Name: 蛍光標識タンパク質と人工リン脂質マイクロベシクルの定量的フローサイトメトリーによる相互作用の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ 蛍光標識タンパク質と人工リン脂質マイクロベシクルの相互作用を定量的フローサイトメトリーで解析する方法。動的・平衡結合定数の算出や結合タンパク質数の推定が可能で、基礎研究に有用な簡便な手法です。

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著者らは、ロシア科学財団の助成金20-74-00133によって支援されました。

1. 蛍光タンパク質標識
<ol><li>材料準備<ol>
<li>1 M 炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH 9.0 を用意し、4 °Cで保存し、1 週間以内に使用してください。</li>
		<li>使用直前に1.5 Mヒドロキシルアミン塩酸塩緩衝液(pH 8.5)を調製する。</li>
		<li>ジメチルスルホキシド中の蛍光色素( 材料表参照)の10mg/mL溶液を調製する。 注:この溶液は、暗闇の中で-20°Cで1ヶ月間保存することができます。</li>
		<li>精製抗体または他のタンパク質の溶液を1〜10mg / mLで調製する。 メモ: アンモニウムイオンまたは第一級アミンを含むバッファーは避けてください。透析により、トリスまたはグリセロールを含む緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で置き換える。アジ化ナトリウム(≤3 mM)もチメロサール(≤1 mM)も共役反応に大きく影響しません。</li>
		<li>タンパク質精製のためにゲル濾過培地( 材料表を参照)をPBS中で室温で一晩、または60°Cで2時間インキュベートする。 ゲルろ過媒体を 0.2 μm メンブレンを備えたスピンカラムに塗布します。</li>
	</ol></li>
	<li>Eq(1)を用いて標識するタンパク質の濃度に応じて各反応に使用する反応性色素の量を算出する。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq1v4.jpg"> ここで、V染料は染料原液の体積であり;CPR、VprおよびMWprは、タンパク質の濃度、体積およびモル重量であり;MW染料は染料モル重量であり;100は単位変換係数です。MRは、反応混合物中のタンパク質に対する色素のモル比である。 注: IgG 標識反応には、抗体が 1 ~ 3 mg/mL の場合は MR = 40、抗体が 4 ~ 10 mg/mL の場合は MR = 30 が推奨されます。凝固因子については、MR=5が通常用いられる。</li>
	<li>コンジュゲーション反応<ol>
<li>反応管内で、タンパク質溶液を10倍低容量の1 M重炭酸塩溶液と混合する。</li>
		<li>連続攪拌しながら必要量の蛍光色素を加える(ステップ1.2参照)。</li>
		<li>反応混合物を室温で約1時間インキュベートし、光から保護し、連続攪拌する。</li>
		<li>タンパク質溶液200 μLごとに、5 μLの1.5 Mヒドロキシルアミン塩酸塩を加える。</li>
		<li>反応混合物を室温で約30分間インキュベートし、光から保護し、連続攪拌する。</li>
	</ol></li>
	<li>スピンカラムを用意する。<ol>
<li>タンパク質精製用のゲルろ過培地 500 μL をカラムに加えます。カラムを 1,000 × g で 3 分間遠心分離 します。</li>
		<li>バッファーを収集チューブから廃棄します。カラムが満杯でない場合は、さらにゲル濾過培地を加え、カラムを1,000 × gで3分間遠心分離 します。列がいっぱいになるまで、この手順を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>浄化<ol>
<li>反応混合物を17,000 × g で5分間遠心分離し(工程1.3.5から)、沈殿物を除去した。</li>
		<li>上清をゲル濾過媒体を用いてスピンカラムに移す。溶液がゲルベッドに吸収されるようにする。</li>
		<li>スピンカラムには空の収集チューブを使用し、1,000 × gで5分間遠心分離 します。遠心分離後、標識タンパク質を回収チューブから回収する。</li>
	</ol></li>
	<li>ラベリングの程度の決定<ol>
<li>280 nmにおける遊離色素の吸光度(A280)および色素のλmax(Amax)を測定することによって、A280の吸光度に対する色素の寄与を補正する(Eq (2)を参照)。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq02.jpg">(2)</li>
