Name: シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶシアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価法。Synechocystis sp. PCC6803からの小胞精製、透過型電子顕微鏡、動的光散乱による解析技術を習得し、シアノバクテリア生物学の理解を深めます。

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著者らは、i3S科学プラットフォーム「バイオインターフェースとナノテクノロジー」と、国家インフラポルトガルバイオイメージングプラットフォーム(PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122)のメンバーである「組織学と電子顕微鏡」の支持を認めている。また、TEMの超薄切片染色プロトコルの最適化を支援してくれたJ. A. Gonzalez-Reyes教授(スペイン、コルドバ大学)と、ナノ粒子追跡分析に協力してくれたCecília Durães博士とAna Rita Pinto博士(ポルトガルのポルト大学)にも感謝します。
この研究は、米国国立科学財団(OCE-2049004からSJB)、COMPETE 2020 Operacional Program for Competitiveness and Internationalization(POCI)、ポルトガル、2020年、およびFundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência、Tecnologia e Ensino Superior in the project POCI-01-0145-FEDER-029540(PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO)を通じてポルトガルの資金によって資金提供されました。Fundação para a Ciência e a Tecnologiaは、PhDフェローシップSFRH/BD/130478/2017(SL)およびFCT研究者助成金IF/00256/2015(PO)でも高く評価されています。M.C.M.-M.Horizon 2020フレームワークプログラム(H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891)内のMarie Skłodowska-Curie個人フェローシップ(再統合パネル)の支援を受けました。

著者らは利益相反がないと宣言しています。

細胞外小胞(EV)は球状構造で、直径は約20〜400nmの範囲で、事実上すべての生物によって周囲の環境に放出されます1,2,3。小胞は脂質二重層によって区切られており、それ自体を複製することはできません。グラム陰性菌では、これらの構造は主に外膜からの小さな部分の「ブレビング」によって生じると考えられている。それでも、鞭毛運動、細胞溶解、および内膜および外膜材料の両方の分泌を含む他のプロセスも、小胞を産生することができる4,5。EVは、脂質、可溶性および膜タンパク質、核酸、および代謝産物を含む様々な生体分子を含むことができ、細胞間でこの物質を輸送することができる4、5、6。これらの特徴を考慮して、EVは、細胞通信、バイオフィルム形成、水平遺伝子導入、宿主ファージダイナミクス、および栄養交換を含む幅広い生物学的プロセスにおけるそれらの可能な役割を理解するために研究されている4,6。
シアノバクテリアは、単細胞および糸状生物を含むグラム陰性細菌の大規模で多様なグループである。彼らは、生理学と多様性7,8、それらが果たす重要な生態系機能9,10、バイオテクノロジー11,12の有用性を理解するなど、多くの観点から興味深いものです。シアノバクテリアは、海洋、淡水、陸生環境の自由生活生物として、またはコケ、シダ、植物、または地衣類や海綿類との共生関連のいずれかで、多種多様な生息地で発見されています13。彼らは水生生態系における重要な一次生産者として機能し、酸素光合成9,10を通して酸素と有機炭素を生産し、一部は大気中の窒素も固定することができます7。プロクロロコッカス、シネココッカス、シネコシスチスなどの海洋および淡水のシアノバクテリアは、実験室条件下でEVを生産し14,15,16、シアノバクテリア小胞も自然環境14,17で見つけることができます。シアノバクテリア小胞の生物学的および生態学的機能は不明であるが、この分野におけるさらなる研究は、シアノバクテリアの生理学、分化、コミュニケーション戦略、進化、および栄養相互作用に関する疑問に対する新しい洞察を提供する可能性が高い。さらに、多様なカテゴリーの生体分子を運ぶシアノバクテリアEVの能力は、商業的用途を有する可能性がある18,19。
本プロトコールは、シアノバクテリアの細胞外小胞生物学のより広範な研究を可能にし、奨励するために、シアノバクテリア培養物およびフィールドサンプルから小胞を単離および特徴付けるための方法を記載する。ここで説明するワークフローは、他の細菌からEVを単離および特徴付けるためのプロトコルに類似しているが、シアノバクテリア培養物および野外サンプルは、典型的には、宿主関連または病原性モデル系で一般的に観察されるよりも低い細胞および小胞濃度を含む20,21,22。したがって、シアノバクテリアEVの研究には、培養および小胞単離のための特別な考慮事項および最適化が必要であり、これは株および培地の背景によってさらに異なる。単一のプロトコルがすべての菌株、成長条件、および下流のアプリケーションで同等にうまく機能するわけではないため、研究者が実験上の問題に対処するのに最も適したアプローチを決定できるように、複数のオプションを提供し、関連するトレードオフについて議論します。

