラメント、および中間フィラメントのネットワークの遍在する分布は、蛍光タンパク質融合戦略の結果のばらつきと、発色団ビヒクルとしての抗体および薬物の動的研究へのそれらの限られた適用性とともに、古典的な光学的アプローチを他のタンパク質ほど効果的ではないものにします。チューブリンを研究する必要がある場合、分子の非中心対称組織化のために、ラベルフリーの第二高調波の生成は非常に適切な選択肢です。この手法を顕微鏡に結合させると、生物学的サンプル中の微小管の平行な束の体積分布を定性的に記述でき、固定および透過性のない新鮮な組織を扱うという追加の利点があります。この研究では、最近報告されたミエリン障害である大脳基底核および小脳(H-ABC)チューブリノパシーの萎縮を伴う髄鞘形成低下のように、希突起膠細胞のチューブリンが豊富な構造の微小管を強調するために、市販の第2倍音発生顕微鏡セットアップでチューブリンを画像化する方法について説明します。

この方法論で得られた画像は、生物学的組織に存在するハーモノフォアの数が非常に限られているため、本質的に低いバックグラウンドレベルを有し、これはこの方法の重要な利点の1つである。
脳梁の線維を画像化すると、線維のような短い構造と丸い要素がタイエップ脳に一貫して見られますが(図3B)、対照脳の脳梁は脳領域全体ではるかに不均一で等方性の信号を示します(図3A)。狭帯域フィルタを追加すると、制御画像からの非特異的信号強度が低下するだけであり(図3C-D)、常に強いSH光を生成するタイエップ画像のソーマ様および短く細長い構造の周囲からこの低い拡散信号を選択的に除去するため、差動信号の起源は特に第2高調波発生現象にあります(図3E-F)。<...

本稿では、細管障害のモデルで微小管を負荷した希突起膠細胞を、シンプルで革新的な第2高調波発生顕微鏡アプローチで検出するためのプロトコルを紹介します。

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

生体試料のセカンドハーモニックジェネレーションイメージングは、タグや色素を必要とせずに非中心対称分子とその集合体の可視化を可能にする光学技術です。この方法で生成された画像は、ハーモナル力として作用できる生体分子がほとんどないため、バックグラウンドが低くなっています。このプロトコルは、taiep動物モデルにおけるチューブリンβ-4Aの画像診断のための技術の適用を記載する。尿細管症は最近記載されている疾患です。このため、細胞レベルでの病態生理の根底にある基本的なメカニズムについては、限られた量の情報が利用可能です。まず、パルスレーザーをオンにして、最適で安定したパワーレベルでレイズする準備ができていることを確認します。耳膜微小管を研究するために、利用可能なレーザー出力の10〜20%が使用され、これは記載されたシステムでは、対物レンズの後焦点面で測定された13〜26ミリワットに相当する。イメージングの前に、レーザーを810ナノメートルに回します。次に、顕微鏡が第2高調波発生(SHGイメージング)に使用される対物レンズとケーラーで調整されていることを確認します。光学検出経路から不要なフィルターを取り外し、コンデンサーダイアフラムが完全に開いていて、光が不必要に停止していないことを確認します。レンズに少量の液浸油を滴下した状態で、25倍×0.8の開口数油浸対物レンズを準備します。コーンスターチの場合は5%未満のレーザー出力を除いて、ここの表に記載されている手順に従います。スライドガラスで挟まれた乾燥コーンスターチの画像。SHG画像を生成するためのSHGパラメータを使用すると、レーザー偏光方向が明らかになります。まばらなコーンスターチ粒子の1つの画像をキャプチャし、レーザー偏光方向に対応するXY平面内のSHG小葉の向きをマークします。制御のために、同じサンプルの別の画像を撮影し、光路に半波長板を挿入してレーザーの発振方向を変更します。結果の画像には、回転したSHG信号小葉が表示されます。SHGに別のバンドパスフィルタを使用する場合は、スキャンラインに沿って画像と信号強度をピクセルごとに比較して、最適な伝送特性があることを確認してください。温かいハンクスバランス塩溶液またはHBSSで満たされたビブラトームバッファートレイを準備します。マスキングテープを介してシアノアクリレート接着剤を使用して脳を標本プレートに固定します。最も尾部は接着剤に接触するため、反対側の吻側部分から使用可能な冠状切片を切断することができます。試料プレートをバッファトレイ内の磁気サポートに移します。スライスが脳表面全体を取り囲むまで、300〜500ミクロンの切片の切断を開始します。次に、セクションの厚さを160ミクロンに減らします。160ミクロンの切片が脳梁のレベルで切断されたら、大きなフランジ付きオリフィスを備えた修正ガラスパスツールピペットで回収します。切片を新しい温かいHBSSで清潔なペトリ皿に移すか、顕微鏡検査用のカバースリップまたはガラス底皿に直接移します。サンプルを顕微鏡下に置き、透過光で接眼レンズを通して直接観察することにより、対物レンズの下に適切に配置します。薄い液体膜がサンプル全体を覆うように、余分なHBSSを取り除きます。サンプルの過度の蒸発と乾燥を避けるために、数分ごとに液膜を目視で確認してください。暗いインキュベーションチャンバーのすべてのドアを閉じるか、インキュベーションチャンバーを黒いナイロンポリウレタンコーティングされた布で覆うなど、非デススキャンイメージング用の顕微鏡ステージを準備します。伝送パスに沿って非デススキャンイメージングモードを選択します。このようにして、チューブリンの弱いSHシグナルの捕捉が最適化されます。次に、目的を選択します。次に、ピクセル滞留時間を12.6マイクロ秒のレーザー出力に設定します。512 x 512ピクセル以下の画像を速度5で撮影し、平均2つ、平均取得時間は15秒です。最初に485ナノメートルのショートパスフィルターを使用して画像をキャプチャし、2番目のステップでシャープな405ナノメートルのバンドパスフィルターを追加します。メスで小脳を2つの半球に切り、中央部分でビブラトームサポートに固定します。脳について説明したのと同じビブラトーム、ブレード、および顕微鏡設定を使用して、小脳を切片化して画像化します。脳梁の線維を画像化すると、線維のような短い構造と丸い要素がタイエップ脳に観察されます。対照的に、対照脳の脳梁は、脳領域全体ではるかに不均一で等方性の信号を示します。狭帯域フィルタを追加すると、制御画像からの非特異的信号強度が低下するだけであり、常に強いSH光を生成するタイエップ画像のソーマ様および短い細長い構造の周囲からこの低拡散信号を選択的に除去するため、差動信号の起源は特に第2高調波発生現象にあります。小脳白質対照組織では、SHシグナルの完全な消失が観察された。ショートパスフィルターを使用するとプルキンエ細胞はほとんど見えず、細長く丸みを帯びた構造はタイエップ組織からのSH画像に残ります。最良の画像を得るための重要なステップは、組織切片をできるだけ薄く切断することです。さらに、急性組織切片を扱うには、組織の劣化を防ぐための迅速なプロトコルが必要です。したがって、事前に光学系をセットアップして確認することが重要です。微小管からの第2高調波信号は、デンプンからの第2高調波信号よりも弱い。したがって、微小管のイメージングには、より多くのレーザー出力を使用する必要があります。高い開口数対物レンズをイメージングに使用すると、サンプルの強度が急速に増加するため、レーザー出力を慎重に増やす必要があります。 第2高調波発生イメージングでは、尿細管症モデルの中心髄鞘腫の病理学的変化を迅速かつ容易に識別できます。この技術の潜在的な用途には、H-ABCチューブリノパシーの基本的なメカニズムの研究および患者を治療するための薬理学的療法の評価への使用が含まれます。長期的には、この技術は、頭蓋内または新鮮な生検で使用される補完的な診断ツールになる可能性があります。