		<li>280nmにおけるタンパク質-色素複合体の吸光度(A280)および色素のλmax(Amax)を測定し、Eq(3)を用いてタンパク質コンセテーションを計算する。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq3v2.jpg">(3) ここでεM は、280nmにおけるタンパク質のモル吸光係数であり; d は、吸光度の測定中の光路長であり; CF は、A280 における吸光度に対する色素の寄与である(ステップ1.6.1)。</li>
		<li>ラベリングの程度 (DOL) は、Eq (4) を使用して計算します。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq4v2.jpg">(4) ここでεM色素はλmaxnmにおける色素のモル吸光係数であり;dは、吸光度の測定中の光路長であり;Cタンパク質は、タンパク質の濃度である(ステップ1.6.2)。</li>
	</ol></li>
</ol>リン脂質小胞の調製
<ol><li>脂質混合物の調製および貯蔵<ol>
<li>脂質を適切な比率(ホスファチジルセリン/ホスファチジルコリンを20モル%〜80モル%の割合で)で組み合わせる。</li>
		<li>凍結乾燥または蒸発後に脂質混合物を乾燥させ、ガラスアンプル中で不活性雰囲気下で保存する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂質膜製造<ol>
<li>アンプルを開き、脂質混合物を少量(〜100μL)のクロロホルムに再懸濁する。 注:クロロホルムは完全に蒸発しないため、あまり使用しないでください。</li>
		<li>DiIC16(3)をエタノールに0.2モル%で加える。脂質混合物を丸底フラスコに移す。混合物を回転させてフラスコの側面に薄く広げる。脂質ミックスをアルゴンストリーム下で30分間乾燥させる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂質混合物の水和<ol>
<li>適切に温め(〜55°C)水性緩衝液(HEPES 20 mM、NaCl 140 mM、pH 7.4)を、予想される脂質濃度に対応する容量で脂質膜を有するフラスコに加える。混合物を55°Cのボルテックスで30分間インキュベートし、完全な水分補給を行います。</li>
		<li>サンプルチューブを冷凍庫または温かい恒温槽に入れて、脂質懸濁液を3〜5回の凍結融解サイクルにかける。</li>
	</ol>
</li>
	<li>押出による脂質小胞の形成<ol>
<li>製造元の指示に従って押出機を準備します。すべての押出機成分を脂質混合物の相転移温度までウォームアップする。</li>
		<li>押出機シリンジの1つに水和脂質混合物を充填する。脂質懸濁液の温度が押出機の温度と平衡化するのを5〜10分間待つ。</li>
		<li>脂質混合物を膜を通して少なくとも10回押し出す。最終的な押出のために、脂質懸濁液を代替シリンジに入れ、わずかに漠然とした溶液から透明な溶液への外観の変化を探す。</li>
		<li>得られた脂質小胞の混合物を4°C、好ましくはアルゴンまたは窒素の不活性雰囲気中で、3〜4日間保存する。凍結しないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3.全血からの血小板の単離
<ol><li>健康なドナーから全血を3.2%クエン酸ナトリウムを含むチューブに集めます。</li>
	<li>プロスタグランジンE1(PGE1)(1 μM)およびアピラーゼ(0.1 U/mL)を血液に加え、室温で100 × g で8分間遠心分離した。</li>
	<li>遠心分離後、血小板が豊富な血漿を取り、クエン酸ナトリウム溶液(106 mM、pH 5.5)を血漿/クエン酸比3:1になるように加えます。血漿を室温で400× g で5分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を除去し、ペレットをBSAを含まない300 μLのタイロード緩衝液(20 mM HEPES、150 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl 2、0.4 mM NaH2PO4、2.5 mM CaCl2、5 mM グルコース、pH 7.4)に再懸濁した。血小板精製用のゲル濾過培地上でのゲルクロマトグラフィーにより血漿タンパク質から血小板を精製する(材料表参照)。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーによるタンパク質-脂質相互作用の検出
<ol><li>運動結合実験<ol>
