Name: マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学ぶマウス脳実質動脈内皮細胞の単離と機能解析法。蛍光イメージングと電気生理学により細胞内カルシウム動態と膜電位変化を測定し、脳血流調節メカニズムの解明に貢献する。

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この研究は、米国国立衛生研究所(R00AG047198 & R56AG062169からEJBへの助成金)によって支援されています。R00HL140106からPWP)およびアルツハイマー病協会(AZRGD-21-805835からPWP)が挙げられる。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所またはアルツハイマー病協会の公式見解を表すものではありません。

<ol><li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo%2C+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li>
<li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+K%2B-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li>
<li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer%27s+disease%3A+Is+Alzheimer%27s+a+vascular+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Alzheimer%27s+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimers+Disease%22%5BJournal%5D)">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li>
<li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316(2018).</li>
<li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Function%22%5BJournal%5D)">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413(2020).</li>
<li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li>
<li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging%3A+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li>
<li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389(2020).</li>
<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835(2016).</li>
<li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676(2019).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832(2019).</li>
<li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K%2B+channel+function%3A+Divergent+role+of+biological+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li>
<li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology%3A+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380(2019).</li>
<li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li>
<li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li>
<li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes%3A+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research+and+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391(2018).</li>
<li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer%27s+disease+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimers+Disease+Reports%22%5BJournal%5D)">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li>
<li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2%2B-activated+K%2B+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li>
<li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease--lessons+from+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206(2014).</li>
<li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arterial+lesions+underlying+lacunes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li>
<li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes%3A+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li>
<li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries%3A+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+and+IKCa+Channels%2C+myogenic+tone%2C+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles%3A+effect+of+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li>
<li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li>
<li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+TRPV3+channel+Ca2%2B+influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li>
<li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li>
<li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries%3A+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li>
<li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+of+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li>
<li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413(2020).</li>
<li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li>
<li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li>
</ol>

著者らは利益相反がないと宣言しています。

増え続ける証拠は、脳血管疾患(CVD)、老化、およびアルツハイマー病が強く相関しており、認知症研究の現在のトピックであることを示唆している4,8,14,21。したがって、脳血管網の研究は健康に広範な影響を与える一方で、疾患の状態の間、継続的な広範な調査を必要とすることは明らかである。脳灌流に対する血管抵抗の重要な点として、CVDの病因および発達における実質細動脈の一般的な重要性は、50年以上にわたって強調されてきた22。
しかしながら、単離された加圧実質細動脈11およびCaPA12調製物のようなエキソビボアプローチの最近の発症まで、無傷の実質細動脈およびそれらの複合細胞型を研究するための科学的検査ツールは十分に開発さ...

