Name: 連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞細胞内細胞小器官間接触部位の3次元特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶ連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞の細胞小器官間膜接触部位の3次元再構成法。このロバストなプロトコルは専門機器を持たない研究室でも利用可能で、細胞小器官形態と相互作用を詳細に解析できます。

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ジョアンナ・ハンリー、レベッカ・フィアデイロ、アニア・ストラアートマン=イワノフスカに専門家の技術支援に感謝します。また、有益な議論をしてくれたStefan LabのメンバーとIan J. Whiteにも感謝します。J.J..B.は、UCLのMRC分子細胞生物学研究所へのMRCの資金提供によって支援されており、賞のコードMC_U12266Bです。C.J.S.は、UCLの分子細胞生物学大学ユニットのMRC研究所(賞コードMC_UU_00012/6)へのMRC資金によって支えられています。PGは、欧州研究評議会、助成金コードERC-2013-StG-337057によって資金提供されています。

著者らは、開示する利益相反はありません。

オルガネラの構造と相互作用を3Dで視覚化するためのアクセス可能なvEM技術が、このプロトコルで説明されています。肝細胞における細胞小器官間接触の形態は、ここではケーススタディとして提示される。しかし、このアプローチは、末梢神経45におけるシュワン細胞-内皮相互作用、内皮細胞46におけるワイベル・パラデ・ボディ生合成、腎臓細胞47における貨物分泌、海馬ニューロン48におけるシナプス形態など、他の様々なサンプルおよび研究分野の調査にも適用されている。.肝臓生物学をよりよく理解するために、このアプローチは、2D細胞培養、3D肝臓オルガノイドモデルシステム49、および肝臓組織における肝細胞形態を調査するために使用することができる。この堅牢で柔軟なアプローチは、従来の120kV透過型電子顕微鏡およびウルトラミクロトームにアクセスできる多くのラボで使用でき、高価なサンプル調製技術を必要としません。
<p ...

