Name: ミトコンドリア機能障害を研究するための インビトロ アプローチ:サイブリッドモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 学ぶサイブリッドモデルによるミトコンドリア機能障害の研究手法。rho0細胞と細胞質体を融合させ、mtDNA変異の病原性を検証し、ヘテロプラスミーと疾患重症度の相関を解析する。この方法は神経科学と細胞生物学の理解を深める。

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この研究は、マリアニ財団の資金提供を受けたミトコンドリア小児疾患研究センター(http://www.mitopedia.org)で実施されました。VTは、希少神経筋疾患のための欧州参照ネットワーク(ERN EURO-NMD)のメンバーです。

注:ヒト線維芽細胞の使用には、倫理的承認が必要な場合があります。この研究で使用された線維芽細胞は、MD患者に由来し、倫理的要件に従ってインスティテューショナルバイオバンクに保存された。細胞の使用についてインフォームドコンセントが提供された。室温(RT、22-25°C)の滅菌層流キャビネット下ですべての細胞培養手順を実行します。細胞培養および滅菌装置に適した滅菌ろ過溶液を使用してください。5%CO2で37°Cの加湿インキュベーター内ですべての細胞株を増殖させる。マイコプラズマ検査は、マイコプラズマを含まない培養物を確保するために毎週実施されるべきである。143BTK−rho0細胞は、先に記載した5のように生成することができる。
1. 細胞の培養
<ol><li>何らかの手順を開始する前に、MD患者由来の線維芽細胞における変異の存在を検証し、制限フラグメント長多型(RFLP)および/またはmtDNAシーケンシング解析全体によってヘテロプラズムまたはホモプラジーの割合を定量する14。</li>
	<li>種子線維芽細胞を4つの35mmシャーレに入れ、それぞれ2mLの完全培養培地を含有する(表1)。細胞を80%コンフルエント(48時間)まで成長させます。</li>
	<li>143BTK− rho0 細胞を8mLの補充培養液(表1)中で100mmシャーレ中で増殖させる。</li>
	<li>細胞を5%CO2で37°Cのインキュベーター内に維持する。</li>
	<li>rho0 細胞におけるmtDNAの不在をシークエンシング技術によって確認する14。</li>
</ol>2. 線維芽細胞の核生成
<ol><li>250 mL 遠心分離に適したボトル 4 本をオートクレーブ滅菌で 121 °C で 20 分間サイクルで滅菌します。実験室オーブンまたはRTで乾燥させる。</li>
	<li>遠心分離機を37°Cで予温する。</li>
	<li>線維芽細胞を含む35 mmディッシュを2回洗浄し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない2mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用した。</li>
	<li>70%エタノールで皿の外表面をきれいにし、アルコールが蒸発するまで待ちます。</li>
	<li>蓋を皿から、スクリューキャップをボトルから取り外します。各ディッシュを、蓋なしで、各250mL遠心分離ボトルの底に逆さまに置く。</li>
	<li>各ボトルに32mLの核生成培地をゆっくりと加え(表1)、培地がディッシュに入り、細胞と接触するようにする。長いガラスのパスツールピペットを使用して皿から泡を取り除き、ブンゼンの炎で先端を湾曲させます。 注:培地が皿に入り、細胞と接触するように気泡を除去することが重要です。</li>
	<li>各ボトルをスクリューキャップで閉じ、遠心分離機に移します。</li>
	<li>37°C、8,000× gで20分間遠心分離し、加速最大、減速減速。遠心分離機のバランスをとるために注意を払う:各ボトルをカウンターウェイトします。必要に応じて、適当な量の脱核培地を加えて重量を調整する。</li>
	<li>遠心分離中は、真空または10 mL血清学的ピペットを使用して、143BTK-rho0培養プレートから培地を吸引および廃棄し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない4 mLの1x PBSを使用して2回洗浄します。</li>
	<li>2mLのトリプシンを加えて、細胞単層を完全に覆う。</li>
	<li>ディッシュを37°Cのインキュベーターに約2分間置きます。</li>
