Name: クローン病における機械的ストレスの病原的役割を研究するためのTNBS誘発げっ歯類モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 学ぶTNBS誘発げっ歯類モデルによるクローン病の機械的ストレスの病原的役割の研究。この手法は、炎症部位と非炎症部位の比較解析を可能にし、狭窄性病態における機械的変化を評価します。

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この作業は、NIH(R01 DK124611からXZSまで)と米国国防総省(W81XWH-20-1-0681からXZSまで)からの助成金によって部分的にサポートされています。組織学の研究は、UTMB外科病理学研究室の助けを借りて行われました。

すべての動物実験は、テキサス大学医学部(#0907051C)の施設動物ケアおよび使用委員会に従って実施した。生後〜8〜9週齢の雄または雌のSprague-Dawleyラットを本研究に使用した。
1. 動物の準備
<ol><li>ラットを24時間絶食させ、一晩下剤(腸洗浄料、 材料表を参照)で処理する。</li>
	<li>翌日、TNBS投与中にラットを麻酔システム( 材料表を参照)を用いて麻酔し、2%イソフルランと1L/分の酸素に曝露した。麻酔を確認するために反射神経やつま先をつまんでください。</li>
	<li>体重に応じて新鮮なTNBS溶液を調製する。 注:TNBS - 250 μLの40%エタノール中の65 mg/kg体重を使用しました。</li>
	<li>ラットを麻酔テーブルの仰臥位に置きます。大腸炎を誘発するには、肛門から約7〜8cmの医療グレードのオープンエンドポリウレタンカテーテルを肛門を通して挿入し、TNBS(ステップ1.3で調製)を結腸19に穏やかに注入する。偽対照ラットに250 μLの生理食塩水のみを投与する。</li>
	<li>TNBSまたは生理食塩水を点眼した後、ラットを仰臥位に保ち、わずかに頭を下げた位置(〜30°)に保ち、TNBSの分布を助け、こぼれを避けるために肛門を2分間閉じます。</li>
	<li>ラットに7日間自由に食物と水を与え、体重、食物摂取、糞便、および一般的な健康状態についてラットを毎日観察する。</li>
</ol>2. 組織製剤
<ol><li>安楽死の日に、CO2 吸入を用いてラットを安楽死させ、子宮頸部脱臼を伴う安楽死を確認する。</li>
	<li>外科用グレードのはさみと鉗子を使用してラット腹部を開きます。</li>
	<li>結腸全体(肛門管の上)を慎重に除去し、結腸を直ちに氷冷1x HBSS緩衝液に移す。</li>
	<li>バッファー内のコロンをまっすぐにし、定規を使用してコロンの長さを測定します。ナイロン糸を取り、結腸の周りを回って、対照およびTNBS処置ラットにおける結腸セグメントの外周を測定する。組織学のために全厚組織を取る。</li>
	<li>腸間膜ボードに沿って結腸を切り開き、HBSSバッファーで結腸をよくきれいにします。最小限の修正で先に記載したような基準に基づいて結腸を巨視的炎症スコアについて評価する19 。 注: 0 = 正常な粘膜;1 = 局在性充血であるがびらんや潰瘍はない。2 = 潰瘍および狭窄(患部<5mm);3 = 重度の潰瘍、瘢痕、狭窄(患部>5mm)。</li>
	<li>部位P(炎症部位の口腔縁の2〜3cm前の部分)、部位I(炎症部位、典型的には結腸の端部から4〜6cm、TNBSが点眼される場所)、および部位D(炎症部位の腹腔縁までの遠位1〜2cmの部分)から結腸組織サンプルをそれぞれ採取する。 注:〜1〜2cmの長さの結腸組織を各セグメントから採取した。さらに、生理食塩水処理ラットの長さ2cm(結腸の端部から約4〜6cm)の結腸組織を偽対照(S)として採取した(図1)。</li>
	<li>全層調製のために各部位から組織サンプルを採取し、必要に応じて、粘膜/粘膜下層および筋膜外側層をそれぞれ採取する21,22。</li>
	<li>組織サンプルを液体窒素で凍結してから、-80°Cで保存し、最大1年間保存し、将来の目的(RNA調製物など)に使用します。</li>
</ol>3. 腸の炎症と線維症の病理組織学的評価
<ol><li>全厚結腸組織を10%ホルマリンで48時間固定し、次いで70%エタノールに24〜48時間移す。</li>
	<li>ミクロトームを使用して、ヘマトキシリンとエオジン(H&E)およびマッソンのトリクロム染色6、19、23(材料表を参照)について、それぞれ厚さ5μmのパラフィン切片を切断する。</li>
	<li>互換性のあるソフトウェアを備えた高解像度カメラを搭載した直立顕微鏡で画像を取得して表示します( 材料表を参照)。</li>
	<li>グレード炎症および線維症指数は、以前に記載した基準に従った胃腸外科病理学者を含む2人の独立した研究者による6、23 の修正を伴う。スコアについては 、補足ファイル 1 を参照してください。</li>
	<li>各H&E染色標本の4つのビューで断面ごとの円形および縦方向の筋肉層の厚さおよび細胞数を測定し、各標本について4つの測定値の平均をとる。</li>
</ol>4. RNA抽出と定量RT-PCR
<ol><li>TNBS大腸炎ラットの偽対照および3つの部位(P、I、D)から得られた摘出した結腸組織をRNA抽出キットの抽出試薬中でホモジナイズする( 材料表参照)。</li>
	<li>キットを利用して各サンプルからRNAを単離する。RNペレットを30 μLのRNase非含有水で溶出する。</li>
	<li>マイクロボリュームUV-Vis分光光度計を使用してRNA濃度を定量し、純度を確認します( 材料表を参照)。</li>
	<li>RNA合成キットを使用してcDNA21,22を合成するには、1μgの全RNAを使用します(材料表を参照)。</li>
	<li>リアルタイムPCRシステム用の市販のPCRキットを使用して、50ngのcDNA、IL-6のプローブ、およびCTGFを用いてリアルタイムPCRを行うことで、遺伝子発現レベルを分析および定量します( 材料表を参照)。</li>
	<li>対照遺伝子18S rRNAを使用してサンプルを正規化し、得られたCq値を利用して相対遺伝子発現を定量します。</li>
</ol>5. 統計解析
<ol><li>統計解析ソフトウェア( 材料表を参照)を利用して、偽対照ラットとTNBS大腸炎ラットを比較します。</li>
	<li>p値<0.05は統計的に有意な15,19であると考えてください。</li>
	<li>2つのグループ間の差を検定するには、スチューデントのt検定分析を使用し、比較が3つ以上のグループである場合に分散分析を実行します15,19。</li>
</ol>

