Name: 脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: 学ぶ マウス脳の脱髄病変からマイクログリアを単離する方法。磁気活性化細胞選別を用いて、神経炎症と中枢神経系疾患におけるミクログリアの役割をin vivoで研究できます。この技術は時間と資源を節約し、細胞収率を向上させます。

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この研究は、同済病院(HUST)優秀若手科学者財団(助成金番号2020YQ06)の支援を受けた。

すべての動物の手順は、同済医科大学の動物ケア委員会研究所、華中科技大学、中国によって承認されています。
1. 素材
<ol><li>プロトコルを開始する前に、次の解決策を準備します。<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にウシ胎児血清(FBS、2%)を加えてローディングバッファーを調製する。</li>
		<li>ニュートラルレッド(NR)色素(最終1%)をPBSに加える。</li>
	</ol>
</li>
	<li>市販の成人脳解離キットを用いて以下の溶液を調製する( 材料表参照)。<ol>
<li>酵素ミックス1を調製するために、1.9 mLのバッファーZおよび50 μLの酵素Pを15 mLの遠沈管にピペットで入れた。</li>
		<li>酵素ミックス2を調製するには、20 μLのバッファーYと10 μLの酵素Aを1.5 mLの微量遠心チューブにピペットで入れます。</li>
		<li>破片除去液を準備する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2.マウスの灌流と解剖
<ol><li>腹腔内(すなわち)麻酔の2〜3時間前にPBS中の500μLの1%NR色素をマウスに注射する。 注:脱髄マウスモデルにおけるNRの腹腔内注射は、病変の識別に役立つ(図1)。</li>
	<li>マウスをペントバルビタール(50mg/kg、i.p.)で麻酔し、疼痛反応を調べることによってマウスが正常に麻酔されていることを確認する。</li>
	<li>マウスの胸腔を開き、心臓を露出させる。</li>
	<li>右心房の小さな角を慎重に切り取り、左心室から20〜30mLの冷たいPBSでマウスを心臓内に灌流する。</li>
	<li>麻酔下でマウスを斬首する。</li>
	<li>マウスの頭蓋骨を開き、慎重に頭蓋骨から脳を解放します。</li>
	<li>脳をマウス脳スライス型に移し、脳を0.1cmスライスに切断する。</li>
	<li>脳のスライスを取り除き、ペトリ皿(60/15mm)の冷たいPBSに入れます。脳梁の周囲のNR色素で標識された病変部を顕微手術用鉗子を用いて実体顕微鏡下で微小解剖する。 注:その後の移送を容易にするために、解剖された組織ができるだけ完全であることを確認してください。解剖の全進行は2時間で完了する必要があります。</li>
	<li>解剖した組織を、適量のコールドローディングバッファーを含む15mL遠沈管に移す。 注:2〜3匹のマウスの脳梁組織を1つのサンプルとして1本のチューブにまとめる。</li>
</ol>3. 組織解離
<ol><li>解剖した組織を300×gで30秒間遠心分離し(この速度に達した後)、チューブの底部でサンプルを回収した。</li>
	<li>酵素ミックス1および酵素ミックス2をインキュベーター内で37°Cに予熱する。</li>
	<li>1,950 μLの予熱酵素ミックス1を1つのサンプルに加え、37°Cのインキュベーターで5分間消化する。</li>
	<li>予熱した酵素ミックス2を30μL加え、優しく混ぜる。</li>
	<li>37°Cのインキュベーターで15分間消化し、5分ごとに穏やかに混合する。</li>
	<li>消化後に4mLの冷たいPBSをチューブに加え、優しく振る。</li>
	<li>70 μm のフィルターを 50 mL の遠沈管に置き、フィルターを 500 μL の冷たい PBS でプリウェットします。消化した組織サンプルをフィルターに通すことによって解離した組織をろ過し、50 mL遠沈管内のろ過懸濁液を15 mL遠沈管に移した。 メモ: 組織の量が少なすぎる場合は、この手順をスキップしてください。</li>
	<li>濾過した組織サンプルを300×g で4°Cで10分間遠心分離し、上清をゆっくりと完全に吸引する。 注:酵素消化を除くすべてのステップは氷上で実行する必要があります。</li>
</ol>4. がれきの除去
<ol><li>細胞ペレットを1,550 μLの冷たいPBSで穏やかに再懸濁する。</li>
	<li>破片除去のために450μLの低温溶液を加え、よく混合する。</li>
	<li>上記の混合物を、1,000 μLのピペットを使用して2 x 1 mLの冷たいPBSで非常にゆっくりと穏やかに重ねます。 注:遠沈管を45°傾け、ピペットで管壁に沿ってPBSをゆっくりと加えます。</li>