	<li>培養器からディッシュを取り出し、生細胞(目的4xまたは10x)について倒立顕微鏡を用いて細胞剥離を観察し、2mLの補充培養液を加えることによって酵素活性を阻害する。</li>
	<li>ディッシュ内の細胞懸濁液4 mLを10 mLピペットで吸引し、15 mL円錐管に移す。</li>
	<li>バーカー血球計チャンバーまたは自動カウンターを使用して細胞をカウントします。</li>
	<li>遠心分離の最後に(ステップ2.8)、ボトルから培地を吸引し、それを廃棄する。</li>
	<li>以前に70%エタノールを噴霧した滅菌ガーゼ上のボトルを反転させて皿を取り除く。皿とその蓋の外面を70%エタノールできれいにしてください。アルコールが蒸発するまで待ってから、皿を閉じます。</li>
	<li>先に進む前に、生細胞(対物レンズ4倍または10倍)の倒立顕微鏡を用いて細胞芽細胞(ゴースト)の形成を確認してください。サイトカラシンBによって誘導されるそれらの核の押し出しのために、非常に細長い線維芽細胞を探す。</li>
	<li>各35 mmディッシュに、1×106個の143BTK−rho 0細胞を5%ウシ胎児血清(FBS)を添加した2mLの143BTK−rho0培養培地に再懸濁して加える。</li>
	<li>ディッシュを37°Cおよび5%CO2 の加湿インキュベーターに3時間放置し、143BTK− rho0 細胞をゴースト上に沈降させる。皿を乱さないでください。</li>
</ol>3. 除核線維芽細胞とrho 0 細胞との融合
<ol><li>3時間のインキュベーション後、皿から培地を吸引して捨てる。</li>
	<li>付着細胞を、2 mL のダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 高グルコース (血清使用不可解) または最小必須培地 (MEM) で 2 回洗浄します。</li>
	<li>メディアを吸引して破棄します。</li>
	<li>500 μLのPEG溶液( 材料表を参照)を細胞に加え、正確に1分間インキュベートする。</li>
	<li>PEG溶液を吸引して破棄します。</li>
	<li>血清を含まない2 mLのDMEM高グルコースまたはMEMを用いて細胞を3回洗浄する。</li>
	<li>2mLの融合培地(表1)を加え、5%CO2と共に37°Cのインキュベーター内で一晩インキュベートする。</li>
</ol>4. サイブリッドの選択と拡張
<ol><li>一晩インキュベーションした後、インキュベーターからプレートを取り出し、上記のように細胞をトリプシン処理し(ステップ2.9〜2.13)、各35mmディッシュの内容物を100mmディッシュに移す。</li>
	<li>8mLの選択培地(表1)を加え、プレートを5%CO2と共に37°Cのインキュベーターに入れた。</li>
	<li>2〜3日ごとに培地を交換してください。</li>
	<li>細胞のコロニーが現れるまで、選択の〜10〜15日間待つ。</li>
	<li>すべてのクローンを収集し、サイブリッドのバックアップとして「大規模な」培養物を生成することによって、4つのペトリ皿のうちの1つを凍結し、最終的に再クローン化してさらなる調査に使用することができる。</li>
	<li>残りの培養皿中の細胞をトリプシン処理し、数え、クローンが現れるまで、補充培養培地中の50〜100細胞/皿で1つ以上のペトリ皿に播種する(表1)。数日間成長させてください。</li>
	<li>RTで3分間、1,200× g で遠心分離することにより残りの細胞をペレット化し、上清を捨てた。</li>
	<li>ペレットからDNAを抽出する( 材料表を参照)。</li>
	<li>以前に報告されたようにタンデム反復(VNTR)分析の可変数によるジェノタイピングを行う15.</li>
	<li>クローニングシリンダーまたはピペットチップでシャーレからクローンを拾い上げ、実体顕微鏡を使用して異なるクローンのプールを避け、各ウェルに200 μLの補充培養液を含む96ウェルプレートに移します(表1)。</li>
	<li>DNAを凍結して抽出するのに十分な細胞があるまで、すべてのクローンを展開します。</li>
	<li>RFLPまたは他のシーケンシング法により各クローンの変異率を検証します。理想的には、野生型mtDNA(0%変異)を持つクローンと異なる変異パーセンテージを持つクローンの両方を取得し、どちらもホモプラスム変異mtDNA(100%変異)に加算してみてください。サイブリッド生成プロトコルの概略図については、 図1 を参照してください。</li>
</ol>