<li>リン脂質小胞(工程2.4.4から)をタイロード緩衝液(20 mM HEPES、150 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mMMgCl2、0.4 mM NaH 2PO4、2.5 mM CaCl2、5 mM グルコース、0.5% BSA、pH 7.4)で1 μMの濃度および全容量250μLまで希釈する。</li>
		<li>ステップ1の蛍光標識凝固第X因子(fX-fd)を500nMの濃度で、ステップ4.1.1のリン脂質小胞と1:1の比率(最終小胞濃度0.5μM、fX-fd濃度は250nMのfX)で全量500μLに混合する。</li>
		<li>500μLの混合懸濁液を直ちに(低流速での分析のために〜20分間)フローサイトメーターに注入する。低流量を使用し、チャネルFL2(例:488nm、発光フィルタ585/42nm)の閾値が値200であることを確認します。 材料表から蛍光色素のチャネルFL4(exсitation 633nm、発光フィルター660/20)の平均蛍光を測定します。 メモ: オートサンプラーのないサイトメーターを選択してください。これにより、測定セルへのサンプルの注入プロセスが高速化されます。</li>
		<li>結合の飽和が達成されたら(5分以内に蛍光の有意な増加なし)、タイロード緩衝液でサンプルを20倍に急速に希釈し、ベースライン蛍光に達するまで(完全な解離)、またはプラトーに達するまで(5分以内に蛍光の有意な減少なし)解離をモニターする。 メモ:コントロールとして、10 μM EDTAを加え、完全な解離を5分間監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>平衡結合実験 メモ: 結合の動力学曲線を使用して、飽和に達するまでの時間を決定します。fX-fdおよび人工小胞の飽和時間は20分である。<ol>
<li>結合アッセイ用の人工リン脂質小胞(5 μM)を、異なる濃度のfX-fd(0~1,000 nM)とともにタイロード緩衝液中で20分間インキュベートします。</li>
		<li>各サンプルをステップ 4.2.1 から 20x 20x に希釈し、Tyrode のバッファーで最終容量 200 μL にします。希釈したサンプルを直ちに30秒以内にフローサイトメトリーにより分析する。ステップ 4.1.3 の設定を使用します。 注:非特異的結合の対照として、EDTA(10 μM)で同様のサンプルを使用し、5分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. フローサイトメトリーデータの解析
<ol><li>FSC形式の実験をサイトメトリーデータ収集ソフトウェアからサイトメーターソフトウェアにエクスポートしてデータ分析します( 材料表を参照)。 ファイル|を選択|のエクスポートFCS ファイル。サイトメーターソフトウェアでFSCファイルを開き、コンピュータ上のファイルを選択し、プログラムのワークスペースにドラッグしてデータ分析します。</li>
	<li>マイクロベシクルのゲーティングのために、親油性色素DiIC16(3)の蛍光によってマイクロベシクルの領域を同定する。ワークシートのメニューコマンドまたは プロット ボタンを使用して、FL2(色素DilC16(3))からログ座標にドットプロットSSCを作成します。 [長方形のゲート] ボタンを選択してゲーティング領域を描画し、小胞のないサンプルからのイベントがこの領域に含まれないようにします (図 1B、C)。</li>
	<li>運動実験を分析します。<ol>
<li>小胞の領域の経時的な蛍光の座標(FL4)を使用してドットプロットを作成します(ステップ5.2で小胞の領域をダブルクリックします)</li>
		<li>経時的な蛍光の変化に関するデータをcsv形式でエクスポートします。サンプル|を選択右クリック ||のエクスポートFL4とパラメータの時間|を選択します|を保存するディレクトリを選択CSV形式の|を選択エクスポート。</li>
		<li>統計ソフトウェアでCSVファイルを開きます( 資料表を参照)。1,000 イベントごとに蛍光と時間の単純移動平均を計算します。</li>
		<li>指数依存性の仮定の下での単純移動平均蛍光の時間依存性のグラフを近似し(分析&gt;フィッティング&gt;非線形カーブフィット)し、これを使用してEq(5)を使用して動力学関連定数を計算します。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq05v2.jpg">(5) ここで 、[XB] は、ステップ5.3.3からの単純移動平均による各瞬間における束縛因子濃度(ユーザー定義単位)です。 [X] は添加因子濃度であり; [X]max は最大結合因子濃度であり、 k はアソシエーション定数です。 t は時刻です。</li>
