バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定
2022年1月31日
ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの実験室で容易に実施できる単純で十分に確立された比色アッセイを使用して提供される。
ここでは、動物組織中の非ヘム含有量を測定するためのプロトコールを提供した。ほとんどの研究室で簡単に実装できるシンプルで確立された比色アッセイを使用します。バソフェナントロリンベースの比色アッセイは、高度なスキルや非常に高価な装置を必要とせず、マイクロプレート形式に適合させてサンプルスループットと費用対効果を高めることができます。
このプロトコルは、鉄過負荷または鉄効率の様々な実験動物モデルにおける組織鉄レベルの変化を検出するのに適している。メスの刃で10〜100グラムの重さの組織サンプルを切ることから始めます。パラフィルムの小さな部分の上に分析天秤で正確に計量してください。
プラスチックピンセットを使用して、組織片を24ウェルプレートに配置します。65°Cの標準的なインキュベーターで48時間乾燥させます。あるいは、スティックピンセットを使用してウェイド組織片を鉄を含まないテフロンカップに入れ、実験室の電子レンジ消化オーブンで乾燥させる。
各乾燥した組織片を分析天秤内のパラフォームの小さな部分の上に置き、正確に計量します。各乾燥組織片を1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に移す。酸混合物の照明をチューブに追加し、それを閉じる。
ここで組織を省略した以外は同様にして酸ブランクを作製した。チューブを摂氏65度で20時間インキュベートして組織を消化する。室温まで冷却した後、プラスチックチップを取り付けたマイクロピペットを使用して、500マイクロリットルの透明酸抽出物を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に移した。
色原体反応を平底96ウェルの透明な未処理ポリスチレンマイクロプレートに直接調製する。室温で15分間インキュベートした。サンプル吸光度をプレートリーダーで波長535ナノメートルで脱イオン水基準に対して測定します。
キュベットおよび96ウェルマイクロプレートベースの比色アッセイによる非ヘム鉄の決定がここに示されている。生後6ヶ月の雄の黒人、肝臓、脾臓、心臓、肺および骨髄を含む6匹のマウスからの55の組織サンプルにおけるキュベットベースのおよびマイクロプレートベースの非ヘム鉄レベルとの間の相関をここに示す。2つの方法論間の高い相関関係は、マイクロプレートベースの方法が元のキュベットベースの方法の有効な代替手段であることを示しています。
最後に、非ヘム鉄レベルを、塩酸とトリクロロ酢酸の混合物または塩酸単独のいずれかを用いて同じ組織に由来する試料を酸性消化した後、マイクロプレートベースの方法で定量した。高い相関関係は、トリクロロ酢酸が酸消化から放出され得ることを示している。代表的な画像は、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定された黒6匹の遺伝的背景上の雄の黒6匹野生型マウスおよび雄ヘプシジンノックアウトマウスの肝臓、脾臓、心臓および膵臓における非ヘム鉄レベルを示す。
ヘプシジンの破壊は、重度の肝臓、膵臓および心臓の鉄蓄積および脾臓鉄枯渇を伴う鉄沈着表現型のようなヘモクロマトーシスをもたらす。実験的な鉄変調に続く幼い雌のヨーロッパスズキにおける肝臓非ヘム鉄レベルがここに示されている。肝臓の鉄レベルは、鉄処理された動物において大幅に増加した。
一方、貧血は肝臓の鉄貯蔵に軽度の減少を引き起こした。代表的な画像は、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定された生後1ヶ月のショウジョウバエの非ヘム鉄レベルを示す。結果は、20匹のハエの各プールにおける非ヘム鉄含有量または各ハエの推定鉄含有量を示す。
フライあたり0.64ミリグラムの平均重量を考慮すると。この手順を試みている間は、すべてのガラスの摩耗を完全にきれいにし、汚染の危険性があるため、金属実験材料が試薬または溶液と接触しないようにすることを忘れないでください。
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概要
本記事では、比色定量法を用いて動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルを提供します。この手法は簡便であり、ほとんどの研究室で実施可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 動物生理学
背景
- 非ヘム鉄は、さまざまな生物学的プロセスにおいて極めて重要です。
- 鉄レベルを測定することで、鉄過剰症や鉄欠乏症の理解に役立ちます。
- このアッセイは、さまざまな研究室の設定に適応可能です。
- さまざまな実験動物モデルに適しています。
研究目的
- 組織内の鉄レベルを評価するための信頼性の高い手法を提供すること。
- 動物モデルにおける鉄代謝の研究を促進すること。
- 組織サンプルのハイスループット解析を可能にすること。
使用方法
- Bathophenanthrolineを用いた比色定量法。
- 重量10～100 gの組織試料を用意する。
- 分析天秤を用いて試料を正確に計量する。
- 本手法はマイクロプレート形式に適合させることが可能である。
