Name: 生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼虫の片眼除去法による視覚系発達と神経支配依存性の成長メカニズム。同個体内で神経支配有無の視床葉を比較し、神経発生・再生・変性の研究に応用可能です。

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この研究のための資金は、主にリードカレッジからKLCへのスタートアップ資金、OLHへのヘレンスタッフォードリサーチフェローシップ資金、およびYKへのリードカレッジサイエンスリサーチフェローシップによって支えられました。このプロジェクトは、Wellcome Trust Studentship(2009-2014)の支援を受けたHRとのコラボレーションとして、Steve Wilsonの研究室で始まりました。このプロジェクトに関する最初の議論をしてくれたMáté Varga、Steve Wilson、およびWilson研究室の他のメンバーに感謝し、特にKLCにアガロースに胚をマウントし、ゼブラフィッシュの脳解剖を行う方法を最初に教えたFlorencia CavodeassiとKate Edwardsに感謝します。また、タングステン針研ぎ装置の組み立てに協力してくれたグレタ・グローバーとジェイ・ユーイングにも感謝します。

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</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

この論文で説明する技術は、ゼブラフィッシュにおける脊椎動物の視覚系発達を研究するための多くのアプローチの1つを示しています。他の研究者は、胚性網膜を解剖し、遺伝子発現解析19 を実行する方法、または視蓋骨30におけるニューロン活性を視覚化する方法を発表した。この論文は、差動網膜入力が視蓋内の細胞挙動にどのように影響するかを探るためのアプローチを提供する。
手術後の駆除と幼虫の生存を確実に成功させるためには、幼虫が健康で、適切に麻酔をかけ、1%のアガロースで固定することが重要です。鉗子とタングステン針が非常に鋭く清潔であることも重要です。幼虫は、手術の24時間前または手術後に給餌されていないときに最もよく生存し、抗生物質を補充したMMRで幼虫を飼育すると、治癒プロセスが速くなる。重要なことに、MMRのより高いイオン強度、特にカルシウムのより高い濃度は治癒を促進する14。しかし、より高い塩分濃度へのより長い曝露は、胚性ゼブラフィッシュ<sup ...

