Name: 糸状シアノバクテリウム・ホルミジウム・ラクナの自然形質転換、タンパク質発現、凍結保存 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学ぶ糸状シアノバクテリウムPhormidium lacunaの自然形質転換法と運動性解析。Oscillatoriales目の遺伝子操作に初めて成功し、海洋環境由来のこの生物を用いた基礎研究とバイオテクノロジー応用への新たな道を開く。

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この研究はカールスルーハー工科大学の支援を受けた。

<ol><li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research-Biomass+Biofuels+and+Bioproducts%22%5BJournal%5D)">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li>
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<li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li>
<li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li>
<li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium%2C+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li>
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<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li>
<li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologie+Agronomie+Societe+et+Environnement%22%5BJournal%5D)">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp%2C+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li>
<li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+%28Subsection+V%29+Fischerella+and+Chlorogloeopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li>
<li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454(2020).</li>
<li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li>
<li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li>
<li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li>
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<li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li>
<li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp%2C+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li>
<li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Nova+Hedwigia%22%5BJournal%5D)">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li>
<li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li>
<li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%3A+MGG%22%5BJournal%5D)">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li>
<li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li>
<li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein%3A+One-+versus+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li>
<li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

シアノバクテリアの多くの株が培養コレクション32、33、34、35、36から入手可能であるが、これらの種は特定の特性に適応しているため、野生からの新しいシアノバクテリアの需要が依然としてある。P. lacunaは岩溜まりから採取され、塩濃度および温度30の変動に適合している。この種の株は、2008年、2009年、および2010年の遠足中に発見されました。ここに記載した手順により、P. lacunaの5株を単離し、これらの株のうち4株を滅菌した。P. lacuna HE10JO株は、rRNAおよびゲノムシーケンシングによって同定された海洋細菌である細菌Marivirga atlanticaで永久に汚...

シアノバクテリアは、光合成をエネルギー源として利用する原核生物である1,2。研究はますますシアノバクテリア種に焦点を当てています。いくつかのシアノバクテリアをDNA3で形質転換することができる。遺伝子は、これらの種においてノックアウトまたは過剰発現され得る。しかしながら、形質転換は、数種4、5、6、7、8、9、10、11に限定されており、培養コレクションまたは野生8からの系統において形質転換を確立することは困難であり得る。糸状種Phormidium lacuna(図1)の菌株は、塩濃度や温度などの環境条件が経時的に変動する海洋岩溜まりから単離された。これらの糸状シアノバクテリアは、それらが属する秩序振動子12のモデル生物として用いることができる。
エレクトロポレーションによる遺伝子導入を試験する試験中13、14は、P.ラクナが天然形質転換によって形質転換され得ることを見出した15。このプロセスでは、DNAはいくつかの細胞によって自然に取り込まれます。変換の他の方法16,17と比較して、自然な変換は、手順を複雑にする可能性のある追加のツールを必要としないという利点を有する。たとえば、エレクトロポレーションには、適切なキュベット、無傷のワイヤ、および適切な電圧の選択が必要です。P. lacunaは現在、自然変換の影響を受けやすい唯一のオシラトリアルメンバーです。元のプロトコルはエレクトロポレーションプロトコルに基づいているため、不要な洗浄ステップがいくつか含まれていました。プロトコルを簡素化するためにさまざまなアプローチがテストされ、ここで紹介する変換プロトコルが導かれました。
ゲノム配列は、遺伝子ノックアウトまたは過剰発現に基づくさらなる分子研究に不可欠である。ゲノム配列は次世代のシーケンシングマシンで短期間で取得できますが、DNAの抽出は難しく、種によっても異なります。 P. lacunaでは、いくつかのプロトコルがテストされました。その後、修飾セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTAB)ベースの方法が確立され、実験室での継続的な作業のために、各精製サイクルのDNAおよびDNA収率の許容可能な純度が得られました。5つの株のゲノムをこのプロトコールで配列決定することができた。次の論理変換ステップは、 P. lacunaにおけるタンパク質発現を確立することでした。
このプロトコールにおいてマーカータンパク質として使用されるsfGFPは、任意の蛍光顕微鏡で検出することができる。試験された全てのプロモーターは、P. lacuna sfGFP発現に使用できた。形質転換から生じる株数の増加は、培養物を保存する方法の必要性をもたらした。このような方法は、大腸菌および他の多くの細菌について確立されている18。標準的なプロトコールでは、グリセロール培養物を調製し、液体窒素中で移し、−80°Cで保存する。 この方法はほんの数ステップしか必要とせず、それが確立された種にとって高い信頼性があります。P. lacunaでは、生細胞をすべてのケースで回収できなかったため、標準プロトコルは実現不可能でした。しかしながら、融解後にグリセロールを除去した場合、全ての試験の細胞は生存した。P. lacunaの運動性の分析のために簡単な方法が提示され、これはIV型ピリまたは光受容体の役割を調査するためにノックアウト突然変異誘発と組み合わせることができる。これらのアッセイは、単細胞シアノバクテリア19、20、21のアッセイとは異なり、他の発振器にも有用であり得る。