実質細動脈は、脳全体に必須の酸素と栄養素を直接供給します1。毛細血管とインターフェースしている間、血管活性の高い細動脈は、特定のニューロン領域2からの代謝シグナルを感知する毛細血管イオンチャネルによって開始される逆行性シグナル伝達に応答する。脳実質が歴史的に多くの研究を受けてきたことから、認知症の根底にある様々な脳血管障害(虚血性脳卒中、アルツハイマー病など)に関連する病理学的メカニズムを明らかにするために、内皮機能障害の役割が浮上しています3,4,5,6 .内皮は、血管セグメント全体にわたる遺伝学、構造、および機能の不均一性に従って、脳の灌流に不可欠である7。膝動脈は、その比較的大きなサイズ、高い分節性血管抵抗、および基礎となる大脳への血流分布における役割のために広範囲に研究されている8,9。したがって、動脈内皮機構のよりよい理解は、新しい治療レジメンの開発に向けて、健康および疾患における脳血流調節の理解を深める可能性が高い。
新たな証拠は、異なるシグナル伝達経路および疾患に関連して実質細動脈を研究することの重要性を強調している8,10。しかしながら、このアプローチは、無傷の加圧細動脈11および/または毛細血管実質細動脈(CaPA)調製物12を使用することに限定されている。新たに単離された、他の細胞型および交絡因子を欠いた天然の大脳動脈内皮細胞は、おそらくそれらの単離における技術的困難のために、検査されていない。本稿は、鰭状動脈内皮13の単離を強調した以前の技術を進化させ、脳実質細動脈の内皮を確実かつ再現性よく単離する(幅:~25μm、長さ:~250μm)。この技術は、個々の配向および細胞ネットワークにおける電気的および化学的に結合された細胞の最適な分解能を達成するのに役立つ。
関心のある主要な経路には、血管拡張16に不可欠な膜電位(Vm)14,15の細胞内Ca2+([Ca2+]i)シグナル伝達および過分極の相互作用が含まれ、血液が毛細血管に入り、酸素および栄養素を活動実質に送達することを可能にする17。これらの調製物は、Ca2+透過性、一過性受容器電位(TRP)およびK+チャネルを含むイオンチャネルのリアルタイム電気生理学的記録および/またはほぼ生理学的条件下での内皮細胞管内の細胞内小器官の蛍光イメージングを可能にする。これは、脳実質への脳血流送達の内皮細胞制御を支配する生理学的細胞機構に関心のある研究者にとって適切な技術である。全体として、この技術は、脳血管生理学および病理学に関連する質問に対処しながら、脳実質に埋め込まれた細動脈の基本的な内皮シグナル伝達経路およびネットワーク通信をよりよく理解するのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>アンプ分子</td><td>デバイス、サニーベール、カリフォルニア州、米国</td><td>Axoclamp 2B &Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>Audibleベースラインモニター</td><td>Ampol US LLC、サラソタ、フロリダ州、米国</td><td>&nbsp;BM-A-TM</td><td></td></tr><tr><td>バスチラー(Isotemp 500LCU)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13874647</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー(ピン留め)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>G150T-6</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー(シャープ電極)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>GC100F-10</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー(トリチュレーション)</td><td>ワールドプレシジョンズ(WPI)、フロリダ州サラソタ、米国</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA: ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2: 塩化カルシウム</td><td>Σ</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ (タイプ H ブレンド)</td> <td>Σ</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>カバー ガラス (2.4&nbsp;&times;&nbsp;5.0;>cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquision Digitizer</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td>Digidata 1550A</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)</td><td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td><td>DD-90-S-BLK</td><td></td></tr><tr><td>Dithioerythritol</td><td>Sigma</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>DMSO: ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>エラスターゼ(ブタ膵臓)</td><td>Sigma</td><td>E7885</td><td></td></tr><tr><td>小胞体トラッカー(ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E34250</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー光源</td><td>&nbsp;ショット、マインツ、ドイツ&KL200、Zeiss</td><td>Fostec 8375</td><td></td></tr><tr><td>フローコントロールバルブ</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>&nbsp;FR-50</td><td></td></tr><tr><td>蛍光システムインターフェース、ARCランプ&電源、ハイパースイッチおよびPMT</td><td>分子デバイス、サニーベール、カリフォルニア州、米国</td><td>IonOptixシステム</td><td></td></tr><tr><td>鉗子(細い先端、シャープ)</td><td>FST</td><td>デュモン#5&Dumont #55</td><td></td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td><td>FG-8002</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM dye</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>F14185</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HCl: Hydrochloric Acid</td><td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>A466250</td><td></td></tr><tr><td>Headstages</td><td>Molecularデバイス</td><td>HS-2A&HS-9A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES: (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)</td><td>Σ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>インライン ソリューション ヒーター</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl: 塩化カリウム</td><td>Σ</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2: 塩化マグネシウム</td><td>Σ</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>成茂, イーストメドウ, ニューヨーク, USA&</td><td>nbsp;MF-900</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>シスキユー</td><td>&nbsp;MX10</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー (デジタル)</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td><td>P-97 or P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Nikon-inverted)</td><td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td>TS2</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Nikon-inverted)</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡対物レンズ</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡プラットフォーム(陽極酸化アルミニウム;直径、7.8&nbsp;cm)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>PM6またはPH6</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ステージ(アルミニウム)</td><td>シスキユー、グランツパス、オレゴン州、米国</td><td>8090P</td><td></td></tr><tr><td>マイクロシリンジポンプコントローラー</td><td>ワールドプレシジョンズ(WPI)、サラソタ、フロリダ州、米国</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>MTA:2-メチルチオアデノシン二リン酸三ナトリウム塩</td><td>トクリス</td><td>1624</td><td></td></tr><tr><td>NaCl:塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaOH: 水酸化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>核染色 (NucBlue Live ReadyProbes 試薬;Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix, Beaverton, Oregon,</td> <td>USA&nbsp;TDS 2024B</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>位相コントラスト対物レンズ</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>.&nbsp;(Ph1 DL;10倍 &20X)</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas superfusion chamber</td><td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td><td>RC-27</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (3 mm & 7 mm blades)</td><td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td><td>Moria MC52 & 15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (Vannas style; 9.5&nbsp;mm&3&nbsp;mm ブレード)</td><td>World Precision Instruments</td><td>555640S, 14364</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopes</td><td>Zeiss, NY, USA</td><td>Stemi 2000 & 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター (0.22 & micro;m)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>722-2520</td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラー(デュアルチャネル)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>TC-344BまたはC</td><td></td></tr><tr><td>バルブ制御システム</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>VC-6</td><td></td></tr><tr><td>振動除振テーブル</td><td>テクニカルマニュファクチャリング、ピーボディ、マサチューセッツ州、米国</td><td>&nbsp;マイクロG</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