主な結果
- このアッセイでは、非ヘム鉄を正確に測定できます。
- 組織内の鉄レベルの変化を検出するのに有効です。
- このプロトコルは操作が簡単で、コスト効率に優れています。
- マイクロプレートに適応させることで、高いサンプル処理能力を実現できます。
結論
- このプロトコルは、鉄代謝を研究する研究者にとって価値のあるツールです。
- さまざまな研究室環境で実施することが可能です。
- 今後の研究において、この手法をより幅広い用途に活用できます。
よくある質問
業界における重要性
組織内の非ヘム鉄の定量測定は、鉄代謝および関連疾患に焦点を当てた初期探索プログラムのリスクを低減するために極めて重要です。バトフェナントロリンを用いた比色定量法は、前臨床モデルにおける鉄状態のスケール可能で再現性のある評価を可能にし、ターゲットの妥当性確認やメカニズム研究を支援します。その簡便さとスループットにより、多様な実験系における堅牢なポートフォリオの選別とトランスレーショナルな連続性が促進されます。
バイオファーマ研究開発における戦略的活用
初期発見およびターゲット検証
- 非ヘム鉄の精密な定量により、鉄恒常性メカニズムの解析が可能になります。
- 動物モデルにおける遺伝学的または薬理学的介入の機能的検証をサポートします。
- 非ヘム鉄プールとヘム鉄プールを区別することで、メカニズムに基づくリスク低減（de-risking）を促進します。
- 鉄過剰または鉄欠乏に関与するターゲットの優先順位付けに不可欠なデータを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイ開発パイプラインに適した、標準化され再現性のあるアウトプットを提供します。
- マイクロプレートへの適応により、化合物や遺伝子のスクリーニングキャンペーンのスループットが向上します。
- 定量的な吸光度読み取りにより、実験条件間の信頼性の高い比較が可能になります。
- アッセイの柔軟性により、多様なスクリーニングプラットフォームへの統合がサポートされます。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー研究に向けた、鉄過剰および鉄欠乏の疾患関連モデルと整合しています。
- 種間解析をサポートすることで、探索から前臨床検証までの連続性を可能にします。
- 鉄関連プログラムにおけるリスク調整後の進展判断のための定量的なエンドポイントを提供します。
- 遺伝子組換えモデルまたは薬理学的処置モデルにおけるメカニズム研究をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この比色アッセイは、初期探索から前臨床までの連続的な研究フローに適合し、鉄代謝における仮説検証、ターゲットバリデーション、およびトランスレーショナルリサーチを可能にします。
- 探索生物学： 動物モデルにおける鉄調節経路の仮説駆動型解析をサポートします。
- スクリーニング： 化合物や遺伝的修飾因子のスクリーニングに利用可能な、アッセイ即応かつスケーラブルなアウトプットを提供します。
- 分析： 組織中の鉄レベルを堅牢に統計比較するための定量的な吸光度データを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： 疾患関連システムにおけるバイオマーカーの整合および種間バリデーションを促進します。
- 企業内での再利用： R&Dプログラム全体で利用可能な、広範に適用でき費用対効果の高い鉄定量プラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションおよび鉄代謝のメカニズム研究における予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：拡張可能で再現性のあるワークフローにより、組織内鉄測定を標準化する。
- 戦略的価値：根拠に基づいたgo/no-go判断を可能にし、鉄関連ポートフォリオにおける後期の生物学的リスクを軽減する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付け、および創薬・前臨床資産の推進をサポートする。
実施上の検討事項
- 基本的な実験スキルおよびマイクロプレートリーダーなどの標準的な分析機器が必要です。
- データの整合性を維持するため、ガラス器具の徹底的な洗浄と金属汚染の回避が求められます。
- 検証済みプロトコルと定量的な出力により、チーム間での標準化が可能です。
- 最小限のプロトコル変更で、さまざまな動物モデルや組織タイプに適応させることができます。
- スループットと拡張性は、利用可能なプレートリーダーの能力およびサンプル調製のリソースによってのみ制限されます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Sample Drying
1:33
Sample Acidic Digestion
2:11
Color Development and Absorbance Reading
2:36
Results: Cuvette Versus 96-Well Microplate Comparison, Measurement of Non-Heme Iron Levels in a Mouse Model of Genetic Hemochromatosis, in Sea Bass Liver, and Whole Drosophila melanogaster
4:41
Conclusion