この方法の目的は、網膜入力がゼブラフィッシュ脳の視覚処理センターである視蓋骨の成長と発達にどのように影響するかを調べることです。片目を取り除いた後、視蓋の両側を比較することで、同一試料内のテクタル変化を観察・正規化することができ、複数の検体間での比較が可能となります。この技術と組み合わせた現代の分子アプローチは、視覚系の成長と発達、ならびに軸索の変性と再生の根底にあるメカニズムへの洞察をもたらすでしょう。
視覚、聴覚、体性感覚などの感覚系は、外部器官から情報を収集し、その情報を中枢神経系に中継し、中脳全体の外界の「マップ」を生成します1,2。視覚は、多くの魚を含むほぼすべての脊椎動物にとって支配的な感覚様式です。眼の神経組織である網膜は、網膜の投影ニューロンである視受容体、双極性細胞、網膜神経節細胞(RGC)を主体とする神経回路で情報を収集します。RGCは長い軸索を持ち、網膜の内面を横切って視神経頭に向かい、そこで脳を魅了して一緒に移動し、最終的に背側中脳の視覚処理センターで終わる。この構造は、魚類や他の哺乳類以外の脊椎動物では視蓋骨と呼ばれ、哺乳類の優れた丘陵地帯と相同である3。
視蓋骨は、背側中脳における両側対称の多層構造である。ゼブラフィッシュおよび他のほとんどの魚類では、視蓋の各葉は対側眼からのみ視覚入力を受け取るため、左視神経は右眼房で終了し、右視神経は左眼球4で終了する(図1)。哺乳類の対応物である上甲骨と同様に、オプティックテクタムは視覚情報をオーディションや身体感覚などの他の感覚入力と統合し、視覚的注意の変化やサッケードなどの眼球運動を制御します1,5,6。しかし、哺乳類の上斜膜とは異なり、視蓋骨は、テクタル増殖ゾーン7と呼ばれるテクタルローブの内側および尾縁付近の特殊な幹細胞ニッチから新しいニューロンおよびグリアを連続的に生成する。視蓋および中枢神経系の他の領域における増殖性前駆細胞の維持は、部分的には、ゼブラフィッシュ8に文書化された顕著な再生能力に寄与する。
盲目または片目の魚の脳を調べた以前の研究は、視蓋の大きさがそれが受ける網膜神経支配の量に正比例することが明らかになった 9,10,11.初期胚発生で目が退化する成体の洞窟魚類では、オプティックテクタムは、近縁の、目の見える表面魚9のそれよりも著しく小さい。洞窟魚眼の変性は、胚発生時に内因性レンズを表面魚由来のレンズと交換することによって阻止することができる。これらの片目の洞窟魚が成体期まで飼育されると、神経支配されたテクタルローブは、非神経化されたテクタルローブ9よりも約10%多くの細胞を含む。同様に、同じ個体内で異なるサイズの目を生成するために化学的処置を用いて孵化した幼虫キリフィッシュにおいて、より神経支配されたテクタムの側面はより大きく、より多くのニューロン10を含んでいた。成体金魚における視神経圧潰実験からの証拠は、神経支配が増殖を促進し、神経支配が破壊されるとテクタル細胞増殖が減少することを示している11。
これらの古典的な研究を確認し、拡張して、いくつかの最近の報告は、神経支配に応答した増殖が、少なくとも部分的には、BDNF-TrkB経路12、13によって調節されることを示唆するデータを提供する。発達中の感覚系が損傷および軸索変性にどのように対処するか、どの細胞および分子シグナルが網膜入力が視蓋成長を調節することを可能にするか、これらのメカニズムがいつアクティブになるか、神経支配に関連した増殖および分化が網膜およびその標的組織が成長速度を調整し、正確な網膜トピックマッピングを確実にすることを可能にするかどうかなど、眼テクタムの成長および発達に関する多くの未解決の疑問が残っている。さらに、活動依存性の発達については、以下に説明するような外科的アプローチでゼブラフィッシュ視覚系を尋問することによって対処できるはるかに大きな質問がある。
神経活動、特に視覚入力からの神経活動が細胞の生存と増殖を変化させる細胞および分子のメカニズムを調べるために、記載されたアプローチは、個々のゼブラフィッシュ幼虫内の神経支配および脱神経化されたテクタルローブ(図1)を直接比較する。この方法は、視蓋におけるRGC軸索変性の文書化および有糸分裂細胞の数が神経支配と相関することを確認することを可能にする。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> 図1:片側眼除去前後のゼブラフィッシュ幼虫のスケッチ 。 (A)解剖顕微鏡下で見た5 dpf幼虫の図面。各幼虫は、低融点アガロースに埋め込まれ、鋭い引っ掛けられた先端を有するタングステン針が上を向いて眼をすくい取るために使用される前に横方向に向けられる(この例では左目)。(B) Aに描かれた手術から生じた9dpf幼虫の背部図の図面。右目から高度に図式化された3つのRGC軸索のみが、左蓋葉のニューロンと脱魅惑的で連結していることが示されている。略語: dpf = 受精後日数;dps = 手術後の日数;RGC = 網膜神経節細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>機器と消耗品:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>育種ボックス</td><td>アクアニアリング</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>ダウコーニング高真空グリース</td><td>シグマまたは同等のサプライヤー</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ(125 mL)</td><td></td><td></td>手術<td>後のインキュベーション用の抗生物質を使用したマークス修飾リンガーズ(MMR)の製造用。</td></tr><tr><td>細い鉗子 - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 & 63A53WT</td><td>胚や幼虫のピペッティング用。</td></tr><tr><td>顕微鏡用スライドガラス</td><td>VWRまたは同等のサプライヤー</td><td>48311-703</td><td>標準的なガラス顕微鏡スライドは、多くの異なるラボサプライヤーから注文することができます。</td></tr><tr><td>目盛り付きボトルやメスシリンダー</td><td></td><td></td>を含むガラス製品 <td>溶液の製造および保管用。</td></tr><tr><td>2液性エポキシ樹脂</td><td>ACE ハードウェアまたはゴリラ接着剤または同等の</td><td>0.85 オンス シリンジ</td><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ (1.7 mL)</td> <td>VWR または同等のサプライヤー</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>ニッケルメッキピンホルダー (長さ 17 cm)</td> <td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>26018-17</td><td>タングステンワイヤーを研ぎ、手術/解剖を行う際に保持するため。</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュの茶ストレーナーまたは同等の</td><td>アリエクスプレスまたは同等の</td><td></td>ゼ<td>ブラフィッシュの卵を産卵後に収穫するため; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>ペーパークリップ</td><td></td><td></td>タングステン<td>針研ぎ装置用。</td></tr><tr><td>ペトリ皿 100 mm</td><td>フィッシャー サイエンティフィックまたは同等のサプライヤー</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 35 mm</td><td>フィッシャー サイエンティフィックまたは同等のサプライヤー</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>ピペットポンプ</td><td>SP Bel-Art または同等の</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td> <td>シグマ</td><td>909122</td><td>タングステン針研ぎ装置用。脱イオン水にペレットを添加することにより、フード内にKOHの10%w / v溶液を作ります。</td></tr><tr><td>電源(可変電圧)</td><td></td><td></td><td>タングステン針研ぎ装置用。