<ol><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li>
<li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li>
<li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+maintenance+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li>
<li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy%3A+implications+for+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li>
<li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
<li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--%3EG+%28ATP6%29+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP%2FO+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li>
<li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li>
<li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G%3AC+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li>
<li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95(2006).</li>
<li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+18+-+Cybrid+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li>
<li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6%2F8+mutations+in+adult+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749(2021).</li>
<li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Mitochondrial+DNA%3A+Particularities+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364(2021).</li>
<li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li>
<li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction%3A+application+to+the+apolipoprotein+B+3%27+hypervariable+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li>
<li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061(2020).</li>
<li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber%27s+hereditary+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li>
<li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li>
<li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li>
<li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214(2018).</li>
<li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li>
<li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+cybrids%2C+aging%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li>
<li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li>
<li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%3A+focus+on+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591(2020).</li>
<li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li>
<li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+human+cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li>
<li>Cruz-Bermúdez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li>
<li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin%2C+an+anticancer+drug%3A+implications+for+drug+resistance+and+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640(2019).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

mtDNAは、保護ヒストンの欠如および呼吸鎖に近いその位置のためにnDNAと比較して非常に高い突然変異率を有し、これは修復系16によって効率的に打ち消されない有害な酸化効果に分子をさらす。最初の病原性mtDNA変異は1988年17、18年に同定され、それ以来、多数の変異が記載されている。NGS技術は、ミトコンドリアゲノム全体をスクリーニングし、バリアント14を簡単に同定するための適切なアプローチです。しかし、一度も記載されていないmtDNA変異の病原性役割を評価することは困難な場合があり、このプロトコル11、12、13に記載されているシブリッド細胞の生成などの「昔ながらの」方法に依存しています。ここで説明するサイブリッドの生成は、キングとアタ...

ミトコンドリア障害(MD)は、核(nDNA)またはミトコンドリア(mtDNA)DNAのいずれかの変異によるミトコンドリア機能の障害によって引き起こされる多系統症候群のグループである1。それらは最も一般的な遺伝性代謝疾患の1つであり、有病率は1:5,000である。mtDNA関連疾患は、ミトコンドリア遺伝学の規則に従う:母体遺伝、ヘテロプラスミーおよび閾値効果、および有糸分裂分離2。ヒトmtDNAは16.6 kbの二本鎖DNA円であり、複製および転写に必要な配列を有する短い制御領域、13のタンパク質コード遺伝子(呼吸鎖のすべてのサブユニット)、22のtRNA、および2つのrRNA遺伝子3を含む。
健常者では、単一のmtDNA遺伝子型(ホモプラスミー)が存在するが、病理学的状態においては複数の遺伝子型が共存(ヘテロプラスミー)する。有害な異質体変異は、OXPHOSを破壊し、任意の年齢で任意の臓器に影響を与える可能性のある疾患を引き起こすために、臨界閾値を克服しなければならない4.OXPHOSの二重遺伝学は遺伝を指示する:常染色体劣性または優性およびX連鎖性nDNA変異の場合、母体性はmtDNA変異の場合、および散発的な症例はnDNAおよびmtDNAの両方である。
ミトコンドリア医学時代の初めに、キングとアタルディ5による画期的な実験は、mtDNAが完全に枯渇した腫瘍細胞株(rho0細胞)とMD患者からのミトコンドリアからの核を含むハイブリッド細胞を作成することによって、MDの原因となる突然変異の起源を理解するための基礎を確立しました。 そして、核ゲノムまたはミトコンドリアゲノムに変異が存在するかどうかを判断することは容易ではなかった。1989年に記載されたこの方法は、その後、ミトコンドリア医学の分野で働くいくつかの研究者によって使用されました6,7,8,9;詳細なプロトコルが最近公開されました10, しかし、ビデオはまだ作られていません.NGSが突然変異がどこにあるかを正確かつ迅速に特定できるのに、なぜそのようなプロトコルが今日関連しているのでしょうか?その答えは、サイブリッド生成が、新規mtDNA変異の病原性役割を理解し、ヘテロプラスミーの割合を疾患の重症度と相関させ、患者の自生核バックグラウンドの寄与が存在しない均質核系において生化学的調査を行うための最先端のプロトコルである11、12,13。
このプロトコールは、35mmペトリ皿中で増殖したコンフルエントな患者由来の線維芽細胞から細胞プラストを得る方法を記載している。サイトカラシンBの存在下でのディッシュの遠心分離は、除核サイトプラストの単離を可能にし、次いで、ポリエチレングリコール(PEG)の存在下でrho0 細胞と融合させる。得られたシブリッドは、クローンが発生するまで選択培地で培養される。代表的な結果のセクションは、mtDNAがドナー患者の線維芽細胞のそれと同一であり、nDNAが腫瘍性rho0 細胞株の核DNAと同一であることを証明するために、得られたシブリッドの分子特性評価の例を示す。