		<li>同じ一連のアクション(5.3.1-5.3.4)を繰り返し、Eq(6)を使用して運動解離定数を計算します。 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq06v2.jpg">(6) ここで 、[XB] は各瞬間における結合因子濃度です。 [X]0 は、最初の瞬間における結合因子濃度です。 k は解離定数である。 t は時刻です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>平衡結合アッセイ<ol>
<li>fX-fdの各選択された濃度について小胞の領域におけるfX−fdの平均蛍光を求める。</li>
		<li>単純な単一部位結合の仮定における添加因子の濃度から結合因子蛍光の依存性を近似する。平均結合パラメータは、少なくとも3つの独立した反復からEq(7)を使用して計算します。 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq07v2.jpg">(7) ここで、[XB]は結合因子濃度であり;[X]は添加因子濃度であり;nxは、小胞あたりの結合部位の見かけの数であり;Kdは見かけの解離定数である。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 蛍光強度を平均結合部位数に変換する
<ol><li>校正済みビーズを準備します。<ol>
<li>ゲル濾過血小板をA23187(10 μM)と共にCaCl2(2.5 mM)の存在下で室温で10分間インキュベートする(ステップ3.3を参照)。</li>
		<li>活性化血小板に様々な濃度のfX-fd(0〜1,000nM)を加える。2% v/vホルムアルデヒドを加え、1時間インキュベートします。血小板を3 Mグリシンおよび5%BSAと共に室温で30分間インキュベートすることによって反応を停止する。</li>
		<li>未反応染料から混合物を精製する。血小板を400 × gで5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットをタイロード緩衝液(0.5%BSAを含む)に再懸濁する。 メモ: 手順 6.1.3 を 3 回繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>まず分光蛍光計( 材料表の蛍光色素の場合、励起633nm、発光670nm)を使用して各サンプル中の較正ビーズの蛍光レベルを測定し、次にフローサイトメーター(チャネルFL4内:励起633nm、発光フィルター660/20)を使用して測定します。セルカウンターを用いて、各サンプル中のビーズ数を求める。</li>
	<li>分光蛍光光度計を用いて各ビーズ試料の蛍光強度を可溶性蛍光色素の濃度に変換する。Eq(8)を用いて蛍光色素分子数に対する蛍光色素濃度を再計算する。 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq08.jpg">(8) ここで、Nxは蛍光色素分子の数です。Cは蛍光色素濃度であり;NA はアボガドロ定数です。02214076×1023モル-1.</li>
	<li>任意の統計ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、各サンプルの蛍光色素分子の数(ステップ6.3を参照)に対するフローサイトメーター(ステップ6.2)のビーズの平均蛍光の依存性グラフを作成します。この依存性を線比例性で近似する(分析|フィッティング|線形にフィット)。Eq(9)における近似から、結合部位に対する平均蛍光の変換係数を算出する。 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq09.jpg">(9) ここでMFはフローサイトメトリーによるビーズの平均蛍光であり;Nxはビーズあたりの蛍光色素分子の数です。CFは、結合部位に対する平均蛍光の変換係数を表す。CF及びbは、線形比例によりグラフをフィッティングした結果から求められる。</li>
	<li>Eq(10)を用いて目的の小胞あたりの結合部位の見かけの数を計算する。 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq10.jpg">(10) ここで、nxは、目的の小胞あたりの結合部位の見かけの数であり;MFは、フローサイトメトリーによる目的の小胞の平均蛍光であり;CFおよびbは、Eq(8)からの変換係数である。</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+model+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li>
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<li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry%3A+roles+of+geometry%2C+flow+and+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li>