<table><tbody><tr><td>オートクレーブ 3870 ELV</td><td>Tuttnauer</td><td>3870 ELV</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 寒天</td><td>OttoNorwald</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 淡水溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 中</td><td>メルク</td><td>73816-250ML</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>メルク</td><td>10043-35-3</td><td>H3BO3</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Carl Roth</td><td>10035-04-8</td><td>CaCl2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ Cellstar フィルタースクリューキャップ付き、滅菌済み、250 mL</td><td>Greiner</td><td>658190</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ Cellstar フィルタースクリューキャップ付き、滅菌済み、50 mL</td><td>Greiner</td><td>601975</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 LYNX 4000</td><td>Thermo Scientific</td><td>75006580</td><td>とローター</td></tr><tr><td>遠心分離機 microstar 17</td><td>VWR International</td><td>N/A</td><td>for up to 13,000 rpm</td></tr><tr><td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>57-09-0</td><td>C19H42BrN</td></tr><tr><td>クロロホルム : イソアミルアルコール 24 : 1</td><td>PanReac AppliChem</td><td> A1935</td><td></td></tr><tr><td>塩化コバルト(II) 六水和物</td><td>メルク</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl2 &middot;6 H2O</td></tr><tr><td>硫酸銅(II) 五水和物</td><td>メルク</td><td>7758-99-8</td><td>&nbsp;CuSO4 &middot;5 H2O</td></tr><tr><td>D(+)-ビオチン</td><td>カール・ロス</td><td>58-85-5</td><td>&nbsp;C10H16N2O3S</td></tr><tr><td>DNAラダー 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder 100 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>電気ピペッティングヘルプ accujet-pro S</td><td>Brand GmbH</td><td>26360</td><td>1-25 mL</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>C2H6O</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物</td><td>カール・ロス</td><td>6381-92-6</td><td>EDTA-Na2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡 ApoTome</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡 Axio Imager 2</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フレンチ圧力セルプレス</td><td>アメリカン・インスツルメンツ・カンパニー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ゲルドキュメーションシステム Saffe Image</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelelctrophoresis System Mupid-One/-exu</td><td>ADVANCED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス製品、異なる</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>グリ<td>セロール</td><td>カールロス</td><td>56-81-5</td><td>C3H8O3</td></tr><tr><td>Iron(III) chloride hexahydrate</td><td>Merck</td><td>10025-77-1</td><td>&nbsp;FeCl3 &middot;6 H2O</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>カール・ロス</td><td>25389-94-0</td><td>C18H36N4O11 &middot;H2SO4</sub</td></tr><tr><td>>ラウロイルサルコシン、ナトリウム塩(サルコシル)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137-16-6</td><td>C15H28NO3 &middot;Na</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Carl Roth</td><td>X964.4</td><td></td></tr><tr><td>光源、蛍光管 L18W/954 日光</td><td>OSRAM</td><td></td><td>シアノバクテリアの栽培</td></tr><tr><td>光源、LED パネル XL 6500K 140 W</td><td>ブルーム スター</td><td>N/A</td><td>シアノバクテリアの栽培、最大 1,000 &マイクロ;mol m-2 s-1</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>カール・ロス</td><td>7791-18-6</td><td>MgCl2 & middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>塩化マンガン(II) 四水和物</td><td>Serva</td><td>13446-34-9</td><td>MnCl2 &middot; 4 H2O</td></tr><tr><td>顕微鏡 DM750</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIDIプレッププラスミド抽出キット NucleoBond Xtra MIDIキット</td><td>Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG</td><td>REF740410.50</td><td></td></tr><tr><td>ミニコンピューター Raspberry Pi 4 +</td><td>Conrad Electronics</td><td>2138863-YD</td><td>タイムラプス録画用</td></tr><tr><td>眼球カメラ EC3</td><td>ライカ</td><td></td><td>最大30秒の連続記録用</td></tr><tr><td>眼球カメラ MikrOkular Full HD</td><td>Bresser</td><td></td><td>Raspberry Piミニコンピュータ</td></tr><tr><td>ペトリ皿ポリスチロール、100 mm x 20 mm</td><td>Merck</td><td>P5606-400EA</td><td></td></tr><tr><td>ペトリディッシュポリスチロール、60 mm x 15 mm</td><td>Merck</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>光度計 Nanodrop ND-1000</td><td>Peqlab Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光度計 Uvikon XS</td><td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットマン100-1,000&マイクロ;L</td><td>ギルソン</td><td>SKU: FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマン 10-100 & マイクロ;L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10004M</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックピペット 10 mL、滅菌済み</td><td>Greiner</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックチューブ、滅菌済み、15 mL</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックチューブ、滅菌済み、50 mL</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>臭化カリウム</td><td>Carl Roth</td><td>7758-02-3</td><td>KBr</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Carl Roth</td><td>7447-40-7</td><td>KCl</td></tr><tr><td>電源Statron 3252-1</td><td>Statron Ger&auml;tetechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電源 Voltcraft PPS 16005</td><td>Conrad Electronics</td><td></td><td>for LED</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>MC500C</td><td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td></tr><tr><td>Q5 polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td><td>イルミナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シェーカー ユニマックス 2010</td><td>ハイドルフ 栽培用器具</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>カール・ロス</td><td>127-09-3</td><td>NaCH3COO</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>カール・ロス</td><td>7647-14-5</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム 一水和物</td><td>カール・ロス</td><td>10049-21-5</td><td>NaH2PO4 &middot;H2O</td></tr><tr><td>フッ化</td>ナトリウム <td>カール・ロス</td><td>7681-49-4</td><td>NaF</td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td>カール・ロス</td><td>144-55-8</td><td>NaHCO3</td></tr>モ<tr><td>リブデン酸ナトリウム二水和物</td><td>セルバ</td><td>10102-40-6</td><td>Na2MoO4 & middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>硝酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>7631-99-4</td><td>NaNO3</td></tr><tr><td>Na Nadium sulphate</td><td>カール・ロス</td><td>7757-82-6</td><td>Na2SO4</td></tr><tr><td>塩化ストロンチウム六水和物</td><td>カール・ロス</td><td>10025-70-4</td><td>SrCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>チアミン塩酸塩</td><td>メルク</td><td>67-03-8</td><td>C<サブ>12</サブ>H<サブ>17</サブ>ClN<サブ>4</サブ>OSおよびミッドドット;HCl</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>カール・ロス</td><td>77-86-1</td><td>C4H11NO3</td></tr><tr><td>超音波装置 UP100H ソノトロード MS3</td><td>ヒールシャー超音波技術</td><td>UP100H</td><td></td></tr><tr><td>Ultraturrax サイレントクラッシャー M</td><td>ハイドルフ・インスツルメンツ</td><td></td><td>ホモジナイザー</td></tr><tr><td>尿素</td><td>カール・ロス</td><td>57-13-6</td><td>CH4N2O</td></tr><tr><td>ビタミンB12</td><td>Sigma</td><td>68-19-9</td><td>C63H88CoN14O14P</td></tr><tr><td>ビタミン液</td><td></td><td></td><td>0.3 &M thiamin-HCl, 2.1 nM ビオチン, 0.37 nM シアノコバラミン</td></tr><tr><td>蒸留器, 水処理</td><td>VEOLIA 水技術</td><td>ELGA_21001</td><td></td></tr><tr><td>硫酸亜鉛七水和物</td><td>Sigma</td><td>7446-20-0</td><td>ZnSO4 &middot; 7 H2O</td></tr><tr><td>software, URL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gatb-minia プログラム</td><td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td> は<td>、短いDNAリードから大きな足場を作成し、画像</td>処理(ピクセル強度、円径)用のLinuxベースの<td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>ソフトウェアRAST</td>アノテーションサーバー https://rast.nmpdr.org 入力:ゲノムDNA配列、オープンリーディングフレームの検出、タンパク質配列とその機能のリストCulture media</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人工海水</td><td>0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2, 9 mM&nbsp;KCl、2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr、0.49 mM H3BO3、90 & マイクロ;M SrCl<サブ>2</サブ>、72 & マイクロ;M NaF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f / 2 -液体培地</td><td>人工海水、0.1 % (v/v) 微量元素溶液、0.05 % (v/v) ビタミン溶液、0.88 mM NaNO3、36 &micro;M NaH2PO4&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+液体媒体</td><td>f/2-medium、NaNO3とNaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 & micro;M NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+-agar</td><td>3 % (w/v) bacto agar, 人工海水, 0.1 % (v/v) 微量元素溶液, 0.05 % (v/v) ビタミン溶液 , 8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2-寒天</td><td>3 % (w/v) バクト寒天、人工海水、0.1 % (v/v) 微量元素溶液、0.05 % (v/v) ビタミン溶液、0.88 mM NaNO3、36 &micro;M NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量元素溶液</td><td>0.36 mM NaH2PO4, 12 & micro;M Na2EDTA、39 nM CuSO4、26 nM Na2MoO4、77 nM ZnSO4、42 nM CoCl2、 0.91 以上M MnCl<サブ>2</サブ</td>ビタミン溶液0.3 &><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>M チアミン-HCl、2.1 nM ビオチン、0.37 nM シアノコバラミン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