<ol><li>Kappelman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+geographic+distribution+of+Crohn%27s+disease+and+ulcerative+colitis+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).</li>
<li>Hwang, J. M., Varma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+for+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Surgery for inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).</li>
<li>Latella, G., Rieder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis%3A+Ready+to+be+reversed%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis: Ready to be reversed.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).</li>
<li>Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+management%2C+and+treatment+of+fibrosis+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).</li>
<li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Crohn%27s+disease-associated+small+bowel+strictures+and+fibrosis+on+cross-sectional+imaging%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review.</a> Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).</li>
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<li>Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylactic+and+therapeutic+benefits+of+COX-2+inhibitor+on+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Roles+of+PGE2+and+EP+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).</li>
<li>Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Mudter, J., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Il-6+signaling+in+inflammatory+bowel+disease%3A+Pathophysiological+role+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance.</a> Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).</li>
<li>Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mechano-transcription+process+as+therapeutic+intervention+in+gastrointestinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 809350(2021).</li>
</ol>

著者らは利益相反を報告しておらず、開示するものも何もない。

TNBS誘発性大腸炎は1989年に導入され、それ以来クローン病の実験モデルとして使用されてきました 19,20,23.げっ歯類におけるこのモデルの重要な特徴は、ヒトクローン病において発症した病理組織学的病変によく似た経壁炎症の発症を含む19,20。このモデルに関する以前の研究は、主に目に見える炎症の部位(部位I)の粘膜層における異常な免疫応答に焦点を当ててきた19、20、23。炎症の近位および遠位の腸部分にはほとんど注意が払われていない。炎症部位、ならびに遠位近位セグメントおよび非遠位セグメントに関する本研究は、遺伝子発現、炎症反応、および組織病理学的...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol/saline was used.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.

Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

炎症性腸疾患(IBD)は、潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)を含む、胃腸(GI)管における慢性炎症によって特徴付けられる。それは〜100万〜200万人のアメリカ人に影響を与えます1。米国におけるIBDケアの推定年間費用は118億ドルです。UCとは異なり、CDは経壁炎症および狭窄形成によって特徴付けられる2,3。狭窄形成(狭窄)は、CD患者3の最大70%で起こり、経壁炎症(炎症性狭窄)または腸線維症(線維性狭窄)4,5によって引き起こされる可能性がある。腸管線維症は、プロセス3,4に関与する主な間葉系細胞型の1つとして平滑筋細胞(SMC)を有する過剰なコラーゲン沈着および他の細胞外マトリックス(ECM)によって特徴付けられる。肥大に関連する平滑筋過形成は、CD6における線維性狭窄症における別の重要な組織学的変化である。CDにおける狭窄形成は慢性炎症と関連しているが、外科的治療を除いて抗炎症治療は有効ではない2,6。しかし、術後の再発はほぼ100%であり、十分な時間が与えられている2,7。炎症反応として、線維症およびSMC過形成はまた、腸内の非炎症状態(すなわち、腸閉塞)において発症し得る8,9;炎症依存性および独立したメカニズムの両方が狭窄形成に関与していると考えられている3,4。炎症依存性機構に関する広範な研究が狭窄形成のためのいかなる効果的な治療法にも変換されていないことを考えると、腸線維症における炎症非依存性機構の可能な役割に関する研究が必要である。
非炎症性因子として、浮腫、炎症性細胞浸潤、組織変形、線維症、および狭窄10、11、12、13に関連する機械的ストレス(MS)は、IBD、特にCDにおいて一般的に遭遇し、これは経壁炎症によって特徴付けられる。機械的ストレスは狭窄性CDにおいて最も顕著であり、炎症部位における狭窄(炎症性または線維性)は局所組織に機械的ストレスを提示し、閉塞部位10,14に近位するセグメントにおける内腔膨張をもたらす。以前のインビトロ研究は、機械的ストレスが胃腸組織、特に腸平滑筋細胞(SMC)16における特定の炎症メディエーター(すなわち、COX-2、IL-6)8、14、15および成長因子(すなわちTGF-β)の遺伝子発現を変化させることを実証している16。最近の研究はまた、結合組織成長因子(CTGF)などの特異的な親線維性メディエーターの発現が機械的ストレスに対して非常に敏感であることも見出した17,18。機械的ストレスがCD関連炎症、線維症、および組織リモデリングにおいて独立した病原性役割を果たす可能性があるという仮説が立てられた。しかしながら、CDにおける腸の炎症、線維症、および平滑筋過形成における機械的ストレスの病原的意義は、ほとんど未解明のままである。これは、炎症が機械的ストレスよりも目に見え、よりよく研究されたプロセスであるためかもしれません。さらに重要なことに、機械的ストレスの影響と炎症の影響を区別するために、IBDの明確に定義された動物モデルはなかった。
今回の研究は、ハプテン試薬2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)19,20の結腸内注射によって誘発されるクローン様大腸炎のげっ歯類モデルを記述しており、CDにおける機械的ストレスの役割を研究する目的に役立つ可能性がある。TNBS点眼は、遠位結腸の内腔狭窄(狭窄)を伴う局在性(長さ〜2cm)の経壁炎症を誘発することが見出された。狭窄は顕著な腸膨張(機械的ストレス)14,15をもたらすが、点眼部位に近位の結腸セグメントでは目に見えない炎症をもたらす。それどころか、狭窄部位の遠位にある結腸セグメントは、炎症も機械的ストレスも示さない。遺伝子発現、炎症、線維症、およびSMC過形成における有意な部位特異的変化が、3つの異なる部位において観察された。この結果は、機械的ストレス、特に機械的ストレス誘発遺伝子発現が、クローン大腸炎における線維症および過形成の発症に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。