	<li>チューブをゆっくりと穏やかに遠心分離機に移し、4°Cおよび3,000× g で10分間スピンする。</li>
	<li>遠心分離後に3つの層を探します。1,000 μLのピペットを使用して、2つの最上層を完全に吸引します(図2)。</li>
	<li>チューブを5 mLまでのコールドローディングバッファーで満たし、チューブを静かに3回反転させます。</li>
	<li>4°Cで1,000× g で10分間遠心分離する。上清を完全に吸引し、細胞ペレットを乱さないでください。</li>
</ol>5. ミクログリア細胞の磁気分離
<ol><li>細胞ペレットを90 μLのローディングバッファーで再懸濁し、10 μLのCD11b(ミクログリア)ビーズを加える。</li>
	<li>よく混ぜ合わせ、4°Cで15分間インキュベートする。</li>
	<li>1 mLのローディングバッファーとピペットを加え、液体を1,000 μLのピペットで穏やかに上下させ、インキュベーション後の細胞を洗浄した。細胞を4°C、300×g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引して未結合ビーズを除去した。</li>
	<li>細胞を500 μLのローディングバッファーに再懸濁する。</li>
	<li>MSカラムとそのセパレータを配置して、磁場中で正の選択を行います。</li>
	<li>カラムを 500 μL のローディングバッファーですすぎ、細胞を保護し、メーカーのプロトコルに基づく磁気選別効率を確保します。</li>
	<li>細胞懸濁液をMSカラムに塗布し、標識されていない細胞を含むフロースルーを破棄します。</li>
	<li>500 μL のローディングバッファーをカラムに 3 回加えて、カラム壁に付着した細胞を洗い流し、フロースルーを廃棄します。 注: カラムリザーバが完全に空である場合にのみ、洗浄用の新しいローディングバッファを追加してください。</li>
	<li>カラムを洗浄した後、カラムを分離器から取り出し、15 mL 遠沈管の上に置きます。</li>
	<li>1 mL のローディングバッファーをカラムに加え、プランジャーをカラムの底部に押し込んで磁気標識された細胞を洗い流します。この工程を3回繰り返して、磁気標識された細胞を完全に回収する。</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGinhoux%2C+F+%22Science%22">Science</a>. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
<li>Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+C+%22Science%22">Science</a>. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaolicelli%2C+RC+%22Science%22">Science</a>. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li>
<li>Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+microglial+subset+in+development%2C+aging%2C+and+disease%3A+Lessons+from+transcriptomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).</li>
<li>Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Neuroscience+and+Oxidative+Stress%22%5BJournal%5D)">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fbrain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+the+brain%3A+Complementary+partners+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).</li>
<li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li>
<li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP%28%2B%29-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).</li>
<li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+%26+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益は存在しないと宣言している。