糸状シアノバクテリウム・ホルミジウム・ラクナの自然形質転換、タンパク質発現、凍結保存

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

シアノバクテリアは、太陽エネルギーをバイオマス生産に利用する基礎研究およびバイオテクノロジープロジェクトの焦点です。ホルミジウムラクナは、新たに単離された糸状シアノバクテリウムである。この論文では、新しい糸状シアノバクテリアを海洋の岩盤プールから単離する方法について説明します。また、フィラメントからDNAを抽出する方法と、ゲノムを配列決定する方法についても説明します。形質転換は多くの単細胞種で確立されているが、糸状シアノバクテリアについてはあまり報告されていない。P. lacunaの自然な変換のための単純化された方法がここで説明されています。P. lacunaは、自然変換が確立されているオシラトリアルの秩序の唯一のメンバーです。この論文はまた、スーパーフォルダ緑色蛍光タンパク質(sfGFP)を発現するために自然形質転換がどのように使用されるかを示す。内因性cpcBプロモーターは、シネコシスティス・エスピーPCC6803由来のcpc560、A2813、またはpsbA2プロモーターよりも約5倍強い発現を誘導した。さらに、P. lacunaおよびSynechocystis sp.CPP 6803の凍結保存のための方法が確立され、液体培地中および寒天およびプラスチック表面上の運動性を評価するための方法が記載されている。