<table><tbody><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4</td><td>自家製緩衝液</td><td>---</td><td>小胞で使用できる標準洗浄/保存緩衝液。ラボで作るか、市販で購入可能</td></tr><tr><td>2% 酢酸ウラニル溶液</td><td>電子顕微鏡法 Sciences</td><td>22400-2</td><td>ネガティブ染色 - TEM</td></tr><tr><td>4x Laemmli サンプルバッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>リポ多糖類(LPS)染色に必要なタンパク質分解前の小胞サンプルの変性</td></tr><tr><td>アミコン超遠心フィルター (100 kDa)</td><td>Merck</td><td>UFC9100XX</td><td>遠心限外ろ過の代替オプション</td></tr><tr><td>BG11培地</td> <td><</td><td>em>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td></td></tr> <tr><td>カーボンサポートフィルム 200メッシュ、銅の栽培のための自家製培地---培地。CF200-Cu</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71150</td><td>透過型電子顕微鏡(TEM)グリッド</td></tr><tr><td>easiGlow グロー放電洗浄システム</td><td>テッドペラ</td><td>91000</td><td>商用TEMグリッドグロー放電器</td></tr><tr><td>EMbed 812エポキシ樹脂</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>14120</td><td>超薄切片 -</td></tr><tr><td>真空システム用TEMフィルターホルダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>300-4000</td><td>フィルター膜サポートプレート付き再利用可能なユニット</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド&nbsp;グレードI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10X1ml</td><td>超薄切片 - TEM</td></tr><tr><td>HEPES [N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N&prime;-(2-エタンスルホン酸)ナトリウム塩]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>シアノバクテリア増殖培地用緩衝剤</td></tr><tr><td>クエン酸鉛、三水和</td><td>物 電子顕微鏡科学</td><td>17800</td><td>電子顕微鏡で使用するための染色</td></tr>剤 <tr><td>マクロセップアドバンス遠心装置オメガメンブレン 100K</td><td>ポール</td><td>MAP100C36</td><td>少量サンプルの遠心限外ろ過用</td></tr><tr><td>ミリポア Pellicon 3 TFFモジュール</td><td>EMD ミリポア</td><td>XX42P0060またはXX42P0080</td><td>大量サンプルを濃縮するための代替TFFオプション</td></tr><tr><td>ミリQリファレンス 浄水システム</td><td>メルク</td><td>Z00QSV0WW</td><td>タイプIの超純水を得るための浄水システム</td></tr><tr><td>ナノサイト</td><td>Malvern Panalytical</td><td>LM14 または NS300</td><td>ナノ粒子追跡分析</td></tr><tr><td>Optima L80 XP 超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>L80 XP</td><td>超遠心分離機 (または類似モデル)</td></tr> <tr><td>OptiPrep / Iodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>密度勾配培地</td></tr><tr><td>四酸化オスミウム試薬 Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td>超薄切片 - TEM</td></tr><tr><td>Pall CentramatePE TFFホルダー</td><td>ポール・コーポレーション</td><td>FS002K10</td><td>TFFモジュール 10秒から100秒のサンプルを濃縮するのに適しています。