<table><tbody><tr><td>ACT-1 制御ソフトウェア Ver2.63</td><td>ニコン</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>C1000 タッチサーマルサイクラー 96ウェル高速反応モジュール</td><td>BIO-RAD</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 リアルタイムPCRシステム用光反応モジュール</td><td>BIO-RAD</td><td>1845097</td><td></td></tr><tr><td>Dako Agilent Artisan Link Pro スペシャルステイナー</td><td>Dako</td><td>AR310</td><td></td></tr><tr><td>Dako-Agilent Masson'sトリクロームキットref#AR173</td>ダ<td>コ</td><td>AR173</td><td></td></tr><tr><td>DXM1200デジタルカラーHRカメラ</td><td>ニコン</td><td>DXM1200</td><td></td></tr><tr><td>真核生物18S rRNA内因性制御</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4352930E</td><td></td></tr><tr><td>EZ麻酔</td><td>E-Zシステムズ株式会社</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad</td><td>9.0.2 (161)</td><td></td></tr><tr><td>ハードシェル 96 ウェル PCR プレート、ロープロファイル、薄壁、スカート、ホワイト/クリア</td><td>BIO-RAD</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without Calcium and Magnesium)CORNING</td><td></td> <td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-667</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR オデッセイ デジタルイメージングシステム</td><td>LI-COR</td><td>9120</td><td></td></tr><tr><td>マスターサイクラー epGradient サーマルサイクラー コントロールパネル付き 5340 サーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5341</td><td></td></tr><tr><td>医療グレードのオープンエンドポリウレタンカテーテル</td><td>Covidien</td><td>8890703013</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>ニコンエクリプスE800直立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース/フィルターペーパーサンドイッチ50個入りパッケージ、0.45 &mu;m, 7 x 8.5 cm</td><td>BIO-RAD</td><td>1620215</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 3350, 浸透圧性下剤</td><td>Miralax</td><td>C8175</td><td>投与量: 水 226 mL に 17g</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Programss Rn00573960_g1 CTGF Probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1</td><td>Sakura</td><td>6190</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus 自動スライドステイナー</td><td>Sakura</td><td>6171</td><td></td></tr><tr><td>TNBS (Picrylsulfonic acid solution)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>92822</td><td></td></tr></tbody></table>

クローン病における機械的ストレスの病原的役割を研究するためのtnbs誘発げっ歯類モデル

A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

クローン病(CD)などの炎症性腸疾患(IBD)は、ヨーロッパおよび米国で約20 per 1,00,000に影響を及ぼす胃腸管の慢性炎症性障害である。CDは、経壁炎症、腸線維症、および管腔狭窄症を特徴とする。抗炎症療法は炎症の制御に役立つかもしれませんが、CDの線維症や狭窄には効果がありません。CDの病因はよく分かっていない。現在の研究は、主に調節不全の腸内免疫応答メカニズムの描写に焦点を当てている。CD関連経壁炎症、腸管線維症、および管腔狭窄症はすべて腸壁への機械的ストレスを表すが、CDにおける機械的ストレスの役割は明確に定義されていない。機械的ストレスがCDにおいて独立した病原性役割を果たすかどうかを決定するために、げっ歯類におけるTNBS誘発CD様大腸炎モデルのプロトコールが開発されている。このTNBS誘発性経壁炎症および線維症モデルは、結腸におけるCDの病理学的特徴に類似している。これは、成体スプレイグ・ドーリーラットの遠位結腸へのTNBSの結腸内点滴入によって誘導される。このモデルでは、経壁炎症はTNBS点眼部位(サイトI)で狭窄をもたらす。機械的膨張は、点眼部位に近い部分(部位P)において観察され、機械的ストレスを表すが目に見えない炎症を表す。炎症に対する遠位結腸部分(部位D)は、炎症も機械的ストレスも示さない。異なる部位(P、I、およびD)における遺伝子発現、免疫応答、線維症、および平滑筋成長の特徴的な変化が観察され、機械的ストレスの深刻な影響が浮き彫りになった。したがって、CD様大腸炎のこのモデルは、CDの病原メカニズム、特に免疫調節不全、腸線維症、およびCDにおける組織リモデリングにおける機械的ストレスおよび機械的ストレス誘発遺伝子発現の役割をよりよく理解するのに役立ちます。

TNBSの結腸内点眼によって誘発されるクローン様大腸炎の巨視的見解 図1に示すように、ラットにおけるTNBSの結腸内点眼は、遠位結腸の点眼部位において、腸壁が肥厚し、管腔が狭くなった(狭窄)を伴う局在性経壁炎症(長さ〜2cm)を誘発した(図1A)。TNBS点眼の部位をサイトIと呼ぶ。経壁炎症および狭窄の結果として、炎症および機械的ストレスの両方が部位Iに存在する。この部位における狭窄はTNBS点眼の部位(部位P)のセグメント近位における顕著な内腔膨張をもたらした(図1)。結腸周囲は、偽対照結腸(p&lt;0.05対対照)と比較して、部位PおよびIにおいて有意に増加した(図1B)。機械的に歪んでいる間、部位Pは目に見える炎症を示さなかった。それどころか、TNBS点眼部位の遠位にある結腸セグメントは部位Dであり、炎症も機械的膨張も...