可変電圧の電源であれば、(ゲル電気泳動に使用されるものも含む)動作します。</td></tr><tr><td>シルガード184エラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>タングステンワイヤー(直径0.125mm)</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ(WPI)</td><td></td><td>TGW0515シャープにして目を取り除き、幼虫を解剖します。</td></tr><tr><td>可変温度ヒートブロック</td><td>ラボデポまたは同等のサプライヤー</td><td>BSH1001またはBSH1002</td><td>40-42>に設定します。実験に先んじてC。</td></tr><tr><td>蓋付き広口ガラス瓶(例:クリーンジャムやサルサジャー)</td><td></td><td></td><td>タングステン針研ぎ装置用。</td></tr><tr><td>ワニ口クリップリード</td><td></td><td></td>付きワイヤー <td>タングステン針研ぎ装置用。</td></tr><tr><td><ストロング>マイクロスコープ:</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td>どのタイプでも動作しますが、ミラーベース上に調整可能な透過光を持つことが好ましいです。</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td>高NA、20-25倍の水浸対物レンズをお勧めします. ここでは顕微鏡制御および画像キャプチャソフトウェア(NIS-Elements by Nikon)を使用していますが、どの共焦点顕微鏡でも機能します。</td></tr><tr><td>手術および解剖用の試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td>シ<td>グマ</td><td>C7902</td><td>マークの修飾リンガー(MMR)および胚培地(E3)用。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>マークの修正リンガー (MMR) 用。</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>胚培地(E3)またはMarc's Modified Ringers(MMR)で1%を調製します。</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>シグマ</td><td>1374248</td><td>胚培地(E3)用。</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>M7506</td>マーク<td>の修飾リンガー(MMR)用。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>19210</td><td>2倍濃縮PBS(10倍PBSストックから希釈)で8%(w / v)ストックを希釈します。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td>P4333-20ML</td>は<td>、マークの修飾リンガーで1:100に希釈します。</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)錠</td><td>Diagnostic BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>脱イオン水、オートクレーブで10倍のストックを作り、室温で保存します。使用濃度の1倍に希釈します。</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>マーク修飾リンガー(MMR)および胚培地(E3)用。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>マークの修飾リンガー (MMR) および胚培地 (E3) 用。</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S5881</td><td>10 Mを作り、MMRのpHを7.4に調整するために使用します。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>レシピ:免疫</td></tr><tr><td>組織化学用の https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 タグ付き ウサギIgGを検出するための二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>ホールマウントに1:500希釈で使用免疫組織化学。</td></tr><tr><td>DAPIまたはToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306またはT3605</td><td>DMSO中の溶液を1 mg/mL、対比染色用に1:5,000希釈します。</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>イムノブロックバッファーの成分。</td></tr><tr><td>メタノール (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>MeOHとPBSTのような水溶液を混合すると発熱性があります。MeOH/PBST溶液は、少なくとも数時間前に作るか、氷の上で冷却してから使用してください。</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>免疫ブロック緩衝液の成分。1〜10mLの容量で分注し、-20°Cで保存できます。</td></tr><tr><td>ホスホヒストンH3</td><td>ミリポア</td>を検出するための一次抗体 <td>06-570</td><td>ホールマウント免疫組織化学には1:300希釈で使用します。</td></tr><tr><td>一次抗体 検出用 赤色蛍光タンパク質 (RFP; dsRed誘導体を検出)</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>1:500希釈でホールマウント免疫組織化学に使用します。</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK(PK)</td><td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>PBSに10 mg / mLのストック溶液を作り、10 & microで使用します。g/mLです。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>PBSで20%(v/v)のストック溶液を作るのに便利です。</td></tr><tr><td>データ分析用ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td></td><td>画像解析用フリーウェア; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>統計解析およびデータ視覚化用フリーウェア;</td></tr> <tr><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ Adobe Photoshop または GIMP</td><td></td><td></td><td>フィギュアの構図には、独自の画像処理ソフト(Adobe PhotoshopやIllustrator)がよく使われます。フリーウェアの代替手段は、Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td></tr><tr><td>Zebrafish strains. この研究では、AB、TU、Tg[atoh7:RFP]株を使用しました。</td><td></td><td></td><td>から入手可能&nbsp;米国(https://zebrafish.org/home/guide.php)またはヨーロッパ(https://www.ezrc.kit.edu/)のゼブラフィッシュ国際リソースセンター。どちらのリソースセンターにもまだ登録されていない特殊なトランスジェニック株は、出版後に各研究室にリクエストすることができます。</td></tr></tbody></table>