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神経科学

このビデオでは、適切なバッファーの存在下でカバースリップ表面に成長する微小管を視覚化する干渉反射顕微鏡(IRM)技術について説明します。入射光で照らすと、カバースリップ-バッファー界面とバッファー-微小管界面が光を反射し、これが組み合わさって干渉パターンを形成することで、明るい背景に対して微小管を高コントラストの画像として視覚化できます。...

微小管ダイナミクスのラベルフリー可視化のための干渉反射顕微鏡法

出典:Piazza, V., et al., Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin.J. Vis. Exp.

ラットモデルにおける第2高調波発生イメージングによるチューブリン欠損の研究

私たちは、軸索とミエリンの損傷のダイナミクスをリアルタイムで同時に視覚化するために、2光子励起タイムラプス顕微鏡を利用したプロトコルを提示します。この提案されたプロトコルは、中枢性有髄軸索に影響を与える可能性のある内因性および外因性の両方の要因の研究を可能にします...

アンエクスビボレーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

ここでは、他の組織に広く適用される、ゼブラフィッシュ脳の発達における微小管の異なる集団を分析するメソッドについて反応について説明します。最初のプロトコルでは、反応の安定性と動的微小管の最適化手法について説明します。第二議定書は、画像し、初期微小管を具体的に数値化する方法を提供します。...

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

イメージング分光反射率に基づくラベル無料ナノを使用して固定脳スライスの髄軸索をイメージングのためのステップバイ ステップ...

その場で有髄軸索のスペクトル反射型顕微鏡

ここでは、生細胞紡糸ディスク共焦点顕微鏡法とMATLABベースの画像処理を用いてプロメタフェイズで同期した細胞における微小管ダイナミクス解析の堅牢かつ詳細な方法を提示する。...

単極有糸状スピンドルにおけるスピンディスク顕微鏡による微小管ダイナミクスの測定

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。...

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

このプロトコルは、EB3タンパク質トランスフェクションによる微小管プラスエンドビジュアライゼーションに専念し、一次細胞培養における動的特性を研究しています。このプロトコルは、ハンチントン病患者から得られたヒト原発性皮膚線維芽細胞に実施された。...

ヒト原発性皮膚線維芽細胞に基づくハンチントン病モデルにおける微小管プラスエンドダイナミクスの可視化

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

この記事では、植物ベースの微小管架橋剤であるMAP65およびPEGをクラウディング剤として使用して、タクトイドの形状の微小管アセンブリを形成するためのプロトコルを提示する。...

微小管タクトイドの自己組織化

学ぶ 二次高調波発生顕微鏡を用いたチューブリン依存性欠陥におけるオリゴデンドロサイトのラベルフリー可視化法。この手法は、中枢ミエリンの微小管動態と神経疾患におけるオリゴデンドロサイト機能の理解を深めるのに役立ちます。

中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系

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