1930年代の発明以来、電子顕微鏡は研究者が細胞や組織の構造成分を視覚化することを可能にしました1,2。3Dモデルの構築には、骨の折れるシリアルセクションコレクション、手動写真、ネガ処理、手動トレース、およびガラス、プラスチック、または発泡スチロール3,4のシートからの3Dモデルの作成と組み立てが必要であるため、ほとんどの調査は2D情報を提供しました。約70年後、顕微鏡性能、シリアルセクションコレクション、自動デジタルイメージング、3D再構成、視覚化、および分析のための洗練されたソフトウェアとハードウェアから、現在総称してボリュームEM(vEM)と呼ばれるものの代替アプローチまで、プロセスの多くの側面でかなりの進歩がありました。これらのvEM技術は、一般に、ミクロンスケールにわたってナノメートルの分解能で3D超微細構造情報を提供すると考えられており、透過型電子顕微鏡(TEM)および新しい走査型電子顕微鏡(SEM)技術を包含する。レビュー5,6,7,8を参照してください。
例えば、集束イオンビームSEM(FIB-SEM)は、SEM内の集束イオンビームを使用して、ブロックの表面の連続SEMイメージングスキャンの間にブロックの表面を粉砕し、サンプルの自動フライス加工/イメージングを繰り返し、再構成のための3Dデータセットを構築することを可能にする9,10。対照的に、シリアルブロックフェースSEM(SBF−SEM)は、SEM内のウルトラミクロトームを使用して、イメージング11,12の前にブロックフェースから材料を除去する一方、アレイ断層撮影は、SEM内のシーケンシャルセクションの関心領域をイメージングして3Dデータセットを生成する自動ワークフローを設定する前に、カバースリップ、ウェーハ、またはテープ上にシリアルセクションの収集を必要とする非破壊プロセスである。.アレイ断層撮影と同様に、シリアルセクションTEM(ssTEM)では、イメージングの前に物理セクションを収集する必要があります。しかし、これらの切片はTEMグリッド上で収集され、TEM14、15、16で画像化される。ssTEMは、傾斜断層撮影17、18、19を行うことにより延長することができる。直列傾斜断層撮影法は、x、y、およびzにおいて最良の解像度を提供し、細胞20全体を再構成するために使用されてきたが、それは合理的に困難である。このプロトコルは、現在特殊なセクショニングやvEM計測器にアクセスできないが、3D vEMデータを生成することで恩恵を受ける多くのEMラボが利用できる最もアクセスしやすいvEM技術として、ssTEMの実用的な側面に焦点を当てています。
3D再構成のための連続超微小切除術は、以前は困難と考えられてきました。断面の厚さであってもまっすぐなリボンを切断し、正しいサイズのリボンを正しい順序で、十分なサポートを備えたグリッド上に配置して拾うことは困難であったが、グリッドバーが関心領域を覆い隠さず、そして最も重要なのは、不完全なシリーズが完全な3D再構成を妨げる可能性があるため、セクションを失うことなく21。しかしながら、市販のウルトラミクロトーム、ダイヤモンド切断およびトリミングナイフ22,23、グリッド21,24上の電子透過性支持フィルム、および断面接着およびリボン保存13,21を支援するための接着剤に対する改善は、多くの研究室においてこの技術をより日常的にした長年にわたる漸進的な進歩のほんの一部にすぎない。シリアル切片が収集されると、TEMでのシリアルイメージングは簡単で、xとyのサブナノメートルpxサイズのEM画像を提供できるため、細胞内構造の高解像度の問い合わせが可能になります。ここで紹介するケーススタディは、肝肝細胞における小胞体(ER)-オルガネラ接触の研究におけるssTEMおよび3D再構成の使用を実証しており、ER-オルガネラ接触が最初に観察された25,26。
核エンベロープと隣接している一方で、ERはまた、リソソーム、ミトコンドリア、脂肪滴、および原形質膜27を含む多数の他の細胞小器官と密接に接触する。ER−オルガネラ接触は、脂質代謝28、ホスホイノシチドおよびカルシウムシグナル伝達29、オートファジー調節、およびストレス応答30、31に関与している。ER-オルガネラ接触および他の細胞小器官間接触は、細胞代謝ニーズおよび細胞外合図に応答する非常に動的な構造である。それらは、そのサイズおよび形状ならびにオルガネラ膜32、33間の距離において形態学的に変化することが示されている。これらの超構造の違いは、それらの異なるタンパク質/脂質組成および機能を反映している可能性が高いと考えられている34,35。しかし、オルガネラ間接触を定義し、それらを分析することは依然として困難な作業である36。したがって、さらなる調査のためには、細胞小器官間接触を調べて特徴付けるための信頼性が高くて簡単なプロトコルが必要です。
ER-オルガネラ接触は膜間分離で10~30nmの範囲であるため、同定のゴールドスタンダードは歴史的にTEMでした。薄切片TEMは、別個の膜接触における常在ERタンパク質に対する特異的サブドメイン局在を明らかにした37。伝統的に、これはnm分解能を有するER-オルガネラ接触を明らかにしてきたが、しばしばこれらの相互作用の2Dビューのみを提示した。しかし、vEMアプローチは、これらの接触部位の超構造的提示および文脈を3Dで明らかにし、接触の完全な再構成および接触のより正確な分類(点対管状対槽状)および定量化を可能にする38、39。ER-オルガネラ接触が観察された最初の細胞型であることに加えて25,26、肝細胞は、そのアーキテクチャおよび生理学において重要な役割を果たす他のオルガネラ間接触の広範なシステムを有する28,40。しかし、肝細胞におけるER-オルガネラおよび他のオルガネラ間接触の徹底的な形態学的特徴付けは依然として欠けている。したがって、再生および修復中に細胞小器官間接触がどのように形成および再構築されるかは、肝細胞生物学および肝機能に特に関連している。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上mのシリンジ フィルター</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム トレイ</td><td>寒天 科学</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー</td><td>C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/ドデセニル コハク酸 無水物</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>エポン 成分</td></tr><tr><td>ダイヤモンド ナイフ</td><td>DiaTOME</td><td>ウルトラ45°C;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30/2,4,6-tri (ジメチルアミノメチル) フェノール</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>エポン成分</td></tr><tr><td>デュモン ピンセット N5</td><td>寒天 科学</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>フィジー</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>フィジー TrakEM2 プラグイン</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>ホルムアルデヒド 36% 溶液</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvarコーティングされたスロットグリッド</td><td>自家製</td><td></td><td>の代替品: EMS diasum (FF2010-Cu)</td></tr> <tr><td>アプリケーターロッド付きガラス瓶</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>グルトアルデヒド 25% 溶液</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/メチルナディック無水物</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>エポン成分</td></tr><tr><td>四酸化オスミウム 2%溶液</td><td>TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr><tr><td>フェリシアン化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>プロピレンオキシド</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0050/PB08</td><td></td></tr><tr><td>再利用可能な接着剤</td><td>ブルータック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レイノルズ クエン酸鉛</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>セクション染色</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0250</td><td>0.1 M Caco緩衝液</td></tr><tr><td>スーパーグルーRS</td><td>コンポーネント</td><td>918-6872</td>シア<td>ノアクリレート接着剤、ステップ1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812樹脂TAAB</td><td></td><td>T023</td>エ<td>ポン成分</td></tr>タン<tr><td>ニン酸</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr>トリ<tr><td>トンX-100</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>2部エポキシ樹脂</td><td>RSコンポーネント</td><td>132-605</td>代替<td>案:ステップ2.13</td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>振動ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td></td><td>100 & マイクロ;m厚スライス、0.16 mm / s、1mmの振幅で切断。</td></tr><tr><td>ウェルドウッドオリジナルコンタクトセメント</td><td>DAP</td><td>107</td><td>コンタクト接着剤:ステップ3.1.4</td></tr></tbody></table>