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

ゼブラフィッシュは生涯にわたる顕著な成長と再生能力を示します。例えば、胚発生中に確立された特殊な幹細胞ニッチは、眼および脳の両方において、視覚系全体の継続的な成長をサポートする。網膜と視蓋の間の協調的な成長は、新しいニューロンが目と脳に追加されるにつれて、正確な網膜トピックマッピングを保証します。網膜軸索が、生存、増殖、および/または分化などの眼底幹および前駆細胞の挙動を調節するための重要な情報を提供するかどうかに対処するには、同じ動物内および動物間で神経支配および脱神経化されたテクタルローブを比較できることが必要である。 
生きている幼虫ゼブラフィッシュから片目を外科的に除去し、続いて視蓋骨を観察することで、この目標を達成します。付属のビデオは、幼虫を麻酔し、タングステン針を電気的に鋭くし、それらを使用して片目を除去する方法を示しています。次に、固定されたゼブラフィッシュ幼虫から脳を解剖する方法を示します。最後に、このビデオでは、免疫組織化学のプロトコルの概要と、顕微鏡検査のために染色された胚を低融点アガロースにマウントする方法のデモンストレーションを提供します。

眼球除去が完了したかどうかを確認し、視蓋がどのように変化するかを評価するために、すべてのRGCを膜標的RFPでラベル付けし、したがって網膜から突出して視神経を形成するすべての軸索24を有するTg[atoh7:RFP]株で手術を行った。この菌株を使用することは絶対に必要ではありませんが、視蓋神経ニューロピルにおける視神経末端の簡単な観察と可視化を可能にします。親油性DiIまたはDiO色素25、26による軸索トレース、またはbrainbow 27によるマルチスペクトル標識など、視神経を標識するための他のアプローチも可能であるであろう。
図2に示すように、眼科神経鞘における網膜軸索の進行性変性は、眼球除去後に観察された。手術後2日までに、RFP標識軸索は、ブレビングおよびフラグメンテーションなどの急速...

この記事では、網膜入力が視蓋の成長と発達にどのように影響するかを調査するための第一歩として、生きているゼブラフィッシュの幼虫から外科的に目を取り除く方法について説明します。さらに、この記事では、幼虫の麻酔、固定、および脳解剖に関する情報を提供し、続いて免疫組織化学および共焦点イメージングを行う。