<table><tbody><tr><td>5-ブロモ-2'-デオキシウリジン</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>血液および細胞培養 DNA 抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>13323</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td>7,200 rcf, 37 &deg;C</td></tr><tr><td>遠心分離機ボトル、250 mL</td><td>ベックマン・コールター</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Drechslera dematioidea</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>C2743-200UL</td><td></td></tr><tr><td>透析 FBS</td><td>Gibco</td><td>26400-036 100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース (L-グルタミン w/ピルビン酸ナトリウム付き)</td><td>ユーロクローン</td><td>ECB7501L</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 - PBS (w/o カルシウム w/o マグネシウム)</td> <td>ユーロクローン</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 絶対無水</td><td>カルロ エルバ</td><td>414601</td><td></td></tr><tr><td>FetalClone III (ウシ血清製品)</td> <td>Cytiva - HyClone Laboratories</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>VWR</td><td>M4150NO250SP4</td><td></td></tr><tr><td>生細胞顕微鏡用 倒立研究用顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE TE200</td><td></td></tr><tr><td>JA-14 固定角アルミニウムローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>339247</td><td></td></tr><tr><td>ラボラトリーオートクレーブ Vapormatic 770</td><td>Labotech</td><td>29960014</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>EuroClone</td><td>ECB 3000D</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert マイコプラズマ検出キット</td><td>Lonza</td><td>LT07-318</td><td></td></tr><tr><td>PEG(ポリエチレングリコール溶液)</td><td>Sigma-Aldrich(Merck)</td><td>P7181-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(溶液100x)</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Primo TCディッシュ100 mm</td><td>EuroClone</td><td>ET2100</td><td></td></tr><tr><td>Primo TCディッシュ35 mm</td><td>EuroClone</td><td>ET2035</td><td></td></tr> ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム100 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECM0542D</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr> HBSS EuroClone ECB3051D <tr><td></td><td></td> Uridine Sigma-Aldrich (Merck) <td>U3003-5G</td><td></td></tr> <tr><td>にトリプシン 2.5%</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリア機能障害を研究するための インビトロ アプローチ:サイブリッドモデル

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

酸化的リン酸化(OXPHOS)を行うミトコンドリア呼吸鎖複合体の欠損は、ヒトミトコンドリア障害の生化学的マーカーである。遺伝的観点から見ると、OXPHOSは、核DNA(nDNA)とミトコンドリアDNA(mtDNA)の2つの異なる遺伝子系の相補から生じるため、ユニークな例を表しています。したがって、OXPHOS欠損は、核およびミトコンドリアにコードされる遺伝子に影響を及ぼす変異に起因する可能性がある。
1989年に発表されたKingとAttardiによる画期的な研究は、mtDNA(rho0と名付けられた)を枯渇させたヒト細胞株が、いわゆる「トランスミトコンドリアサイブリッド」を得るために外因性ミトコンドリアによって再移入され得ることを示した。これらのシブリッドは、ミトコンドリア障害患者由来のミトコンドリア(MDs)とrho0 細胞由来の核を含むため、欠損がmtDNA関連かnDNA関連かを検証することができる。これらのサイブリッドはまた、突然変異の病原性を検証し、生化学的レベルでその影響を研究するための強力なツールです。この論文では、サイブリッドの生成、選択、および特性評価を記述する詳細なプロトコルを提示する。

