共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉

この技術は、共培養間質細胞から分泌された因子の影響下で異なる侵襲能力を有する細胞の同定を可能にする。この技術は、共培養間質または免疫細胞からの分泌因子が細胞浸潤に及ぼす影響を評価する。それはまた、不均一な細胞混合物中に存在する侵襲性細胞亜集団の回収および分析を可能にする。

この技術は、どの腫瘍が転移につながる浸潤性細胞亜集団を保有しているかを決定することができる。浸潤性癌細胞の捕捉および分析は、治療の決定に情報を与える可能性がある。細胞培養を開始するために、約70%のコンフルエント性を有する付着細胞培養物を1倍リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。

次に、0.05%トリプシンおよびEDTA溶液を加えて細胞を持ち上げる。血清を含む細胞培養培地でトリプシン溶液を中和し、細胞懸濁液のアリコートを用いて細胞を計数する。3つの滅菌チャンバーすべてを組織培養フードに入れます。

下のチャンバーの短辺にあるノブの位置を確認し、ノブが実験者の方を向くように下のチャンバーを向けます。気泡を形成せずに、90マイクロリットルの培地中の30,000〜50,000個の細胞を下部チャンバから各ウェルに加える。細胞運動性の陽性対照として2つの下部チャンバーで5%のウシ胎児血清補充培地を使用し、陰性対照として0%血清補充培地を使用する。

ボンネットに10~15分間沈ませた後、下部チャンバーを90度回転させます。次に、下部チャンバのノブが中央チャンバの切り込みにスライドするように、中央のチャンバを上に置きます。アセンブリの長辺のそれぞれからカチッという音がするまで、チャンバーを垂直に下方に押します。

160マイクロリットルの無血清培地を中央チャンバーのすべてのウェルに加える。井戸が満たされた後、ドーム型のメニスカスが見えることを確認し、中央のチャンバに下を向いた電極で上部チャンバを配置し、中央チャンバとトップチャンバの青い点を揃えます。アセンブリの長辺のそれぞれからカチッという音が聞こえるまで、チャンバーを垂直に押し下げます。

20~50マイクロリットルの無血清培地を上部チャンバーに加える。組織培養インキュベーター内のデュアルパーパス細胞分析装置にアセンブリを取り付け、30分待ってからバックグラウンドを測定します。セルアナライザソフトウェアを開き、使用するクレードルを選択し、メッセージタブをクリックして、「接続は大丈夫です」と表示されていることを確認し、アレイがクレードルに正しく配置され、電極がセンサーと適切に整列していることを確認します。

[実験メモ] タブをクリックし、実験に関するすべての可能な情報を入力します。次に、レイアウトタブをクリックし、配列レイアウトの説明を入力します。次に、[スケジュール] タブをクリックし、[ステップ] メニューから 2 つのステップ、1 つのスイープを含むバックグラウンド ステップ、および 100 回のスイープを含むテスト ステップを追加します。

アレイがデュアルパーパス細胞分析器インキュベーターに30分間入れられたら、再生ボタンをクリックしてバックグラウンド測定を開始します。バックグラウンド測定が完了したら、アレイをクレードルから取り出し、細胞培養フードに戻します。次いで、100マイクロリットルの無血清培地中の30,000〜50,000個の細胞をトップチャンバーの各ウェルに加える。

これらは、電極が膜を通って正常に移動した後に検出するセルです。アセンブリをフード内に30分間放置してから、インピーダンス測定用のデュアルパーパスセルアナライザに取り付けます。アレイをデュアルパーパス・セル・アナライザーに戻し、「メッセージ」タブで「接続は大丈夫です」というメッセージを確認します。

再生ボタンをクリックしてインピーダンス測定を開始し、プロットタブをクリックして信号の進行状況を監視します。エンドポイントが 25 時間前に達した場合は、[実行] ドロップダウン メニューから [中止] ステップをクリックします。データをエクスポートするには、グラフを右クリックし、[リスト形式でコピー] を選択してから、データをスプレッドシートに貼り付けます。

デュアルパーパスセルアナライザーで移行速度をリアルタイムで監視し、目的の停止点を決定します。完了したら、アセンブリをデュアルパーパス細胞分析装置から取り外し、組織培養フードに入れます。適切な数の1.5ミリリットルの微量遠心チューブを準備して、目的のウェルから細胞を回収する。

アセンブリを10センチメートルの皿に入れて、チャンバーが外れたときに液体を入れます。中央のチャンバーの長辺にある柔軟なスナップ端を、カチッという音が聞こえるまで内側に押し込み、次に上部チャンバーを解体して新しい10センチメートルの皿に反転させます。13ミリメートルブレードを備えたセルリフターを使用して、同じ実験条件を保持するすべてのウェルから細胞を収集します。

ブレードを1Xリン酸緩衝生理食塩水ですすいまたは浸し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブで細胞を回収する。その後、細胞を500倍のGで5分間スピンダウンし、これらの収集された細胞を増殖させるか、単一細胞RNAシーケンシングなどのエンドポイント分析を実行します。間質細胞の存在下または非存在下での細胞の浸潤の評価は、2つの細胞株間の因子の交換のために底部チャンバーに座ったSwiss−3T3線維芽細胞J2株を照射したときにMDA−MB−231細胞浸潤が増強されたことを示した。

興味深いことに、MDA-MB-231の侵入は、3T3 J2細胞の数が2倍になったときに増加した。一方、MCFDCIS細胞の侵襲性クローンDCIS-Delta Fourの浸潤速度は、3T3 J2細胞とのクロストークによって阻害されるようであり、間質の様々な効果を測定するための3チャンバーアレイの貴重な適用を示唆している。この場合、線維芽細胞は細胞浸潤する。

ヒト臍帯静脈内皮細胞は、DCIS細胞によって分泌されるものとは異なり、MDA-MB-231細胞によって分泌される因子に応答してより侵襲的であり、これは血管形成および後の循環への播種のために内皮細胞を動員する浸潤性腫瘍の能力と一致する。患者由来異種移植細胞は、共培養ヒト骨髄免疫細胞に応答してトップチャンバーからの浸潤が増加した。興味深いことに、ヒト骨髄免疫細胞を有する底チャンバーにおける2%血清の存在は、患者由来の異種移植片浸潤に不可欠であった。

ウェルは、基底膜障壁を模倣するために細胞外マトリックスでコーティングすることができる。治療薬をウェル内の培地に添加して、浸潤に対するそれらの効果を監視することができる。