このプロトコルは、脱髄病変の周囲のミクログリアを単離する方法を提案しており、これは炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの機能的特徴の研究に役立つ可能性がある。CD11bビーズを用いて捕捉されたミクログリアは、高純度および生存率を示す。プロトコルの重要なステップには、病巣の正確な局在化と最適なミクログリア精製が含まれます。プロトコルステップ2.1では、病変を正確に表示できるようにマウスを犠牲にする前にNR溶液を2時間注射する必要がある20。プロトコールステップ2.8では、解剖のために脳組織切片を氷箱の上に置き、できるだけ早くこのステップを完了し、それによって細胞生存率を改善するように注意が払われた。ステップ2.9では、酵素消化とデブリ除去の両方のために、適切な組織を1つのサンプルとして選択する必要があります。ステップ3.7は、破片除去の効果が十分でない場合、スキップすることはできません。ステップ4.3では、PBSの添加は、異なる層を形成するために穏やかでなければならず、できるだけ多くの破片が除去されるようにしなければならない。酵素消化を除くプロトコルのすべてのステップは、細胞の生存率を確保し、...

ミクログリアは卵黄 - 嚢前駆細胞に由来し、非常に早期に胚性脳に到達し、CNS 1,2の発達に関与する。例えば、彼らはシナプス剪定3と軸索成長4の調節に関与しています。それらはニューロンの生存を促進し、ニューロンの局在化を助ける因子を分泌する5。同時に、異常な細胞やアポトーシス細胞の除去に関与し、正常な脳の発達を確保しています6。さらに、脳の免疫コンピテント細胞として、ミクログリアは脳実質を継続的に監視し、死細胞、機能不全シナプス、および細胞破片を除去する7。ミクログリアの活性化は、炎症性脱髄疾患、神経変性疾患、脳腫瘍など、さまざまな疾患において重要な役割を果たしていることが実証されています。多発性硬化症(MS)における活性化ミクログリアは、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)の分化およびミエリン破片8を包み込むことによってミエリンの再生に寄与する。
アルツハイマー病(AD)では、アミロイドベータ(Aβ)の蓄積がミクログリアを活性化し、ミクログリアの貪食および炎症機能に影響を及ぼす9。グリオーマ関連ミクログリア(GAM)と呼ばれるグリオーマ組織中の活性化ミクログリアは、グリオーマの進行を調節し、最終的に患者の予後に影響を与える可能性がある10。この活性化はミクログリアトランスクリプトームを深く変化させ、形態学的変化、免疫受容体の発現、貪食活性の増加、およびサイトカイン分泌の増強をもたらす11。疾患関連ミクログリア(DAM)、活性化応答ミクログリア(ARM)、およびミクログリア神経変性表現型(MGnD)などの神経変性疾患における活性化ミクログリアの異なるサブセットが存在する8。
同様に、ミクログリアの複数の動的機能サブセットも、炎症性脱髄疾患12において脳内に共存する。ミクログリアの異なるサブセット間の不均一性を理解することは、炎症性脱髄疾患の病因を調査し、それらの潜在的な治療戦略を見つけるために不可欠である。ミクログリアの不均一性は、主に分子特異性8に依存する。ミクログリアの分子変化を正確に記述することは、不均一性の研究に不可欠である。単一細胞RNAシーケンシング(RNA-seq)技術の進歩により、病理学的状態における活性化ミクログリアの分子特性の同定が可能になった13。したがって、細胞集団を単離する能力は、特定の条件下でこれらの標的細胞をさらに調査するために重要である。
ミクログリアの特徴と機能を理解するために行われる研究は、培養フラスコに付着し、他の混合グリア細胞と共にプラスチック表面上で増殖するマウスの子犬脳(1〜3日齢)から多数の初代ミクログリアを調製および培養できることが見出されているので、通常 、インビトロ 研究である。続いて、純粋なミクログリアは、混合グリア細胞14、15の異なる接着性に基づいて単離され得る。しかし、この方法は周産期脳からミクログリアを単離することしかできず、数週間かかる。細胞培養における潜在的な変数は、分子発現16などのミクログリア特性に影響を与え得る。さらに、これらの方法で単離されたミクログリアは、CNS疾患の状態をシミュレートすることによってのみ インビトロ 実験に参加することができ、 in vivo 疾患状態におけるミクログリアの特徴および機能を表すことができない。したがって、成体マウスの脳からミクログリアを単離する方法を開発する必要がある。
蛍光活性化細胞選別(FACS)と磁気分離は、広く使用されている2つの方法ですが、それぞれ異なる制限があります16,17,18,19。それぞれの長所と短所は、議論のセクションで対比されます。MACS技術の成熟は、細胞を迅速に精製する可能性を提供する。Huangらは、脳内の脱髄病変を標識する便利な方法を開発した20。これら2つの技術的アプローチを組み合わせることで、我々は迅速かつ効率的な柱状CD11b磁気分離プロトコルを提案し、成体マウス脳の脱髄病変の周りのミクログリアを単離し、ミクログリアの分子特性を保存するための段階的な説明を提供する。局所脱髄病変は、プロトコル21を開始する3日前に脳梁に2μLのリゾレシチン溶液(0.9%NaCl中の1%LPC)を定位注射することによって引き起こされた。このプロトコルは、インビトロ実験で次のステップを実行するための基礎を築きます。さらに、このプロトコルは時間を節約し、さまざまな実験で広く使用するために実現可能です。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLマイクロ遠心チューブ</td><td>BIOFIL</td><td>CFT001015</td><td></td></tr><tr><td>15 mL遠心チューブ</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心チューブ</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;m フィルター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>成人脳解離キット、マウスおよびラット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-677</td> C57BL/677 <td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>SJA Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (ミクログリア) ビーズ、ヒトおよびマウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>BOSTER</td><td>PYG0001</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BDBiosciences</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラル レッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1013690025</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Flow Cytometer</td><td>Agilent</td><td></td><td>A システムさまざまな部品の</td></tr><tr><td>NovoExpressア</td><td>ジレント</td><td>1.4.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ボスター</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>MshOt</td><td>MZ62</td><td></td></tr></tbody></table>