連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞細胞内細胞小器官間接触部位の3次元特性評価

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡は、細胞の超構造を可視化するためのゴールドスタンダードであると長い間考えられてきました。しかし、分析はしばしば2次元に限定され、細胞小器官間の3次元(3D)超構造および機能的関係を完全に記述する能力を妨げる。体積電子顕微鏡(vEM)は、メソスケール、マイクロスケール、およびナノスケールの解像度で3Dで細胞超微細構造の尋問を可能にする技術のコレクションを記述する。 
このプロトコルは、シリアルセクション伝送EM(TEM)を使用してvEMデータを取得するためのアクセス可能で堅牢な方法を提供し、サンプル処理からデジタル3D再構成までの技術的側面を単一の簡単なワークフローでカバーします。この技術の有用性を実証するために、肝肝細胞における小胞体とミトコンドリアおよびそれらの接触部位との間の3D超構造関係が提示される。細胞小器官間接触は、オルガネラ間のイオン、脂質、栄養素、およびその他の小分子の移動において重要な役割を果たします。しかし、肝細胞での最初の発見にもかかわらず、それらの物理的特徴、ダイナミクス、および機能についてはまだ学ぶべきことがたくさんあります。 
細胞小器官間接触は、2つの細胞小器官の互いに近接する(典型的には〜10〜30nm)および接触部位の程度(点状接触からより大きな3D槽様接触まで)において変化する形態の範囲を示すことができる。密接な接触の検査には高解像度イメージングが必要であり、シリアルセクションTEMは、肝細胞分化中の細胞小器官間接触の3D超構造、ならびに代謝性疾患に関連する肝細胞構造の変化を視覚化するのによく適している。

この技術のために、関心のある領域は、生物学的研究目的に基づいて選択され、埋め込み組織のトリミングおよび切片化の前に同定される。同様に、ブロック面のサイズは、研究の質問によって決定されることがあります。この場合、サンプルは、約0.3 mm x 0.15 mmのブロック面を残すようにトリミングされました(図4A)。これにより、グリッドあたり9つのシリアル切片からなる2つのグリッドが可能となり、18個の連続切片が提供され、約62μm3(316μm x 150μm x 1.3μm)の体積の肝臓組織の体積を組み込んだ。この体積は、肝臓組織における個々のミトコンドリアの完全な3D再構成を可能にするのに十分であった。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63496/63496fig04.jpg"> 図4...