推定容量に合わせて拡張するには、さらに30kDaまたは100 kDaのフィルターモジュールが必要です</td></tr><tr><td>ペリスタルティックポンプ Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>07559-07</td><td>大規模なTFFモジュールを駆動するためのポンプ</td></tr><tr><td>ピストングラジエントフラクショネーター</td><td>バイオコンプ機器</td><td>152-001</td><td>自動密度グラジエント分画</td></tr><tr><td>70 Tiローター用ポリカーボネートチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>355618</td><td>キャップアセンブリ付き再利用可能な超遠心分離機用ポリカーボネートアルミニウムチューブ</td></tr><tr><td>Pro99---培地</td><td></td><td></td> <td>Prochlorococcus</td></tr><tr><td>Pro-Q Emerald LPSゲル染色キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P20495</td><td>LPS染色</td></tr><tr><td>SN培地</td><td>自家製培地</td><td>---</td><td>Synechococcus</td></tr><tr><td>ナトリウムカコジル酸三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250-100G</td> TEM SW32Tiスイングバケットローター ベックマン・コールター 369650 超遠心分離機ローターの<td>小胞サンプル調製における緩衝剤</td></tr>などのシアノバクテリア海洋株の培養用培地 TEM <tr><td>SW32Ti スイングバケットローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369650</td><td>超遠心分離機ローター、6x ~40 mL チューブを保持し、バルク材料</td></tr><tr><td>SW60Ti スイングのペレット化に適していますバケツローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>335650</td><td>超遠心分離機ローター、6x ~4.5 mLチューブを保持; グラジエント精製および最終小胞洗浄に適しています</td></tr><tr><td>シリンジ 1mL ルアー</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td>小胞の分離およびナンパーティクルトラッキング分析(NTA)装置へのサンプルのロード用</td></tr><tr><td>シリンジフィルター 0.2 & マイクロ;m</td><td>Pall Corporation</td><td>4602</td><td>培養物からの小胞単離用</td></tr><tr><td>TAPS [N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-3-アミノプロパンスルホン酸]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>シアノバクテリア増殖培地用緩衝剤</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td></td><td>JEOL JEM-1400</td><td>または類似の顕微鏡</td></tr><tr><td>Type 70 Ti 固定角チタンローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>337922</td><td>超遠心分離機ローター、8x ~39 mLチューブを保持。バルク材料のペレット化に適しています</td></tr><tr><td>Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>LPS染色に必要なEVタンパク質のタンパク質分解用酵素</td></tr><tr><td>SW32Tiローター用UltraClearチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344058</td><td>シングルユース超遠心チューブ</td></tr><tr><td>SW60Tiローター用UltraClearチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>344062シングルユース超遠心チューブ</td></tr><tr><td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td><td>RMC 製品,&nbsp;Boeckeler Instruments</td><td>75501</td><td>極薄切片用ミクロトーム - TEM</td></tr><tr><td>Universal 320 R 遠心分離機</td><td>Hettich</td><td>Z654736</td><td>これまたは類似の汎用ベンチトップ/床置き遠心分離機は、細胞のペレット化に使用できます</td></tr><tr><td>真空装置</td><td>KNF Neuberger</td><td>N026.3 AT.18</td><td>または同様の真空ポンプとトラップ</td></tr><tr><td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td><td>ザルトリウス</td><td>VF20P4</td><td>TFFモジュール、2-3Lに適しています。より大きなボリュームのために異なるモジュールを接続できます(図1)。</td></tr><tr><td>Whatman Polycap TCカプセルフィルター(0.2 / 0.2&micro;m)</td><td>Cytiva</td><td>6717-9502</td> 大量の液体Zetasizerを<td>ろ過するためのカプセルフィルター</td></tr><tr><td></td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>動的光散乱(DLS)装置</td></tr></tbody></table>