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</ol>

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

提案された方法は、様々な供給源および組成物からのタンパク質とリン脂質膜との相互作用の大まかな特徴付けに適合させることができる。ここで説明する定量的フローサイトメトリーは、いくつかのパラメータで表面プラズモン共鳴(SPR)を認めています。特に、感度と時間分解能が低く、タンパク質の蛍光標識が必要です。蛍光標識は、多くのタンパク質の立体構造の変化および活性の喪失につながる可能性があるため、慎重な制御が必要です。ただし、この手法には他の手法よりも大きな利点があります。この方法は、SPRを使用して容易に実施されない天然の細胞膜とのタンパク質の相互作用を探索する機会を提供する。さらに、このアプローチは、膜表面上のタンパク質結合部位の数の推定を可能にし、いくつかの分析タスクにとって効率的であり得る。 
市販のビーズは、いくつかの蛍光色素が結合部位をカウントするために入手可能である。しかしながら、多くの広く使用されている染料にはそのようなビーズはない。したがって、自作のビーズはこれを解決する最良の方法です。他のすべての実験と同じ細胞をこれらのビーズを調製するために使用した。しかし、ビーズは洗浄時に...

生体膜は、動物細胞の内部内容物と細胞外空間を分離する。膜はまた、細胞のライフサイクルおよび細胞小器官の間に形成された微小小胞を囲むことに留意されたい。細胞膜は、主に脂質およびタンパク質からなる。膜タンパク質は、シグナル伝達、構造的、輸送的、および接着機能を実行する。しかしながら、脂質二重層は、動物細胞と細胞外空間との相互関係にも必須である。本稿では、外部タンパク質と脂質膜との末梢相互作用を研究する方法を提案する。
動物細胞の外膜層で起こる反応の最も顕著な例は、血液凝固反応である。血液凝固の重要な特徴は、すべての主要な反応が、血漿中ではなく、これらの細胞から生じる細胞および微小小胞のリン脂質膜上で進行することである1,2,3。膜依存性反応には、凝固を開始するプロセス(組織因子の関与を伴う内皮下、炎症を起こした内皮、または活性化免疫細胞の細胞膜上)、因子IX、X、プロトロンビンの主なカスケード活性化のすべての反応が含まれる。トロンビンによる第XI因子の活性化(活性化血小板、赤血球、リポタンパク質、および微小小胞の膜上);プロテインC経路の反応;凝固酵素の不活性化(トロンボモジュリン補因子、内皮タンパク質C受容体、ヘパラン硫酸の関与を伴う内皮細胞の膜上);接触経路反応(未知の補因子の関与を伴う血小板およびいくつかの微小小胞の膜上)。したがって、様々な血漿タンパク質と血球の膜との相互作用を研究することなしに血液凝固を調べることは不可能である。
この論文では、タンパク質と細胞または微小小胞の脂質膜との相互作用を特徴付けるためのフローサイトメトリーベースの方法について説明します。このアプローチは、血漿と血小板および人工リン脂質小胞との相互作用を研究するために最初に提案された。さらに、研究されたタンパク質のほとんどは、負に荷電した膜リン脂質、特にホスファチジルセリン4,5と直接相互作用する。さらに、膜との相互作用が特別な受容体6によって媒介されるタンパク質がある。
フローサイトメトリーの重要な能力は、追加の分離なしに遊離リガンドと結合リガンドを区別することです。サイトメトリーのこの特徴は、エンドポイントにおけるリガンド平衡結合の研究を可能にし、連続的な動態測定の実行に役立ちます。この技術は洗練されておらず、複雑なサンプル調製を必要としません。フローサイトメトリーは、インタクトで洗剤透過性の好中球における蛍光ペプチド、受容体、およびGタンパク質間の相互作用のダイナミクスを定量的に研究するために積極的に使用されている7。このアプローチは、タンパク質-DNA相互作用およびエンドヌクレアーゼ活性の動態をリアルタイムで探索するためにも適用可能である8。時間が経つにつれて、この方法は、精製脂質小胞9との高親和性タンパク質間相互作用、またはより一般的には、高効率Sf9細胞発現系10において発現される膜タンパク質との高親和性タンパク質間相互作用を定量的に研究するために使用された。膜貫通タンパク質11に対するフローサイトメトリーを用いてタンパク質−リポソーム相互作用を特徴付けるための定量的方法も記載されている。