肝臓または他の組織の細胞から肝細胞細胞小器官間の膜接触部位の三次元的詳細を取得するための簡単で包括的なプロトコル。

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

このプロトコルは、オルガネラの3D再構成をシンプルで堅牢な方法で可能にすると同時に、現在専門の体積電子顕微鏡を持たない研究室でもアクセスできます。この技術は非常に柔軟で、優れたX / Y解像度を提供しながら、必要に応じてサンプルを再画像化することができます。また、非常に高いZ分解能が必要な場合の傾斜断層撮影とも互換性があります。この技術は、オルガネラ間の文脈におけるオルガネラ形態の尋問を可能にする。したがって、オルガネラ欠損を有する任意の病理学的状態を調べるために拡張することができる。このアプローチは、オルガネラ相互作用および細胞密売事象に関する洞察を提供することができる。この方法は、肝細胞に加えて、他の組織、オルガノイドモデル、および細胞培養系にも適用することができる。初めてのユーザーは、シリアルセクショニングを見つけて、損失なく挑戦的になるかもしれません。このプロトコルを貴重なサンプルに適用する前に、通常の超薄切片化に堪能であることをお勧めします。まず、サンプルをトリミングアダプターにロックした状態で、カミソリの刃を使用して樹脂埋め込み組織を慎重にトリミングします。試料箱舟をチャックと試料とともにミクロトームの試料アームに移し、箱舟の移動範囲が上から下まで流れるように標本箱舟を配置します。ダイヤモンドナイフをナイフホルダーに入れてロックし、ナイフの切断角度が適切に設定されていることを確認します。ナイフホルダーをステージにしっかりとロックします。ステージのダウンライトをオフにし、ステージのアップライトをオンにし、慎重にナイフを試料の方へ動かし、ブロック面がナイフの端に揃うまで関連するノブを調整して、ナイフの横方向の角度、試料の傾き、および試料の回転を継続的に調整します。試料アームの切断窓の上下をセットし、試料をナイフエッジのすぐ下に置きます。ナイフボートを清潔な二重蒸留水で満たし、水面がナイフの刃先と水平でわずかに凹んでいることを確認します。次に、セクションの切断を開始します。サンプルがナイフの刃先を通過した直後に切断を停止します。空のスロット グリッドを使用して、各グリッドで収集するセクションの数を見積もります。両手にまつげを使用して、スロットグリッドの長さに収まる小さなリボンにリボンをそっと割ります。サンプル内の相対的な位置を心に留めておきます。ガラスのアプリケーターロッドを使用して、クロロホルムを1滴ずつセクションの上に置き、平らにします。最初の番号の付いた鉗子で最初の空のスロットグリッドを拾い上げ、Triton X-100に静かに浸してから蒸留水に2回浸します。ろ紙を使用して、鉗子の端から余分な水を取り除きます。鉗子を使用して、formvarコーティングされたスロットグリッドの約2/3をナイフボートの水に静かに下げます。formvar 側が下を向いており、スロットの長い右手の端が水面にあり、水辺と平行であることを確認します。水中のグリッドをリボンに向かって静かに漂わせて、戻りストローク時にセクションがグリッドに向かってドリフトするようにします。リボンの右端がスロットの右端に揃うまで、これをますます小さな漂い方で続けます。次に、最後の漂流で、グリッドを静かに上に上げて、セクションをスロットグリッドに上げます。水酸化ナトリウムのペレットをペトリ皿の蓋の下に置き、二酸化炭素を含まない環境を提供します。次いで、パラフィルム上にレイノルド鉛クエン酸塩の40マイクロリットル滴を慎重にピペットし、グリッドごとに1滴ずつピペットする。各グリッドをクエン酸鉛滴の上に反転させ、ペトリ皿の蓋で7〜10分間保護したままにします。グリッドが染色されている間、パラフィルム上の各グリッドに対して約300マイクロリットルの蒸留水を5滴置きます。クエン酸鉛インキュベーションの最後に、各グリッドを蒸留水の液滴に移し、グリッド上で直接呼吸することなく1分間洗浄する。これをさらに4回繰り返します。番号付きのクロスオーバー鉗子を使用して、最初のグリッドを拾います。グリッドの端に触れてろ紙を塗って水の大部分を吸い取り、鉗子で少なくとも20分間乾燥させます。グリッドごとにこれを繰り返します。低倍率で、シリアルセクションの順序、位置、および位置を観察します。グリッド上の系列の中央のセクションに移動します。サンプルを参照し、関心領域を特定します。その後、所望の倍率で試料を観察する。断面が完全に整列していないことが多く、後で画像を切り取る必要がある可能性があるため、シリーズをわずかに低い倍率で収集することを検討してください。次に、より低い倍率で参照画像を撮影します。これは、関心領域のコンテキスト、セクション境界に関連する異なる倍率での大まかな位置、およびサンプル内のランドマークフィーチャを理解するのに役立ちます。これらを使用して、他のセクションの関心領域を標識します。画面を参照するには、再利用可能な粘着パテ、ステッカー、またはオーバーヘッドプロジェクター用紙を画面にテープで貼り付けて、画面上に一時的なマーカーを配置します。これにより、データセット全体で画像の中心にある関心領域の同じ特徴を日常的に再想像することができます。画像スタックを開き、ボクセル測定値を指定し、[セグメンテーション]タブを選択してセグメンテーションを開始します。セグメンテーションエディタパネルで新規をクリックして、マテリアルリストに新しいオブジェクトを定義します。右クリックしてオブジェクトの色を変更し、ダブルクリックしてオブジェクトの名前を変更します。手動セグメンテーションの場合は、マテリアルリストの下にあるセグメンテーションツールを選択し、デフォルトのブラシツールを選択してピクセルをハイライトします。対向する2つの肝細胞の電子顕微鏡像をここに示す。より高い倍率イメージングは、ナノメートルの分解能で異なる細胞小器官の形態学的詳細の観察を可能にする。代表的な画像は、同じ断層像のセグメント化されたバージョン、小胞体の痕跡、ミトコンドリア、および異なる空間のERとミトコンドリアとの間の膜間接触をここに示している。代表的な画像は、セグメンテーショントレースとミトコンドリア全体内のその相対位置とを重ね合わせた傾斜したオルソスライスを示しています。セグメント化された細胞小器官と小胞体 - ミトコンドリアが異なる角度で接触する3D再構成がここに示されている。このプロトコルは、非常に高いZ分解能が必要な場合にチルト断層撮影と互換性があるため、小さな構造や複雑な構造を解くのに役立ちます。この技術は、異なる細胞小器官間の空間的関係の初期評価に最適であり、したがって、膜恒常性における膜接触の進行分野において特に有用である。

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Biology

生物学

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