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

シアノバクテリアは、光合成のグラム陰性細菌の多様なグループであり、地球生態系において重要な役割を果たし、不可欠なバイオテクノロジーモデルとして機能します。最近の研究は、海洋と淡水の両方のシアノバクテリアが細胞外小胞 - 微生物の外表面から放出された小さな膜結合構造 - を産生することを実証しました。小胞は多様な生物学的プロセスに寄与する可能性が高いが、シアノバクテリア生物学におけるそれらの特定の機能的役割はほとんど知られていない。この分野における研究を奨励し、前進させるために、シアノバクテリアの細胞外小胞を単離、濃縮、および精製するための詳細なプロトコルが提示される。現在の研究は、プロクロロコッカス 、シネココッカス、およびシネコシスチスの大規模培養物から小胞を単離することに成功した方法論について論じ ている。これらの株からの小胞サンプルを定量および特徴付けるための方法が提示される。水生場サンプルから小胞を単離するためのアプローチも記載されている。最後に、シアノバクテリア小胞の精製で直面する典型的な課題、さまざまな下流用途の方法論的考慮事項、およびアプローチ間のトレードオフについても議論します。

図1は、シアノバクテリア小胞単離プロセスの概要を示し、ここで説明するプロトコルの重要な側面を強調しています。特に注目すべきは、小粒子(vesicle)画分からのシアノバクテリアバイオマスの分離、小胞サンプルの濃縮、および小胞の単離および精製(図1、ステップ2〜4)を詳述するステップであり、これらは、小胞の再現性のある調製物を得るために重要である。図2は、シアノバクテリウム・シネコシスチス・エスピーPCC 6803からの細胞外小胞の単離および特徴付けからの代表的な結果を提示する。このシアノバクテリウムの外膜にはカロテノイド31が含まれていることが示されており、超遠心分離による直接ペレット化によって収集された小胞のサンプルに特徴的なオレンジ色の着色を与えます(図2A)。ベシクルペレットが再懸濁されると、ベシクルは透過型電子顕微鏡(TEM)、サンプルを酢酸ウラニルで陰性染色するか(図2B)、または超薄切片の観察(図2C)によって検査することができます。ベシクルのサイズ分布および濃度は、動的光散乱(DLS)(図2D)およびナノ粒子追跡分析(NTA)(図2E)を用いて評価することができる。記載されたプロトコールを用いて、典型的には、1.0のOD730でシネコシスティス・エスピーPCC6803の指数関数的に増殖する培養物において、mL当たり典型的には〜3.5±1.0 x 108個のナノ粒子が得られた。単離されたEVの生化学的分析は、単離された小胞の物理的特性評価を補完するために実施することができる。一例として、精製されたSynechocystis sp. PCC 6803小胞をSDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、リポ多糖類(LPS;図2F)。LPSは外膜32に特異的であるため、LPS検出は、膜結合小胞の存在を検証し、同じ株33からの調製物間の相対小胞含量を分析するためのマーカーとして役立つ。低分子量LPS対高分子量LPSの相対存在量の検査は、試料34、35間の小胞組成の変化を示すことができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> 図1:シアノバクテリアのEV単離および特性評価に使用した実験手順。 増殖培養物(1)および増殖培地からのシアノバクテリアバイオマスの分離(2)の概略図。小胞を含む無細胞サンプルを濃縮し(3)、EVを単離精製します(4)。用途に応じて、ベシクル調製物は、透過型電子顕微鏡(TEM)、ナノ粒子追跡分析(NTA)、動的光散乱(DLS)、およびリポ多糖(LPS)プロファイリングの1つまたは組み合わせを用いて特徴付けることができる(5)。RT, 室温. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> 図2:シアノバクテリウム・シネコシスチス・エスピーPCC 6803についての細胞外小胞単離および特性評価の代表的な結果。 (a)600 mL Synechocystis sp. PCC 6803培養物から濃縮無細胞細胞外培地を超遠心した後に得られた細胞外小胞ペレット(EVsペレット)をOD730に増殖させた1.0-1.5の写真。外膜に見られるカロテノイドに由来する小胞ペレットの典型的なオレンジ色の着色に留意されたい。(B,C)Synechocystis sp. PCC 6803小胞サンプルの負染色された(B)および超薄切片(C)の透過型電子顕微鏡(TEM)写真。スケールバー:それぞれ200nmおよび50nm。試料を80kVで操作した透過型電子顕微鏡で可視化した。(d)ベシクル直径(nm単位)の関数としてのベシクル体積の分布を描写する典型的な動的光散乱(DLS)プロット。色付きの線は、同じサンプルの3つのテクニカルレプリケート測定からのデータを示します。(e)シネコシスチス細胞外小胞のサイズ分布(nm単位)の代表的なナノ粒子追跡分析(NTA)データ。黒い線は3つの技術反復の平均を示し、赤い線は平均の標準誤差を表します。(f)リポ多糖(LPS)プロファイルは、16%(w/v)SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって小胞調製物を分離し、市販のLPS染色キットで染色した後に検出された。粗いLPS形態および平滑LPS形態に対応する低分子および高分子LPSは、それぞれ検出可能である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:rを計算する方程式。指数関数的増殖中の2点間(典型的には時間経過の始まりと終わり)の間の世代当たりの細胞当たりに産生される小胞の数は、この式を用いて決定される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコールは、シアノバクテリア培養物からの細胞外小胞の単離、濃縮、および特性評価に関する詳細な説明を提供する。異なるスケールの培養物から小胞を精製するためのアプローチ、方法論間のトレードオフ、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項についても議論する。

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

このプロトコルは、異なるスケールで培養物から小胞を精製するためのアプローチ、トレードオフ、方法論の違い、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項を示すだけでなく、重要である。シアノバクテリアは、ユニークな小胞サンプリングと分析の課題を提示します。これらの技術は、培養物および環境サンプルから小胞を単離および濃縮することに成功している。500ミリリットル未満のサンプルを濃縮するには、15〜20ミリリットルの限外ろ過遠心濃縮器をタイプ1超純水ですすぐことから始めます。濃縮器を遠心分離機に装填し、摂氏4度で4,400 x gで回転させます。実行を破棄し、この手順を少なくとも 2 回繰り返します。上澄みサンプルを水すすぎ濃縮器にロードし、同じ条件でスピンする。サンプルが15〜30ミリリットルの最終容量まで濃縮されるまで、この手順を繰り返します。500ミリリットル以上の体積を濃縮するには、原稿に記載した装置を設置して接線流ろ過を行う。ペリスタルティックポンプを吸気ラインに取り付け、保持ラインに調整可能なクランプを置きます。原稿に記載されているように接線流ろ過を消毒し、1リットルのタイプ1超純水で装置を洗い流します。0.2ミクロン未満の濾液をサンプルリザーバに加える。保持液ラインのポンプ速度と背圧レベルをゆっくりと上げて、濾液ラインからの出力を増やします。引き続き接線流ろ過を実行し、材料が除去されたら培養上清をリザーバに補充します。リザーバ内の体積が気泡を導入せずに吸気ラインへの流れを維持するために必要な最小量に達したら、サンプルの濃縮を停止します。流出ラインをクランプで閉じます。保持液ラインの背圧を取り除きます。濃縮された上清をフィルターを通して10分間再循環させ、再循環速度を毎分20ミリリットルから40ミリリットルに減少させて回収率を最大化します。保持液ラインを清潔な容器に移動し、サンプルから吸気ラインを取り外し、濃縮材料を回収する。ピペットを使用してサンプルリザーバに残っている材料を回収します。濃縮された上清を0.2ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。必要に応じて、最終濃縮物を摂氏4度で約3週間保存してから、小胞精製に移行します。濃縮培養サンプルをペレット化するには、それをきれいな超遠心チューブに入れ、クリーンな培地またはバッファーを追加してチューブが満たされていることを確認します。遠心分離後、上清をピペットで取り除く。ペレット状の材料を新鮮な培養培地または1Xリン酸緩衝生理食塩水などの洗浄緩衝液で再洗浄し、遠心分離を繰り返す。1ミリリットルのピペットで穏やかにピペッティングすることによって、最終ペレットを新鮮な培養物に再懸濁し、それをきれいな容器に移す。密度勾配超遠心分離を行うには、原稿に記載されているようにヨウジキサノールストックを調製する。4X緩衝液の1部を60%ヨージキサノールストックの3部と混合して、45%ヨウジキサノール溶液を作る。45%イオジキサノールを1Xバッファーで希釈して、40、35、30、25、20、15および10%の最終イオジキサノール濃度のグラジエント培地のストックを作成します。次いで、これら全てのイオジキサノール勾配ストックの等量を超遠心管に注意深く重ね合わせ、管全体の容積を利用する。遠心分離後、慎重にピペッティングするか、フラクションコレクターを使用して、それぞれ0.5ミリリットルの画分を約4.5ミリリットルの勾配で収集します。各フラクションの密度を、ミリリットルあたりのグラム数で、分析天秤および較正ピペットを使用して決定する。チューブからサンプルを取り出し、重量を決定し、サンプルをチューブに戻します。個々の画分を新しいチューブ内のクリーンなバッファーで希釈し、その後、クリーンな培地またはバッファー洗浄を行います。5マイクロリットルの小胞を慎重に塗布し、5分間放置する。グリッドの端をきれいなろ紙に触れてサンプルを取り出します。20~50マイクロリットルの酢酸ウラニルをプラスチックフィルムで覆われた平らな面にピペットで取り出します。次に、その上に浮かぶグリッドを2分間置きます。ろ紙を使って酢酸ウラニルを取り除き、超純水一滴に短時間浮かべて洗浄します。清潔なシリンジを使用してチャンバーを超純水で満たし、気泡がないことを確認します。スタートカメラをクリックし、拇印の周りのチャンバーの最適な領域を視覚化します。画面ゲインとカメラレベルのスライダを最大に向かってスライドさせ、次に最も低いレベルまで下げて、最も暗いパーティクルを表示します。必要に応じてフォーカスを調整して、粒子が視野全体でほぼ均等に見えるようにし、チャンバーがきれいになるまで超きれいな水で洗浄を続けます。1ミリリットルのシリンジを用いて小胞サンプルをチャンバーに加え、取得設定を確認する。[SOP]ドロップダウンボックスから[標準測定]を選択し、設定を変更して、それぞれ60秒のビデオの少なくとも3つの技術複製を収集します。「作成」を押してスクリプトを実行し、プロンプトに従って、複製の間に約 100 マイクロリットルのサンプルをチャンバーに押し込みます。「分析」をクリックして粒子パラメータを決定し、実験を開き、サンプルファイルをロードします。選択したファイルを処理」を選択し、分析が完了するのを待ちます。シアノバクテリウム・シネコシスチス属PCC6803からの細胞外小胞の単離および特性評価は、外膜がカロチノイドを含み、超遠心による直接ペレット化によって収集された小胞サンプルに特徴的なオレンジ色の着色を与えることを示した。再懸濁された小胞ペレットを、サンプルを酢酸ウラニルで陰性染色するか、または超薄切片を観察することによって、透過型電子顕微鏡によって検査した。ベシクルのサイズ分布および濃度は、動的光散乱およびナノ粒子追跡分析を用いて評価した。精製されたSynechocystis sp. PCC6803小胞をドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル上で分離し、リポ多糖について染色した。サンプルは、接線流ろ過が機能し、ベシクルが濃縮されていることを確認するために、濃縮ベシクルサンプルの前後に採取する必要があります。次に、ナノ粒子追跡分析を使用して両方のサンプルを測定する必要があります。この方法をサイズ排除クロマトグラフィーや不斉フィールドフロー分画などの他のアプローチと融合させ、培養サンプルや環境サンプルからの小粒子の識別と単離を改善するための将来の努力が必要です。この技術は、シアノバクテリアの小胞と、シアノバクテリアの生物学におけるこれらの小胞の特定の機能的役割を研究するのに役立ちます。