この技術は、市販のビーズ7の使用を避けるために、自作の較正ビーズを使用する。以前に使用した較正ビーズ7 はフルオレセインと連携することを意図しており、タンパク質上のアクセス可能な蛍光リガンドの品揃えを実質的に制限していました。さらに、このホワイトペーパーでは、合理的な時間分解能を得るためにキネティックデータを取得および分析する新しい方法を提供します。この方法は人工リン脂質小胞について記載されているが、細胞、天然小胞、または異なる脂質組成を有する人工リン脂質小胞に対するその適応性について明らかな制限はない。本明細書に記載される方法は、相互作用(kon、koff)および平衡(Kd)のパラメータの推定を可能にし、膜上のタンパク質結合部位の数の定量的特徴付けを容易にする。この手法は、結合部位の数のおおよその推定値を提供することに注意してください。この方法の利点は、その相対的な単純さ、アクセシビリティ、および天然細胞および天然および人工微小小胞への適応性である。

<table><tbody><tr><td>A23187</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A37573</td><td>蛍光色素</td></tr><tr><td>ジャガイモ由来アピラーゼ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2230</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCantoII</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>VWR ライフサイエンス AMRESCO</td><td>Am-O332-0.1</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム、無水、粉末、&ge;97%</td><td>シグマAldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>ケアリーエクリプス蛍光分光計</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマAldrich</td><td>G7528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DiIC16(3)(1,1'-ジヘキサデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D384</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマAldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩</td><td>VWRライフサイエンスAMRESCO</td><td>Am-O105B-0.1</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva</td><td>BDバイオサイエンス</td><td></td><td>サイトメトリーデータ収集ソフトウェア</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>データ分析用サイトメーターソフトウェア</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>ヒューマンファクターX</td><td>酵素研究</td><td>HFX 1010</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン塩酸塩</td><td>Panreac</td><td>141914.1209</td><td></td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルコリン(脳、ブタ)</td><td>Avanti極性脂質</td><td>840053P</td><td></td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルセリン(脳、ブタ)(ナトリウム塩)</td><td>Avanti極性脂質</td><td>840032P</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>ミニ押出機</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>610020-1EA</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 錠剤、バイオテクノロジーグレード</td><td>VWR ライフサイエンス AMRESCO</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>プロスタグランジン E1</td><td>ケイマン ケミカル</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0033-01</td>タンパク質<td>精製用ゲルろ過媒体</td></tr><tr><td>セファロースCL-2B</td><td>シグマ Aldrich</td><td>CL2B300-500ML</td><td>血小板精製用ゲルろ過媒体</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>コーニング</td><td>61-065-RO</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>シグマAldrich</td><td>S3139-250G</td><td></td></tr><tr><td>Spin collumns with membrane 0.2 &micro;m</td><td>ザルトリウス</td><td>VS0171</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸三ナトリウム二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光標識タンパク質と人工リン脂質マイクロベシクルの定量的フローサイトメトリーによる相互作用の解析

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

人体では、免疫反応や血液凝固に関わる主要な生理反応のほとんどが細胞の膜上で進行します。任意の膜依存性反応における重要な第1段階は、リン脂質膜上のタンパク質の結合である。タンパク質と脂質膜との相互作用を研究するアプローチは、蛍光標識タンパク質およびフローサイトメトリーを用いて開発されている。この方法は、生細胞および天然または人工リン脂質小胞を用いたタンパク質膜相互作用の研究を可能にする。この方法の利点は、試薬および装置の単純さと可用性です。この方法では、蛍光色素を用いてタンパク質を標識する。しかしながら、自作および市販の両方の、蛍光標識タンパク質が使用可能である。蛍光色素とのコンジュゲーション後、タンパク質をリン脂質膜の供給源(微小小胞または細胞)と共にインキュベートし、サンプルをフローサイトメトリーによって分析する。得られたデータは、動力学定数および平衡Kdを計算するために使用することができる。さらに、特別な較正ビーズを用いてリン脂質膜上のタンパク質結合部位のおおよその数を推定することができる。

本明細書に記載のフローサイトメトリー法は、活性化血小板への血漿凝固タンパク質の結合を特徴付けるために使用される。また、リン脂質小胞PS:PC 20:80をモデル系として適用した。本稿では、主に人工リン脂質小胞を例に挙げる。サイトメーターのパラメータ、特に、光電子増倍管(PMT)電圧および補償は、特定の装置、研究対象(細胞、人工または天然の微小小胞)、および使用される色素ごとに選択されなければならない。図1B、Cは、組み込まれた親油性蛍光色素DiIC16(3)を用いて〜1μmの大きさの人工リン脂質小胞をゲーティングする例を示す。大きな小胞サイズおよび親油性蛍光色素は、サイトメーターを使用して小胞を検出するのに役立ちました。ゲートは、同じサイズの人工脂質小胞を含むが蛍光色素を含まないサンプルに基づいて設定した(図1B)。このゲート内のイベントのみが解析で使用されました。
小胞へのタンパク質結合の動態を第1段階で分析した。このためのサン...

ここでは、タンパク質と細胞または微小小胞の膜との相互作用を特徴付けるための一連の方法について説明する。

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

この量のフローサイトメトリー法を用いて、研究者は膜相互作用を持ち込まれた動態的および平衡習慣を計算し、PPH膜上の部位によってもたらされたタンパク質の数を推定することができる。この方法の利点は、試薬および装置の単純さと可用性です。この方法は、基礎研究専用です。このプロトコルは、血液計算におけるタンパク質脂質相互作用を研究するために開発され、タンパク質と様々な脂質膜との相互作用を特徴付けるために他の分野で使用することができる。この方法は、様々な細胞およびリガンドタイプ上のリガンド結合ダイナミクスの量評価に使用することができる。タイロード緩衝液中のリン脂質小胞を1マイクロモルの濃度および250マイクロリットルの総量に希釈することによって、動態結合実験を開始する。次いで、蛍光標識凝固第X因子またはFX FDと500ナノモルの濃度とリン脂質小胞とを1対1の比率で混合し、500マイクロリットルの総体積を得る。直ちに500マイクロリットルの混合懸濁液をフローサイトメーターに注入する。励起波長が488ナノメートル、発光フィルターが585ナノメートルの流量で、チャネルFL2の幅は42です。次に、チャネルFL4の平均蛍光を633ナノメートルの励起で測定し、発光フィルターを660ナノメートルで幅20で測定する。結合の飽和が達成されたら、試料をタイロード緩衝液で20倍に急速に希釈し、ベースライン蛍光またはプラトーに達するまで解離をモニターする。