連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞細胞内細胞小器官間接触部位の3次元特性評価

このプロトコルは、オルガネラの3D再構成をシンプルで堅牢な方法で可能にすると同時に、現在専門の体積電子顕微鏡を持たない研究室でもアクセスできます。この技術は非常に柔軟で、優れたX / Y解像度を提供しながら、必要に応じてサンプルを再画像化することができます。また、非常に高いZ分解能が必要な場合の傾斜断層撮影とも互換性があります。

この技術は、オルガネラ間の文脈におけるオルガネラ形態の尋問を可能にする。したがって、オルガネラ欠損を有する任意の病理学的状態を調べるために拡張することができる。このアプローチは、オルガネラ相互作用および細胞密売事象に関する洞察を提供することができる。

この方法は、肝細胞に加えて、他の組織、オルガノイドモデル、および細胞培養系にも適用することができる。初めてのユーザーは、シリアルセクショニングを見つけて、損失なく挑戦的になるかもしれません。このプロトコルを貴重なサンプルに適用する前に、通常の超薄切片化に堪能であることをお勧めします。

まず、サンプルをトリミングアダプターにロックした状態で、カミソリの刃を使用して樹脂埋め込み組織を慎重にトリミングします。試料箱舟をチャックと試料とともにミクロトームの試料アームに移し、箱舟の移動範囲が上から下まで流れるように標本箱舟を配置します。ダイヤモンドナイフをナイフホルダーに入れてロックし、ナイフの切断角度が適切に設定されていることを確認します。

ナイフホルダーをステージにしっかりとロックします。ステージのダウンライトをオフにし、ステージのアップライトをオンにし、慎重にナイフを試料の方へ動かし、ブロック面がナイフの端に揃うまで関連するノブを調整して、ナイフの横方向の角度、試料の傾き、および試料の回転を継続的に調整します。試料アームの切断窓の上下をセットし、試料をナイフエッジのすぐ下に置きます。

ナイフボートを清潔な二重蒸留水で満たし、水面がナイフの刃先と水平でわずかに凹んでいることを確認します。次に、セクションの切断を開始します。サンプルがナイフの刃先を通過した直後に切断を停止します。

空のスロット グリッドを使用して、各グリッドで収集するセクションの数を見積もります。両手にまつげを使用して、スロットグリッドの長さに収まる小さなリボンにリボンをそっと割ります。サンプル内の相対的な位置を心に留めておきます。

ガラスのアプリケーターロッドを使用して、クロロホルムを1滴ずつセクションの上に置き、平らにします。最初の番号の付いた鉗子で最初の空のスロットグリッドを拾い上げ、Triton X-100に静かに浸してから蒸留水に2回浸します。ろ紙を使用して、鉗子の端から余分な水を取り除きます。

鉗子を使用して、formvarコーティングされたスロットグリッドの約2/3をナイフボートの水に静かに下げます。formvar 側が下を向いており、スロットの長い右手の端が水面にあり、水辺と平行であることを確認します。水中のグリッドをリボンに向かって静かに漂わせて、戻りストローク時にセクションがグリッドに向かってドリフトするようにします。

リボンの右端がスロットの右端に揃うまで、これをますます小さな漂い方で続けます。次に、最後の漂流で、グリッドを静かに上に上げて、セクションをスロットグリッドに上げます。水酸化ナトリウムのペレットをペトリ皿の蓋の下に置き、二酸化炭素を含まない環境を提供します。

次いで、パラフィルム上にレイノルド鉛クエン酸塩の40マイクロリットル滴を慎重にピペットし、グリッドごとに1滴ずつピペットする。各グリッドをクエン酸鉛滴の上に反転させ、ペトリ皿の蓋で7〜10分間保護したままにします。グリッドが染色されている間、パラフィルム上の各グリッドに対して約300マイクロリットルの蒸留水を5滴置きます。

クエン酸鉛インキュベーションの最後に、各グリッドを蒸留水の液滴に移し、グリッド上で直接呼吸することなく1分間洗浄する。これをさらに4回繰り返します。番号付きのクロスオーバー鉗子を使用して、最初のグリッドを拾います。

グリッドの端に触れてろ紙を塗って水の大部分を吸い取り、鉗子で少なくとも20分間乾燥させます。グリッドごとにこれを繰り返します。低倍率で、シリアルセクションの順序、位置、および位置を観察します。

グリッド上の系列の中央のセクションに移動します。サンプルを参照し、関心領域を特定します。その後、所望の倍率で試料を観察する。

断面が完全に整列していないことが多く、後で画像を切り取る必要がある可能性があるため、シリーズをわずかに低い倍率で収集することを検討してください。次に、より低い倍率で参照画像を撮影します。これは、関心領域のコンテキスト、セクション境界に関連する異なる倍率での大まかな位置、およびサンプル内のランドマークフィーチャを理解するのに役立ちます。

これらを使用して、他のセクションの関心領域を標識します。画面を参照するには、再利用可能な粘着パテ、ステッカー、またはオーバーヘッドプロジェクター用紙を画面にテープで貼り付けて、画面上に一時的なマーカーを配置します。これにより、データセット全体で画像の中心にある関心領域の同じ特徴を日常的に再想像することができます。

画像スタックを開き、ボクセル測定値を指定し、[セグメンテーション]タブを選択してセグメンテーションを開始します。セグメンテーションエディタパネルで新規をクリックして、マテリアルリストに新しいオブジェクトを定義します。右クリックしてオブジェクトの色を変更し、ダブルクリックしてオブジェクトの名前を変更します。

手動セグメンテーションの場合は、マテリアルリストの下にあるセグメンテーションツールを選択し、デフォルトのブラシツールを選択してピクセルをハイライトします。対向する2つの肝細胞の電子顕微鏡像をここに示す。より高い倍率イメージングは、ナノメートルの分解能で異なる細胞小器官の形態学的詳細の観察を可能にする。

代表的な画像は、同じ断層像のセグメント化されたバージョン、小胞体の痕跡、ミトコンドリア、および異なる空間のERとミトコンドリアとの間の膜間接触をここに示している。代表的な画像は、セグメンテーショントレースとミトコンドリア全体内のその相対位置とを重ね合わせた傾斜したオルソスライスを示しています。セグメント化された細胞小器官と小胞体 - ミトコンドリアが異なる角度で接触する3D再構成がここに示されている。

このプロトコルは、非常に高いZ分解能が必要な場合にチルト断層撮影と互換性があるため、小さな構造や複雑な構造を解くのに役立ちます。この技術は、異なる細胞小器官間の空間的関係の初期評価に最適であり、したがって、膜恒常性における膜接触の進行分野において特に有用である。