isolation-characterization-cyanobacterial-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Biller, SJ, et al.シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性化J. Vis.

透過型電子顕微鏡を用いたシアノバクテリア細胞外小胞の可視化

出典: ワトソン、DC、 et.al。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオは、遺伝子組み換え細菌の外膜に由来する細胞外小胞(EV)の単離と濃縮を示しています。このプロセスには、細菌を培養して EV...

細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

出典: ワトソン、DC 他。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。...

サイズ排除クロマトグラフィーを用いた細菌の細胞外小胞の単離 

このビデオでは、結核菌(Mtb)の培養濾液から細菌の細胞外小胞(EV)を精製するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)技術を示しています。この手法では、多孔質樹脂充填カラムを使用して、EVの精製画分を取得します。多孔質粒子は、より小さなタンパク質が細孔に侵入するのを選択的に許可し、溶出を遅らせます。同時に、EVはサイズが大きいため、毛穴に入るのが排除され、最初に溶出されます。...

マイコバクテリア細胞外小胞を精製するためのサイズ排除クロマトグラフィー技術

ここで、シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーの単離およびエキソプロテオームの単離に関するプロトコルが記載されている。両方の手順は、さらなる分析または用途に使用できる高純度のポリマーまたはタンパク質を得るための重要なステップを具体化します。それらはまた特定のユーザーの必要性に従って容易に合わせることができる。...

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。...

細胞外小胞由来免疫細胞由来の特徴と細胞環境への機能的影響の研究

細菌性小胞は病因において重要な役割を果たし、有望なバイオテクノロジーの応用を有する。小胞の不均一性は分析と使用を複雑にします。したがって、小胞の様々なサイズを分離する簡単で再現可能な方法が必要です。ここでは、...

細菌外膜小胞ヘテロジネミティーを分析するサイズ排除クロマトグラフィー

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。...

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

現在のプロトコルは、不連続なスクロース密度勾配を介して遠心分離によってシアノバクテリアからのフィコビリソームの分離を詳述する。77K蛍光発光スペクトルとSDS-PAGE分析により、インタクトなフィコビリソームの画分が確認されます。得られたフィコビリソーム画分は、TEMの陰性染色および質量分析分析に適しています。...

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

最新世代のEV特性評価ツールは、複数のパラメータにわたる単一のEV解析を同時に行うことができます。ナノフローサイトメトリーは、標識なしで45...

ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

ここでは、ヒト被験者の涙や唾液などの生体液から採取された細胞外小胞(EV)の特性評価法を示します。この方法で使用されるスキャナーは、サンプルの1μLからEVの表現型、サイズ、および総粒子数を検出することができます。...

体液からの細胞外小胞の特性評価

学ぶシアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価法。Synechocystis sp. PCC6803からの小胞精製、透過型電子顕微鏡、動的光散乱による解析技術を習得し、シアノバクテリア生物学の理解を深めます。

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

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