上記の方法に従って、 P. lacuna の5つの異なる株を岩溜まりから単離し、配列決定した(図 1および 表1)。全ての培養物は、 P. lacuna HE10JOを除く継代培養の〜1年後に無菌であった。この株はまだ海洋細菌である マリビルガ・アトランティカで汚染されています。その後のヘルゴランド遠足の間に、他の糸状シアノバクテリアが岩のプールから単離されたが、これは P. lacuna とは異なり、特徴付けられる必要がある。
いくつかのDNA抽出および精製方法をP. lacunaについて試験した。最良の結果は、上記のように最適化されたCTAB法で得られた。DNA収率は310 ± 50 μg/mL、OD 260 nm/OD 280 nmは1.7 ± 0.03、OD 260 nm/OD 230 nmは0.78 ± 0.04 (n = 17)であった。ゲノムシーケンシングは、予想通り、...

ホルミジウムラクナは、 海洋の岩溜まりから単離された糸状シアノバクテリウムである。この記事では、天然源からのフィラメントの単離、DNA抽出、ゲノムシーケンシング、自然形質転換、sfGFPの発現、凍結保存、および運動性法について説明します。

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

このプロトコルは、オシラトリアルに属する糸状シアノバクテリアが自然変換によってどのように変換され得るかを記述している。また、さまざまな種類の運動をどのように研究できるかも示しています。自然変換は、それが機能する場合、最も単純な変換手法です。DNA、細胞、および増殖培地のみが必要です。これまでのところ、他のオシレーター列メンバーは自然変換によって変換できませんでした。私たちの研究が、他のグループが他のオシレーターを試すように刺激することを願っています。形質転換のためには、健康的で見栄えの良い培養と良いDNA調製を行います。運動研究のために、常に超音波処理された培養物を使用してください。治療は新鮮でなければなりません。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるNora Weberです。まず、50ミリリットルの液体F2培地を、2つの250ミリリットルフラスコのそれぞれに、ランニング培養物からの1ミリリットルのP.lacunaフィラメントと共に接種することから始める。25°Cで約5日間、攪拌下で白色光で栽培する。5日後、100ミリリットルのP.lacuna細胞懸濁液を10,000RPMで3分間ホモジナイズし、750ナノメートルで光学密度を測定する。次いで、細胞懸濁液を6,000倍G.Moveで15分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを残りの液体の800マイクロリットルおよび追加のF2+培地に懸濁する。1ミリリットルあたり120マイクログラムのカナマイシンを含む8つのF2 + Bacto寒天プレートと10マイクログラムのDNAを各寒天プレートの中央にピペットで取ります。直ちにDNAの上に100マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットする。余分な液体が蒸発するのを許すために、クリーンベンチに蓋なしで寒天プレートを保管してください。プレートを閉じ、25°Cの白色光で2日間栽培します。2日後、各寒天プレートのフィラメントを、接種ループを用いて1ミリリットル当たり120マイクログラムのカナマイシンを含むいくつかの新鮮なF2+Bacto寒天プレートに分配する。プレートを摂氏25度の白色光で培養し、顕微鏡下で定期的に培養物を確認する。14〜28日後、死んだ茶色がかったフィラメントを特定し、顕微鏡下で形質転換フィラメントを検索します。変換されたフィラメントは健康で緑色に見え、フィラメントの大部分とは異なります。各単一の形質転換フィラメントを、1ミリリットル当たり250マイクログラムのカナマイシンを含む10ミリリットルのF2+培地を含む50ミリリットルのフラスコに移す。シェーカーで摂氏25度の白色光で栽培し、最大4週間成長を観察します。フィラメントを1ミリリットル当たり250マイクログラムのカナマイシンを含む寒天培地に戻し、フィラメントが成長するのを待つ。その後、カナマイシン濃度を再び上げて偏析をスピードアップする。GFP発現の場合、1本のフィラメントを蛍光顕微鏡で40倍または63倍の倍率で観察し、明視野透過像と蛍光像を撮影します。P.lacunaをF2培地中で白色光中で50RPM水平攪拌下で、750ナノメートルでの推定光学濃度が0.35になるまで約5日間培養する。サンプルを摂氏 4 度で保存します。最大電力で1分間超音波でフィラメントを均質化し、1回のサイクルでフィラメントを均質化します。