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

私の研究室では、目と脳がどのように一緒に成長するかを理解することに興味があります。この技術により、網膜入力が脳の成長と発達にどのように影響するかを研究することができます。生きている幼虫のゼブラフィッシュから片目を外科的に除去し、続いて視蓋骨を観察することで、同じ動物内および動物間で神経支配された蓋葉と脱神経化された蓋葉を比較することができます。この技術を現代の分子アプローチと組み合わせることで、神経の発達、再生、変性の根底にあるメカニズムに関する新しい洞察を得ることができます。まず、カソード線とアノード線を電源に接続します。陰極線の端にあるワニ歯クリップを部分的にまっすぐにしたクリップに取り付け、ペーパークリップを水酸化カリウム溶液に挿入して瓶の側面に取り付けます。陽極ワイヤーのアリゲータークリップをニードルホルダーの首に取り付けます。電源を約20ボルトに回し、タングステン線を水酸化カリウム溶液に浸し、ワイヤを溶液から斜めに引き出して、ワイヤを電気的に鋭くして微細な先端にします。解剖顕微鏡の下で針の先端をチェックして、十分に鋭いことを確認します。曲線の針先は、鋭利な針をペトリ皿にそっと触れて曲げたときに生じます。手術当日、広口径ガラス牧草地ピペットを使用して、10〜15匹の幼虫を新鮮なE3で満たされた35ミリメートルのペトリ皿に移します。幼虫に麻酔薬を3〜5滴加える。幼虫が適切に麻酔されているかどうかを判断するには、タッチ応答の欠如を探します。幼虫が3分後にまだ接触に反応し、再評価する場合は、麻酔薬をさらに2〜3滴加える。手術のために幼虫を固定化するには、少量のE3だけで1匹の幼虫を狭穴ガラス牧草地ピペットに入れます。次に、約200マイクロリットルの溶融した1%低融点またはLMPアガロースを幼虫を含むピペットに取り込み、幼虫がLMPアガロースに懸濁していることを確認するために混合する。解剖顕微鏡の下で35ミリメートルのペトリ皿の蓋を上向きに置き、幼虫とアガロースを逆さまのペトリ皿の蓋の上に噴き出します。幼虫が滴の中心になるようにアガロースを広げる。鈍いタングステン針を使用して、片目が上を向いて横になるように幼虫を素早く、しかし静かに操縦する。アガロースがセットされるまで数分待ちます。眼窩の端に続いて、細い電解的に研いだタングステン針の先端を使用して、目の周りの皮膚を突き刺します。次に、眼の側頭腹側から眼の下の針の縁をスライドさせる。制御された圧力を使用して、ソケットから目を離します。針の側面で眼を背側および前方に押し続け、最終的に視神経を切り裂いて眼を解放する。あるいは、非常に細かい外科用鉗子を使用して、視神経をつまみ、目を内側から側方に押し込むことによって、目を取り除くこともできます。脱眼が成功したら、MMR溶液でアガロースを覆い、鉗子でペトリ皿のふたを安定させながら、タングステン針を頭の周りに、次に体の周りに優しくブラッシングすることによって、各幼虫をアガロースから解放する。手術後、翌日まで抗生物質を添加したMMR溶液に幼虫を入れ、その後、幼虫をE3に戻し、実験の終点までそれらを飼育する。幼虫を末期麻酔した後、4%パラホルムアルデヒドで固定する。解剖顕微鏡下でシールガードプレート上のPBS液滴中に固定幼虫を懸濁させる。AGM領域を覆う色素沈着領域の後方に1本のピンを配置し、もう1本のピンを卵黄伸長の端に沿って、脊索を通して2本のタングステンピンを配置して、それらを横方向に固定する。鋭いタングステン針と細かい鉗子で目を取り除きます。時には、顎を通って反対側に針を突いて、もう一方の目を取り除くことが可能です。タングステン針を使用して、耳の側頭から腹側に傷をつけます。動いているのと同じ動作で、針を顎に後部持ってきて、耳と顎が取り除かれるまで静かに前方に引っ張ります。もう片方の目と耳は、針を顎に突き刺して取り除きます。鉗子を使用して腹側器官と残りの卵黄を引き出します。最後に、後脳と脊髄の接合部付近の背側頭蓋皮膚に浅い切開を行う。鉗子で皮膚を持ち上げ、それを前方および間脳の周りに引っ張る。鉗子で残りの組織を取り除きます。幼虫のピンを外し、PBSを1.5ミリリットルの微量遠心管に移す。真空グリースを入れた100ミリメートルのペトリ皿の蓋にチャンバー付きスライドを固定します。免疫染色および処理された幼虫をウェルプレートまたは窪みスライドに移し、解剖顕微鏡でそれらを見る。幼虫を1%LMPアガロースカラムのチャンバー付きスライドに取り付けます。ピペットの向こうのガラスを使用して、チャンバー付きスライドに1匹の幼虫を置き、PBSをできるだけ少なくします。同じピペットを使用して、溶けて温かい1%LMPアガロースで幼虫を覆います。LMPアガロースをカラムにピペットで刺し、背側表面が見えるようにできるだけ対称的に幼虫を配置します。眼球除去後、網膜軸索の進行性変性が視蓋ニューロピルにおいて観察された。術後2日までに、RFP標識軸索は、ブラビングおよび断片化などの急速なウォラー変性の特徴を示した。RFP陽性穿刺は、矢印で示すように、テクタムの右側のニューロピルの内側と外側の両方で認められた。術後4日までに、断片化された軸索およびRFP標識された軸索破片が右胸骨でかなり減少し、死にかけている軸索および退化する軸索の比較的迅速なクリアランスが示された。脳は、皮膚および結合組織の目、顎、耳、および頭蓋骨を解剖することによって露出した。理想的には、この手順の間、脳は無傷のままである。しかし、前脳の一部、特に嗅球は、皮膚または顎の頭蓋骨キャップを取り外したときに損傷を受けたか、完全に除去された可能性が高い。さらに、皮膚を突き刺したりつまんだりして脳から引き離すと、テクタムの横の棚がスライスされることがあります。同一のサンプルは 2 つとありません。したがって、必要に応じて、目の除去と脳の解剖を通じて微妙な適応を行うことができる必要があります。患者と鋭いツールは成功に不可欠です。この技術は、in vivo生細胞イメージングやRNAシーケンシングなどの細胞および分子アプローチでフォローアップし、光学テクタムの成長および発達の分子および細胞メカニズムに関する新しい洞察を得ることができます。

eye-removal-living-zebrafish-larvae-to-examine-innervation-dependent

Research

JoVE Journal

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