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

ミクログリアは、脳内の常在する自然免疫細胞であり、中枢神経系(CNS)の炎症または傷害に対する主要な応答因子である。ミクログリアは安静状態と活性化状態に分けることができ、脳の微小環境に応じて急速に状態を変化させることができる。ミクログリアは、異なる病理学的条件下で活性化され、異なる表現型を示す。さらに、活性化ミクログリアの多くの異なるサブグループおよび異なるサブグループ間の大きな不均一性が存在する。不均一性は、主にミクログリアの分子特異性に依存する。研究は、ミクログリアが活性化され、炎症性脱髄の病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことを明らかにした。多発性硬化症や神経脊髄炎視神経スペクトラム障害などの炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの特徴をよりよく理解するために、我々は病変周囲一次ミクログリア選別プロトコルを提案する。このプロトコルは、柱状磁気活性化細胞選別(MACS)を利用して高度に精製された原発性ミクログリアを取得し、ミクログリアの分子特性を保存して、炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの潜在的な影響を調査する。

CD11bビーズを用いて単離されたミクログリアは高純度である 脱髄マウスモデルにおける病変の周囲のミクログリア細胞を、上述のプロトコールを用いて単離し、フローサイトメトリーによって試験した。細胞をCD11b-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)およびCD45-アロフィコシアニン(APC)で蛍光標識し、製造業者の指示に従ってフローサイトメトリーでミクログリアを決定する。CD11bおよびCD45抗体が単離ミクログリア19、22の純度をチェックするのに十分であることを実証する複数の文献がある。蛍光補償を、未染色および単一染色対照サンプルを用いてフローサイトメーター上で完了した。細胞を前方散乱高さ(FSC−H)および側方散乱高さ(SSC−H)によってゲーティングした;単一細胞を前方散乱領域(FSC−A)およびFSC−Hによってゲーティングした。磁気分離の前後のミクログリア(CD11b + CD45中間体として同定される)の割合をフローサイ...