750ナノメートルで光学密度を測定し、P.lacunaを含む培地の8ミリリットルを6センチメートルのペトリ皿に移す。サンプルが室温に達するまで数分間待ってから、ペトリ皿をセロハン箔で覆います。カメラ付きの標準顕微鏡のX-Yテーブルの上に顕微鏡スライドを置きます。顕微鏡のライトをオンにして、4倍または10倍の対物レンズを光の経路に移動します。次に、スライドの上にペトリ皿を置きます。単一フィラメントまたはフィラメントバンドルを、テーブルの X、Y、Z の動きで調整します。単一のフィラメントまたはバンドルの動きを観察し、標準的な顕微鏡カメラで動きを記録します。対物レンズが液体に触れていないことを確認します。6センチメートルのペトリ皿のバクト寒天表面上のP.lacunaを含む溶液のピペット0.5ミリリットル。液体がサーフェスに入るのを待ちます。約20分後、シャーレを閉じ、4Xまたは10Xの対物レンズを使用して表面上のフィラメントの動きを観察します。眼カメラとミニコンピュータシステムを使用してタイムラプス録画をキャプチャします。フィラメントは、最初に目で焦点を合わせ、次に眼カメラを通して焦点を合わせる必要があります。後続の画像間の時間間隔が 5 秒から 1 分であることを確認します。ミニコンピュータのLinuxスクリプトをプログラムして、タイムラプス記録を制御します。5ミリのLEDを取り付けたLEDホルダーを用意し、下から上へ20ミリ四方の領域を照射します。LEDの強度を測定および調整します。設定全体が暗い部屋または閉じた暗い容器にあることを確認します。P.lacunaを含む培地8ミリリットルを6センチのペトリ皿に入れ、蓋でペトリ皿を閉じ、LEDがペトリ皿の中央になるようにLEDホルダーの上に置きます。通常2日後、光処理の位置に直接向けたスマートフォンカメラでペトリ皿の画像を撮影します。ホルダーと白いシートを背景として使用して、すべての画像に同じ距離と光条件を確保します。ImageJソフトウェアを開き、[ファイル]、[開く]をクリックしてファイルを選択します。次に、Enter キーを押します。直線ボタンを選択し、マウスの左ボタンを押して、ペトリ皿の一端から反対側の端まで線を引きます。線がフィラメントの円の中心を通ることを確認します。[分析と測定]をクリックして、ペトリ皿の長さを確認します。次に、ImageJメニューの[プロファイルの分析とプロット]をクリックします。円の外側のピクセル強度の平均値と、円の内側のピクセル強度の別の平均値を推定します。これらの値の間の Y 位置にマウスをポイントして、円の両側の X 値を推定します。両方の値をメモし、差を計算します。次に、直線ボタンを選択し、ピクセル強度の最大値の中間値に線を描画します。最後に、[分析]、[測定]をクリックして、内側のセル円の長さを取得します。P.lacuna と PAK1 との変換後のインサートの統合と分離をここに示します。形質転換の約1週間後に外側プライマーを用いたPCR試験では、通常、電気泳動ゲル上に2つのバンドがあり、1つは野生型バンドのサイズで、もう1つは耐性カセットの挿入を示すより遅い移行バンドです。ここで、レーン1~4は耐性フィラメントの単離の7日後、11日後、14日後、17日後のフィラメントのPCR産物を表し、レーン5は野生型のPCR産物を表す。7日間のサンプルでは、インサートは染色体のごく一部に存在する。この画分は、野生型のバンドが見えない17日まで増加し、すなわち、分離は完了する。この画像は、内因性フィコシアニンβプロモーターの制御下でsfGHP発現のためのベクターpMH1を表す。p.lacuna相同配列、pUC19ベクター骨格、ならびにsfGFPおよびカナマイシン耐性を有するインサートがここに示されている。pMH1では、sfGHP遺伝子はフィコシアニンβ遺伝子の3つのプライムに配置されているため、内因性のcpcβプロモーターによって駆動される。P.lacuna野生型フィラメントの蛍光画像、およびPAK1、PAK2、PAK3、およびpMH1による形質転換後をここに示す。sfGFPの発現は、cpc 560プロモーター、a2813プロモーター、psbA2Sプロモーター、または内因性cpcβプロモーターによって駆動される。ここに提示されたマージされた画像は、ホルミジウムラクナの運動性を示しています。寒天表面上の動きをここに示します。時間間隔は1分であった。液体媒体中の移動がここに提示される。時間間隔は10秒であった。自然な変換は簡単な方法です。プラスミドDNAと耐性カセットを細胞と相同な配列で混合し、抗生物質を含む培地上で細胞を成長させるだけです。遺伝子は不活性化され、タンパク質は過剰発現され得る。これは、あらゆる基礎研究やバイオテクノロジー研究にとって重要です。自然形質転換も確立されている単細胞シアノバクテリアでは、光合成や光受容体などの分子研究が取り組まれました。

