胚性ニワトリ聴覚脳幹をスライスしてトノトピック勾配とマイクロ回路を評価する

この方法は、同じスライス内の周波数領域のより大きな勾配を含むニワトリ聴覚脳幹のライブスライスを取得します。これらのスライスは、より大きなトノトピック軸を有する電気生理学的および解剖学的実験に適している。この方法論は、聴覚脳幹におけるマイクロ回路の発達を理解するのに役立ちます。

解剖学的構造は鶏に固有ですが、ウズラや鳴禽類などの他の鳥類も同様の解剖学的構造を持っています。まず、卵を70%エタノールで殺菌し、摂氏38度、湿度50%でインキュベートします。次に、ACSFのバブリング速度を、pHが7.2〜7.4、浸透圧が1リットルあたり300〜310ミリオスモルになるように設定します。

次に、5グラムのアガロースを100ミリリットルのdACSFに混ぜます。アガロースが泡立ち始めるまで、水浴または電子レンジを使用してアガロースを完全に溶解します。溶かしたアガロースを厚さ5ミリメートルまでのペトリ皿に注ぎ、室温で保って固めます。

固めたらシャーレを密封し、4°Cで保管します。アガロースを解剖時に使用するためにキュービクルブロックに切断します。まず、70%エタノールを使用して解剖領域を洗浄します。

支持または角度の付いたアガロースブロックをビブラトームトレイに接着します。卵を明るい光の下に置き、卵の大きい側または丸い側に空気で満たされた空間を見つけてから、空気で満たされた空間の上に殻を割って膜嚢を露出させます。くちばしを露出させるために嚢を穏やかに切開します。

メスで、首と頭を卵からそっと引き出します。断頭後、冷やしたdACSFで頭をきれいにします。冷やしたdACSFで頭をしっかりと保持し、吻側尾切開を行います。

目の後ろと目の間の切開を開始し、収穫した首の長さに従います。頭蓋骨を露出させるために皮膚を分離します。目の後ろの頭蓋骨を正中線から横方向に切ります。

両方の半球について繰り返します。刃を目の後ろに置き、すばやくカットして、頭蓋骨の吻側部分をスライスします。次に、冷やしたdACSFの皿に頭を浸します。

小さなはさみを使用して、頭蓋骨の尾部に正中線から横方向の切開を行い、組織に損傷を与えることなく脳を分離します。脳幹と小脳をやさしく露出させます。頭蓋骨全体の背側領域を引っ込めます。

脳幹を取り除き、細かいペイントブラシを使用してマイルドブラッシングして露出させます。湾曲した鉗子を使用して、組織と血管の接続から脳幹をきれいにします。花柄を切断し、血管を慎重に取り除くことにより、脳幹を小脳から分離します。

追加の血管の脳幹を整えます。まず、ビブラトームブレードを水平軸に沿って配置します。冠状スライスの場合は、吻側のスライストレイに脳幹を接着し、吻側を垂直に保ちます。

矢状スライスの場合は、外側の内側軸を垂直に保ちます。水平スライスの場合は、背側腹側軸を垂直に保ちながら腹側を接着します。鋭角矢状水平面を実現するには、腹側背側軸が斜辺表面アガロースブロック上で垂直になるように脳幹の腹側を接着します。

アガロースブロックの反対側の表面をスライストレイに面して接着し、吻側尾軸をブレードエッジと平行に保ちます。ビブラトームスライスの代わりに、分離した脳幹を摂氏40度の4%低融点アガロースに35 x 10ミリメートルのペトリ皿に浸します。アガロースが固まったら、鋭利なカミソリの刃を使ってキュービクルのアガロースブロックを切ります。

アガロースブロックを吻側に接着し、脳幹の吻側軸を垂直に保ちます。NM領域が見えるまでコロナスライスを取ります。鋭利な刃で接着剤からアガロースブロックを取り除きます。

細い針で、0.5マイクロリットルのトルイジンブルー染料をNMにそっと置き、核を見つけます。このブロックを矢状または水平スライス用のスライストレイに再度取り付けます。染色された領域に関して核を特定し、脳幹を切片化する。

切片化後、200〜300ミクロンの順次採取したスライスをACSFを含むスライスチャンバーに入れ、室温で1時間平衡化する。E19〜21ニワトリ胚由来の脳幹組織の冠状切片は、聴覚脳幹核の相対的な等周波領域を、最も低い周波数から最も高い特徴的な周波数の聴覚領域まで表している。求心性聴神経線維とNM軸索の分岐が見られた。

角核も観察された。吻側セクションでは、上オリバリー核は冠状スライスの腹側外側領域に沿って位置しています。矢状切片では、NMおよび核層筋またはNLが、聴神経線維がニューロンのクラスターに入った場所で同定された。

上オリバリー核は吻側領域で同定された。NMおよびNLから吻側尾軸に沿った低周波および高周波数聴覚領域が見られた。最も内側のスライスは、同側および対側の軸索房および聴覚領域の終点を示した。

水平スライスでは、NMとNLが正中線に向かって識別され、ニューロンは外側内側軸に沿って広がっていました。水平面から鋭角に脳幹組織のスライスは、大きな対角線の広がりを横切る聴覚脳幹核を示した。拡大画像は、吻内側から尾外側軸に沿った聴覚核のトノトピック軸を示した。

プロセス全体が、炭水化物酸素で連続的に泡立てられた氷冷dACSFで実行されることを確認してください。このプロトコルは、脳幹マイクロ回路の開発の解剖学的および生物物理学的特性、特に主要な聴覚核間の関係を調査する研究者に使用されます。