脳血流は、血管抵抗動脈および下流実質細動脈によって搬送される。血流に対する定常状態の血管抵抗は、動脈から細動脈までの直径の減少とともに増加し、最終的に毛細血管に供給される。細動脈は実質におけるサイズと位置が小さいため、比較的研究されておらず、表面の円錐骨動脈よりも所見の再現性が低い。いずれにせよ、慢性変性疾患の生理学および病因に不可欠な動脈内皮細胞の構造および機能は、広範な調査を必要とする。特に、新たな証拠は、侵害された内皮機能が認知障害および認知症に先行し、悪化することを示している。
実質微小循環において、内皮K+チャネル機能は、血管拡張の広がりを細かく制御し、ニューロン活性領域への血流の増加を促進する最も堅牢な刺激である。この論文は、マウス脳実質細動脈から無傷で電気的に結合された内皮「チューブ」(直径、〜25μm)を新たに単離するための洗練された方法を示す。動脈内皮チューブは、生理学的条件(37°C、pH7.4)中に固定され、細胞内Ca2+ダイナミクス、膜電位の変化、膜脂質調節など、K+チャネル機能とその調節を包含する実験変数を解く。動脈内皮に対する明確な技術的利点は、細胞および細胞小器官(例えば、ミトコンドリア)次元の形態学的分解能の増強であり、これはこの技術の有用性を拡大する。生涯を通じて健康な脳灌流は、実質細動脈における堅牢な内皮機能を伴い、血流を脳の正確な解剖学的領域全体にわたるニューロンおよびグリア活性の燃料供給に直接結びつける。したがって、この方法は、健康な脳と病気の脳に関する血管生理学と神経科学の一般的な知識を著しく進歩させることが期待されます。

プロトコルのデモンストレーションを図1に示し、動脈解剖および内皮管単離ステップをそれぞれ図2および図3として示す。ここで、内皮機能は、薬理学的物質[2−メチルチオアデノシン二リン酸(MTA)、強力なプリン作動性受容体(P2YR)アゴニスト]に応答して、Fura−2測光法およびシャープ電極電気生理学(図4A)を用いて[Ca2+]iおよびVmを測定することによって評価した。 MTA(1μM)を印加すると、[Ca2+]iは急速に増加し(図4B)、付随する過分極(図4C)を伴う。これらの測定は、Gqタンパク質共役型受容体(P2YR)の活性化とそれに続く、内皮依存...

脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

この方法は、脳内血流を脳全体のニューロンおよびグリア活動の燃料補給に直接結びつける実質動脈内皮の機能に関するより良い洞察を提供する。細動脈内皮に対する明確な技術的利点は、個々の脳内皮細胞およびそれらのそれぞれの細胞小器官間の形態学的寸法およびカルシウムおよび電気シグナル伝達の分解能の向上である。当初、脳内皮の単離および検査は非常に困難である。しかし、忍耐と献身を伴う十分な練習でこのテクニックを習得することは可能です。ビーカーまたはペトリ皿に入れた冷たい解剖溶液で孤立した脳を洗浄し、脳の表面から残りの血液を除去する。冷たい解剖溶液を入れたチャンバー内に腹側を上向きに置き、実質細動脈を単離する。実質細動脈を単離するには、深さ50センチメートル以上の木炭注入シリコンポリマーコーティングを含むペトリ皿内の冷たい解剖溶液中のスチールピンで単離された脳を固定する。MCAの周囲に鋭く整列した解剖ハサミで両半球から脳組織の長方形を切り取り、組織セグメントの上部がウィリスの円からの分岐点を過ぎていることを確認する。MCAをスチールピンで上に向けて脳組織を皿に固定します。ピンの近くに慎重に浅い切開を行い、小さな鉗子でピアを取り除き、一方の端から他方の端に向かって静かに剥がします。MCAから分岐した実質細動脈を有する孤立した鯨毛をピンで皿に注意深く固定し、実質細動脈を注意深く解剖する。残りの遠位枝を切り取り、細動脈が清潔で組織が付着していないことを確認します。酵素消化のためにこのきれいな無傷の細動脈を使用してください。あるいは、酵素消化のために各細動脈を2つに切断し、必要に応じて内皮チューブを調製する。動脈セグメントの部分消化のために、無傷の動脈セグメントを、パパイン、ジチオエリスリトール、コラゲナーゼ、およびエラスターゼを含む10ミリリットルのガラス管内の1ミリリットルの解離溶液に入れる。動脈セグメントを摂氏34度で10〜12分間インキュベートする。動脈内皮管を単離するには、マイクロシリンジインジェクタに取り付けられた摩砕ピペットをチャンバ内の解離溶液中に置き、消化された血管セグメントの一端の近くに配置する。穏やかな摩砕のためにポンプコントローラで毎秒1〜3ナノリットルの範囲内で速度を設定します。100倍〜200倍の倍率を維持しながら、動脈セグメントをピペットに引き抜き、次いで注入して外生細胞および平滑筋細胞を解離させる。すべての平滑筋細胞が解離し、内皮細胞のみが無傷のチューブとして残るまで、血管セグメントを粉砕する。マイクロマニピュレーターでは、ホウケイ酸ガラスピン留めピペットでチャンバー内のガラスカバースリップに内皮チューブの両端を固定して内皮膜電位を測定し、4倍の対物レンズを通して見ながら、動脈内皮チューブの細胞のすぐ上の鋭い電極先端をマイクロマニピュレーターで流れる生理

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、ニューロンやグリア細胞とともに血液脳関門(BBB)を構成するマウスの脳から無傷の血管が分離される様子を示しています。単離された血管は、脳の恒常性を維持する役割を研究するためのin...

マウス脳血管の単離:マウス脳サンプルから無傷の血管を単離するためのプロトコル

このビデオでは、マウスの脳実質から内皮管を分離する方法を実演しています。酵素による消化と機械的解離の組み合わせにより、このプロセスにより、内皮細胞が無傷のチューブが得られます。...

マウス実質細動脈からの脳内皮チューブの準備

出典:Hakim, M. A. et al., Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. Exp.

マウス細動脈内皮におけるカルシウム動態と膜電位変化の解析

脳微小血管内皮細胞(BMEC)は、血液と中枢神経系(CNS)を分離する高度に制御された障壁を形成する特定の接合タンパク質によって相互接続されています。このプロトコルで述べられているように、初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離により、BBBの詳細なin...

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

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単離および脳実質細動脈のカニューレ挿入

人間の脳組織から分離脳の毛細血管は、生理学的および病態生理学的条件下でバリア機能を研究する臨床モデルとして使用できます。ここでは、新鮮な人間の脳から脳の毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルを提案する.

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

本稿では、電気生理学的、カルシウム...

Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々...

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

本原稿では、海馬動脈と毛細血管をマウス脳から分離する方法と、圧力ミオグラフィー、免疫蛍光、生化学、分子研究のためにそれらを加圧する方法について詳しく説明している。...

機能的研究のためのEx Vivo加圧海馬毛細血管-パンレンキマル動脈製剤

学ぶマウス脳実質動脈内皮細胞の単離と機能解析法。蛍光イメージングと電気生理学により細胞内カルシウム動態と膜電位変化を測定し、脳血流調節メカニズムの解明に貢献する。

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

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