本プロトコールは、げっ歯類におけるクローン様大腸炎モデルの開発を記載している。経壁炎症はTNBS点眼部位に狭窄をもたらし、狭窄の近位セグメントに機械的拡大が観察される。これらの変化は、大腸炎における機械的ストレスの研究を可能にする。

クローン病における機械的ストレスの病原的役割を研究するためのTNBS誘発げっ歯類モデル

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting ...

したがって、我々のプロトコルでは、TNBSの結腸内点眼は、点眼部位における経壁炎症および炎症に近位にあるセグメントにおける機械的膨張をもたらす。したがって、これは狭窄性クローン病を模倣しています。近位セグメントは機械的に遠ざかっているが目に見える炎症を示さないので、近位セグメントと炎症部位の比較研究は、機械的ストレスがクローン大腸炎において役割を果たすかどうかを判断するのに役立つ。以前の研究では、炎症部位のみに焦点を当てています。モデル内のさまざまな部位で作業する我々のプロトコルは、クローン病、特に狭窄性クローン病における機械的ストレスの重要な役割を強調している。まず、ラットを麻酔テーブルの上に仰臥位に置きます。大腸炎を誘発するには、医療グレードのオープンエンドのポリウレタンカテーテルを肛門から約7〜8センチメートル肛門に挿入し、TNBSを結腸に優しく点滴します。偽対照ラットに250マイクロリットルの生理食塩水を投与する。TNBSまたは生理食塩水の分布を助け、こぼれを避けるために、ラットを仰臥位に保ち、頭を約30度の角度で下向きにし、肛門を2分間閉じます。外科用グレードのはさみと鉗子を使用してラット腹部を開きます。肛門管の上の結腸全体を慎重に取り除き、結腸を直ちに氷冷1x HBSS緩衝液に移す。バッファー内のコロンをまっすぐにし、定規を使用してコロンの長さを測定します。ナイロン糸を取り、結腸の周りをぐるぐる回して、対照およびTNBS処置ラットにおける結腸セグメントの外周を測定した。組織学のために全厚組織を取る。腸間膜ボードに沿って結腸を切り開き、HBSSバッファーで結腸を徹底的に清掃します。最小限の修正で事前定義された基準に基づいて巨視的炎症スコアについて結腸を評価する。炎症部位の口腔縁の2~3センチメートル前の部分である部位P、I、および D.Site PでTNBS処理ラットから結腸組織サンプルを採取する。サイトIは、TNBSが点眼される炎症部位であり、典型的には結腸の端部から4〜6センチメートルである。最後に、部位Dは、炎症部位の腹腔縁に対して遠位1~2センチメートルの部分である。ラットにおけるTNBSの結腸内点眼は、遠位結腸の点眼部位において肥厚した腸壁および狭くなった管腔を有する長さ約2センチメートルの局所的な経壁炎症を誘発した。TNBS点眼の部位は、経壁性炎症および狭窄の結果として部位 I.As と呼ばれ、炎症および機械的ストレスの両方が部位Iに存在していた.部位Iの狭窄は、部位Pと呼ばれるTNBS点眼の部位に近位にあるセグメントに顕著な内腔膨満をもたらし、結腸周囲は、偽対照結腸と比較して部位PおよびIにおいて有意に増加した。機械的に歪んでいる間、部位Pは目に見える炎症を示さなかった。それどころか、部位Dと呼ばれるTNBS点眼の遠位結腸セグメントは、炎症も機械的膨満も示さなかった。TNBS処置ラットにおける部位Iにおける炎症の巨視的スコアは、大腸炎ラットの部位PおよびDにおける偽対照と比較して劇的に増加した。部位PおよびDにおける炎症スコアは、偽物と比較して有意に増加しなかった。したがって、クローン病における機械的ストレスの病原性の重要性を認識するのに役立つため、モデル内の部位Iだけでなく、部位PおよびDを研究することが重要です。機械的ストレスが腸内炎症の病原性因子であるかどうかをさらに決定するために、動物に流動食のみを与えて機械的膨張を放出し、これが炎症および腸機能に役立つかどうかを確認することもできる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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クローン病における機械的ストレスの病原的役割を研究するためのTNBS誘発げっ歯類モデル

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