平衡結合実験のために、0から1000ナノモルまでのFX FDの様々な濃度を有する5マイクロモルの人工リン脂質小胞を、タイロードの緩衝液中で20分間インキュベートする。インキュベーション後、各サンプルをタイロード緩衝液で最終容量200マイクロリットルまで20倍希釈し、希釈サンプルを30秒以内にフローサイトメトリーで分析します。データを分析するには、実験をFSC形式でサイトメトリーデータ収集ソフトウェアからサイトメーターソフトウェアにエクスポートしてデータ分析します。ファイルを選択し、[エクスポート]タブと[FSCファイル]タブをクリックします。完了したら、コンピュータ上のファイルを選択し、ファイルをプログラムのワークスペースにドラッグして、FCSファイルをサイトメーターソフトウェアに開きます。マイクロベシクルをゲーティングするため、親油性色素、DIC163の蛍光によりマイクロベシクルの領域を特定する。次に、ワークシートのプロットボタンを使用して、対数座標でFL 2つのD I C 16からドットプロットSSCを作成します。次に、長方形のゲートボタンを選択してゲート領域を描画します。運動学的実験を分析するために、小胞の領域についての経時的な蛍光の座標を使用してドットプロットを作成する。次に、時間の経過に伴う蛍光の変化に関するデータをCSV形式でエクスポートします;サンプルを選択してエクスポートタブを右クリックし、次にパラメータでFL 4時間を選択し、CSV形式を選択してエクスポートタブを押す前に保存するディレクトリを選択します。転送後、統計ソフトでCSVファイルを開き、単純移動平均蛍光を算出し、指数依存性の仮定下での時間に対する単一移動平均蛍光の依存性のグラフを近似する1000イベント毎に時間、その値を用いて、式を用いて動態会合定数を算出する。次に、前述の式を使用して動力解離定数を計算します。平衡結合アッセイの日付を分析するには、FX FDの各選択された濃度について小胞の領域におけるFX FDの平均蛍光を決定し、次いで、単一部位結合の仮定において添加された因子の濃度から結合因子蛍光の依存性を近似する。平均結合パラメータは、少なくとも3つの独立した繰り返しからの式を使用して計算します。ゲル濾過血小板をカルシウムIANA 4A 23、187と共に2.5ミリモル塩化カルシウムの存在下で室温で10分間インキュベートすることによって較正ビーズの調製を進める。活性化血小板に様々な濃度のFX FDを加え、血小板を2容量パーセントのホルムアルデヒドでインキュベートします。1時間後、血小板を3モルのグリシンおよび5%BSAと共に室温で30分間インキュベートすることによって反応を停止させる。次いで、未反応染料から混合物を400倍Gで5分間遠心分離して精製する。0.5%BSAを含むTyrodeの緩衝液にペレットを再懸濁する前に、上着液を除去してください。次に、分光蛍光計を用いて各試料中の較正ビーズの蛍光レベルを測定し、次いでフローサイトメーターを用いて測定する。セルカウンターの助けを借りて、各サンプル中のビーズの数を決定します。分光蛍光光度計を用いて各ビーズ試料の蛍光強度を可溶性蛍光色素の濃度に変換し、分光蛍光光度計分子数に対する蛍光色素濃度を再計算する。各サンプルのフルロフォア分子の数に対するフローサイトメーター内のビーズの平均蛍光の依存性グラフを作成します。次に、解析フィッティングを使用して線比例によって依存関係を近似し、線形タブを順番に適合します。式中の近似から、結合部位に対する平均蛍光の変換係数を計算する。後で目的の小胞あたりの結合部位の見かけ数を計算する。代表的な分析は、組み込まれた親油性蛍光色素、色素IC16を有する1マイクロメートルのサイズである人工蛍光体脂質小胞のゲーティングを示し、ゲート蛍光色素を含まない同じサイズの人工脂質小胞を含む試料に基づいて設定した。小胞に結合するタンパク質の動態を、試料を連続的に採取することによって第1段階で分析した。得られたデータをフローサイトメトリーを用いて分析した。フローサイトメトリー測定は、溶液を混合し、タイロードの緩衝液で希釈した後、できるだけ早く開始する必要があります。提案された方法は、良好な一時的な分解能で高感度であり、送達をもたらす必要がない膜相互作用をもたらした研究のための表面血漿共鳴で補完することができるこの方法の主な利点は、そのアクセシビリティおよび単純さである。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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学ぶ 蛍光標識タンパク質と人工リン脂質マイクロベシクルの相互作用を定量的フローサイトメトリーで解析する方法。動的・平衡結合定数の算出や結合タンパク質数の推定が可能で、基礎研究に有用な簡便な手法です。

蛍光標識タンパク質と人工リン脂質マイクロベシクルの定量的フローサイトメトリーによる相互作用の解析

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