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

このプロトコールは、成体マウス脳の微小解剖脱髄病変からミクログリアを単離し、インビボでのミクログリア特性を研究するのに役立つ。この技術は時間を節約し、実験者と機器の両方にとってより低い要件を持っています。この方法は、動物の脳、特に様々な疾患状態の微小解剖組織からミクログリアを単離するのに役立つ。まず、脳梁の周囲の中性色素によって標識された病変を実体顕微鏡下で微小解剖することから始める。解剖した組織を300倍gで30秒間遠心分離し、チューブの底部でサンプルを回収した。インキュベーター内で酵素ミックス1つと酵素ミックス2つを摂氏37度に予熱します。次いで、1,950マイクロリットルの予熱酵素を加え、1対1のサンプルを混合し、摂氏37度のインキュベーターで5分間消化する。予熱した酵素ミックス2種を30マイクロリットル加え、穏やかに混合する。消化後、4ミリリットルの冷たいPBSをチューブに加え、静かに振る。組織サンプルを300倍gで4°Cで10分間遠心分離し、上清をゆっくりと完全に吸引する。細胞ペレットを1,550マイクロリットルの冷たいPBSで穏やかに再懸濁する。破片除去のために450マイクロリットルの冷たい溶液を加え、それらをよく混ぜる。1,000マイクロリットルのピペットを使用して、混合物を非常にゆっくりと、そして2ミリリットルの冷たいPBSで穏やかに重ねます。混合物を遠心分離し、3つの層を探す。1,000マイクロリットルのピペットを使用して最上層2本を完全に吸引し、チューブを最大5ミリリットルのコールドローディングバッファーで満たします。チューブを3回静かに反転させます。次に、遠心分離および上清の吸引後、細胞ペレットを90マイクロリットルのローディングバッファーで再懸濁し、10マイクロリットルのCD11bビーズを加える。よく混ぜ、摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルのローディングバッファーを加え、1,000マイクロリットルのピペットで液体を上下に穏やかにピペッティングして細胞を洗浄します。細胞を摂氏4度で10分間、300倍gで遠心分離し、上清を完全に吸引して未結合ビーズを除去した。細胞を500マイクロリットルのローディングバッファーに再懸濁し、MSカラムとその分離器を磁場中に正の選択のために置きます。カラムを 500 マイクロリットルのローディングバッファーですすぎ、細胞を保護し、メーカーのプロトコルに基づく磁気選別効率を確保します。細胞懸濁液をMSカラムに塗布し、非標識細胞を含むフロースルーを破棄する。500マイクロリットルのローディングバッファーを加えてカラムを洗浄し、分離器から取り出します。カラムを 15 ミリリットルの遠沈管に置き、1 ミリリットルのローディングバッファーをカラムに加えます。最後に、プランジャーをカラムの底部に押し込んで、磁気標識された細胞を洗い流します。磁気活性化細胞選別の前後の成体マウスの脱髄病変から単離されたミクログリアのフローサイトメトリー分析において使用されるゲーティング戦略の概略図がここに示されている。グラフィカル画像は、細胞を選択するための前方散乱高さおよび側方散乱高さ、単一細胞を選択するための前方散乱面積および前方散乱高さ、ならびに骨髄系細胞およびミクログリアを選択するためのCD11b−FITCおよびCD45−APCを表す。ミクログリアの割合は、磁気活性化細胞選別後に有意に増加した。グラフィカルな画像は、磁気活性化細胞選別後の生細胞および死細胞のフローサイトメトリー分析で使用されるゲーティング戦略を表しています。ここで、7-アミノアクチノマイシンD及び側方散乱高さは、生細胞を選択するために用いられている。この手順を試みている間は、中性赤色のマーキングに基づいて実体顕微鏡下で脱髄病変を正確に微小解剖することを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、磁気活性化細胞ソーティングを使用してマウスの子犬の脳からミクログリアを含むCD11b細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。脳組織をホモジナイズして単一細胞懸濁液を得ると、抗CD11b抗体でコーティングされたマイクロビーズとインキュベートした後、磁気カラムベースの分離によりCD11b+細胞集団を精製します。...

マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

このビデオでは、マウスの仔から得られた神経細胞懸濁液から初代オリゴデンドロサイト細胞を磁気分離法で単離する方法を実演しています。この技術は、オリゴデンドロサイト抗原に特異的な抗体でコーティングされた磁気ビーズを採用しており、これらの細胞の選択的単離を可能にします。...

免疫磁気ビーズを用いたマウス初代オリゴデンドロサイトの単離

このビデオは、磁気細胞ソーティングを使用してマウス脳の脱髄病変からミクログリア細胞を抽出するためのプロトコルを示しています。このプロトコルは、ミクログリア細胞を含む病変のある脳組織を解剖し、特定の酵素で組織を処理して単一細胞懸濁液を取得し、ミクログリア受容体特異的磁気ビーズを利用してミクログリア細胞を単離することを含みます。...

磁気活性化細胞選別を用いたマウス脳脱髄病変からのミクログリアの単離

ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。...

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ...

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。...

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

私たちは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して、マウスの視床下部(または同等の小さな脳構造)からミクログリア細胞を比較的短時間で単離するためのプロトコルについて説明します。MACSで選別された視床下部ミクログリアは、 ex vivo 分析に使用でき、 in vitro...

磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離  

我々は、脳室周囲白質軟化症（PVL）、脳室周囲白質病変を特徴と未熟児で優勢な脳損傷のマウスモデルを確立した。全身感染症有/無低酸素/虚血は、PVLの主な原因です。リポ多糖注入なし/付き片側頸動脈結紮及び低酸素曝露がP6マウスのPVL様病変を作成します。...

脳室周囲白質軟化症のマウスモデル

学ぶ マウス脳の脱髄病変からマイクログリアを単離する方法。磁気活性化細胞選別を用いて、神経炎症と中枢神経系疾患におけるミクログリアの役割をin vivoで研究できます。この技術は時間と資源を節約し、細胞収率を向上させます。

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

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