natural-transformation-protein-expression-cryoconservation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Weber、N. ら、 糸状シアノバクテリウム Phormidium lacunaの自然形質転換、タンパク質発現、および凍結保存。 J. Vis. 経験。...

集束光照明を用いた糸状シアノバクテリアの走光性アッセイ

出典: Weber、N.、 et al.、 糸状シアノバクテリウム Phormidium lacunaの自然な形質転換、タンパク質発現、および凍結保存。 J. Vis. 経験。...

糸状シアノバクテリウムPhormidium lacunaにおける自然形質転換とGFP発現

出典: Weber、N.、 et al.、 糸状シアノバクテリウム Phormidium lacunaの自然な形質転換、タンパク質発現、および凍結保存。 J. Vis. 経験。 (2022年)このビデオでは、フィラメント培養物を均質化して均一な懸濁液を作成し、顕微鏡スライド上でペトリプレートアッセイセットアップを準備し、フィラメントの動きを視覚化することにより、 Phormidium lacuna...

Phormidium lacunaフィラメントにおける滑走運動性

合成生物学は、非正規のアミノ酸の co-translational の挿入を使用して前例のないプロパティとタンパク質工学を可能です。ここでは、我々 は選択圧定款 (SPI) 経由のエシェリヒア属大腸菌の「ゴールド」蛍光タンパク質 (GdFP) と呼ばれる、蛍光分光特性を持つ型 GFP...

非正規のアミノ酸の選択圧による 'ゴールデン' 蛍光と質量分析法と蛍光タンパク質解析工学

このプロトコルでは、シアノ バクテリアの一時的な DNA の締固めを可視化する方法について説明します。同期の栽培、蛍光顕微鏡、急速凍結、高によって監視電圧低温電子断層撮影法を使用します。これらの方法のためのプロトコルを提案し、,...

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル...

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

ここでは、i)CyanoGateモジュラークローニングツールキットを用いて自己複製ベクターを組み立てる方法を記述するプロトコルを提示し、ii)結合によりシアノバクテリア宿主にベクターを導入し、iii)を用いてトランスジェニックシアノバクテリア株を特徴付ける。プレートリーダーまたはフローサイトメトリー。...

シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。...

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

我々は、XY平面における糸状シアノバクテリアの可視化のための簡単でアクセスしやすい方法を提示する。低融点のアガロースマトリックスを使用し、垂直方向で分裂に関与するタンパク質の画像を取得できるようにしました。したがって、この方法論は、任意の糸状生物および異なる種類のタンパク質に適用することができる。...

糸状シアノバクテリアのタイムラプス顕微鏡分析のための垂直固定化法

学ぶ糸状シアノバクテリウムPhormidium lacunaの自然形質転換法と運動性解析。Oscillatoriales目の遺伝子操作に初めて成功し、海洋環境由来のこの生物を用いた基礎研究とバイオテクノロジー応用への新たな道を開く。

糸状シアノバクテリウム・ホルミジウム・ラクナの自然形質転換、タンパク質発現、凍結保存

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