サイブリッドを生成するには、3日間の実験室作業に加えて、選択期間(〜2週間)とクローンの成長のための追加の1〜2週間が必要です。重要なステップは、細胞プラストの質と選択期間です。サイブリッドの形態は、rho0 ドナー細胞の形態に類似している。サイブリッドにおける正しいmtDNAおよびnDNAの割り当ては、細胞の同一性を確認するために必須である。その一例を 図 2 に示します。このケースでは、ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス、脳卒中様エピソード(MELAS)に関連する最も一般的なmtDNA変異の1つであるヘテロプラズムm.3243A&gt;Gを有する患者由来の線維芽細胞からシブリッドを生成しました。VNTRの解析により、サイブリッドnDNAがrho0 細胞のそれと同一であることが示され(図2A)、患者のnDNAが143Bゲノムで置き換えられたことが確認された。RFLPおよび/またはシーケンシング解析を使用して、mtDNA変異の存在およびヘテロプラズムの割合を評価...

トランスミトコンドリア・シブリッドは、ミトコンドリアDNA(mtDNA)枯渇細胞(rho0 細胞)と、ミトコンドリア障害に罹患した患者由来の細胞プラスト(除核細胞)とを融合させたハイブリッド細胞である。それらは、疾患の核またはミトコンドリア起源の決定、生化学的活性の評価、およびmtDNA関連変異体の病原性役割の確認を可能にする。

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

サイバー生成は、任意の新規ミトコンドリアDNA変異の病原性役割を理解し、アトリプラズムの割合を疾患の重症度と相関させるための最先端のプロトコルです。この技術は、患者の核背景の寄与が存在しない均質な核系において生化学的調査を行うことを可能にする。この技術は、ミトコンドリアDNAの変異の病原性を検証することを可能にする。生化学的レベルでその影響を研究することを可能にする カルシウムおよびマグネシウムを含まない2ミリリットルの1X PBSを使用して、線維芽細胞を含む35ミリメートルの皿を2回洗浄する。70%エタノールで皿の外表面をきれいにし、アルコールが蒸発するまで待ちます。蓋を皿から、スクリューキャップをボトルから取り外します。蓋のない各ディッシュを上下逆さまにして、各250ミリリットルの遠心ボトルの底に置きます。各ボトルに32ミリリットルの核生成培地をゆっくりと加え、培地が皿に入り、細胞と接触できるようにします。長いガラスの牧草地のピペットを使用して皿から泡を取り除き、先端をブンセンの炎で湾曲させます。各ボトルをスクリューキャップで閉じ、遠心分離機に移します。37°Cで20分間遠心分離し、8, 000 x G.ボトルから培地を吸引し、それを捨てる。以前に70%エタノールを噴霧した滅菌ガーゼの上のボトルを反転させて皿を取り除きます。皿の外面とその蓋を70%エタノールできれいにし、エタノールが蒸発した後に皿を閉じます。先に進む前に、生細胞について倒立顕微鏡を用いて細胞芽細胞形成の確認を行う。サイトカラシンによって誘導されるそれらの核の押し出しのために非常に細長い線維芽細胞を探してください。各35ミリメートルの皿に1,000,143行のゼロセルを追加します。5%FBSを添加した2ミリリットルの培養液に再懸濁した。皿を加湿二酸化炭素インキュベーターに3時間放置して、幽霊の143行のゼロ細胞を沈降させます。3時間のインキュベーションの後、培地を吸引して廃棄する。付着細胞を血清またはMEMを含まない2ミリリットルのDMEM高グルコース培地で2回洗浄し、次いで培地を吸引して廃棄する。500マイクロリットルのポリエチレングリコール溶液を細胞に加え、正確に1分間インキュベートする。ポリエチレングリコール溶液を吸引し、廃棄する。血清なしまたはMEMで2ミリリットルのDMEM高グルコースで細胞を3回洗浄する。2ミリリットルの融合培地を加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーター内で一晩インキュベートする。残りの培養皿中の細胞をトリプシン処理する それらを数えて1つ以上のペトリ皿に播種する クローンが現れるまで補充培養物に皿あたり50〜100個の細胞を加える。それから数日間成長させてください。実体顕微鏡を使用して、クローニングシリンダーまたはピペットチップを備えたペトリ皿からクローンをピックアップします。異なるクローンをプールすることを避け、各ウェルに200マイクロリットルの補充培養培地を含む96ウェルプレートに移すようにしてください。サイブリッドは、ミトコンドリアミオパチー、脳症乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソードに関連する最も一般的なミトコンドリアDNA変異の1つであるヘテロプラズムM2343A2Gを保有する患者由来の線維芽細胞から生成した。可変数のタンデムリピートの分析は、サイバーDNAが、患者のサイバーDNAを143Bゲノムで置換することを確認する行ゼロ細胞と同一であることを示した。制限断片長多型、またはシーケンシング分析は、ミトコンドリアDNA変異の存在およびヘテロプラスミーパーセンテージを評価するために使用することができる。このプロトコルを試みるときは、核子およびミトコンドリアDNAの正しい遺伝的資産、ならびに再移入されたサイブリッド中のミトコンドリアDNA量を検証することが重要である。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

モデル生物Caenorhabditis elegansにおけるミトコンドリア阻害剤の影響のin...

スクリーニング可能<em&gt;インビボ</em&gt;トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

ミトコンドリアの機能制御メカニズムを完全に理解するためには、ミトコンドリアの構造と機能の関係の分析が必要です。この論文では、生きたショウジョウバエの卵巣と固定された卵巣のミトコンドリアの構造と機能を研究するための具体的な方法について説明し、実証しています。...

ミトコンドリアの構造と機能の研究にショウジョウバエ卵巣

Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy...

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

ミトコンドリア融合は、ミトコンドリアダイナミクスの基礎となる重要なホメオスタティック反応である。ここで説明する インビトロ...

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。...

ミトコンドリア病モデルのためのヒト脳オルガノイドの生成

以前に凍結したアーカイブされた固体組織からのミトコンドリア濃縮サンプルを調製し、研究者は様々な実験モダリティでミトコンドリアの機能的および分析的評価を行うことを可能にした。この研究は、凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を調製し、ミトコンドリアの分析評価を行う方法を示す。...

ソウの子孫から以前に凍結した心臓組織におけるミトコンドリア電子伝達複合体の測定:運動誘発ミトコンドリアバイオエネルギーの変化を評価するモデル

このプロトコルは、腫瘍形成プロセスにおけるミトコンドリアの役割を研究するためのツールとして、浮遊増殖癌細胞からサイブリッドを生成するための技術について説明しています。...

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

ここでは、PINK1B9欠損変異ショウジョウバエの生体エネルギーを解析するための高分解能肺活量測定プロトコルを紹介します。この分析法では、基質-アンカプラー-阻害剤-滴定(SUIT)プロトコルを使用します。...

ショウ ジョウバエのmelanogaster PINK1B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

脳オルガノイドは、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様エピソード (MELAS)...

脳オルガノイドを用いたミトコンドリア疾患のモデル化:ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソードに焦点を当てる

学ぶサイブリッドモデルによるミトコンドリア機能障害の研究手法。rho0細胞と細胞質体を融合させ、mtDNA変異の病原性を検証し、ヘテロプラスミーと疾患重症度の相関を解析する。この方法は神経科学と細胞生物学の理解を深める。

ミトコンドリア機能障害を研究するためのインビトロアプローチ:サイブリッドモデル

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