Name: 二軸の機械的特性評価と微細構造定量化のための三尖弁リーフレットの層マイクロダイセクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学ぶ三尖弁リーフレットの層マイクロダイセクションによる二軸機械的特性評価とコラーゲン定量化法。組織層の寄与を分離し、心臓弁膜の微細構造と力学的特性を詳細に解析する技術を習得できます。

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この研究は、米国心臓協会の科学者開発助成金(16SDG27760143)と長老派健康財団の支援を受けました。KMCは、オクラホマ大学(OU)の学部研究機会プログラムと名誉研究見習いプログラムによって部分的に支援されました。DWLは、米国国立科学財団大学院研究フェローシップ(GRF 2019254233)と米国心臓協会/児童心臓財団博士前フェローシップ(賞#821298)によって部分的に支援されました。このサポートのすべては感謝して認められています。

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</ol>

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

このプロトコルの重要なステップには、(i)層マイクロダイセクション、(ii)組織マウント、(iii)基準マーカーの配置、および(iv)pSFDIセットアップが含まれます。適切な層微小解剖は、本明細書に記載の方法の最も重要かつ困難な態様である。この技術を利用した調査を開始する前に、解剖は微小解剖技術と3つのテレビリーフレットすべてで長期的な練習をする必要があります。ディスセクターは、複合層試験片が十分に大きく(>3.3mm)、均一な厚さを有することを保証するべきである。組織学は、解剖が一貫して正確な層分離を有することを確認するために使用されるべきである。
組織装着の場合、組織が人工的な伸縮やしわのない平らになるように、組織を二軸テスターに取り付ける必要があります。これらの誤差により、機械データが不正確になります。複合レイヤーは、その薄い性質のためにこれらのエラーを起こしやすくなります。基準マーカーを貼付するときは、マーカーが組織の中央3分の1の領域内に配置され、互いに接着しないことが最重要事項である。マーカーの不適切な配置は、組織ストレッチの不正確な定量化をもたらす。最後に、pSFD...

テレビは心臓の右心房と右心室の間にあります。心周期全体を通して、テレビは、テレビ前部リーフレット(TVAL)、テレビ後部リーフレット(TVPL)、およびTV中隔リーフレット(TVSL)の周期的な開閉を介して一方向血流を調節する。これらの小葉は複雑で、心房(A)、海綿腫(S)、線維症(F)、心室(V)の4つの異なる解剖学的層を有し、ユニークな微細構造成分を有する。心房および心室のエラスチン線維は、機械的負荷1の後に組織をその変形していない形状に回復させるのを助ける。対照的に、線維症は、リーフレット2の耐荷重能力に寄与する波打つコラーゲン線維の緻密なネットワークを含む。主にグリコサミノグリカンからなる海綿体は、心臓弁機能3の間に小葉層間の剪断を可能にすると仮説が立てられている。3つのリーフレットタイプはすべて同じ解剖学的層を持っていますが、リーフレット固有の機械的挙動に影響を与える層の厚さと構成比にはばらつきがあります。
研究者らは、平面的な機械的特徴付け、組織形態学的評価、およびコラーゲン線維アーキテクチャの光学的特徴付けを使用して、テレビリーフレットの特性を調査した。例えば、平面二軸機械的特性評価は、組織に垂直な変位を適用し、関連する力を記録することによって生理学的負荷をエミュレートしようとする。結果として得られた力-変位(または応力-ストレッチ)観測は、3つのTVリーフレットすべてが非線形で方向特異的な機械的挙動を示し、放射状組織方向におけるより見かけ上のリーフレット特異的な応答を示すことを明らかにした4,5,6。これらのリーフレット特異的挙動は、標準的な組織学的手法を用いて観察される微細構造特性の違いに由来すると考えられている6、7。さらに、第2高調波発生イメージング6、小角光散乱8、および偏光空間周波数領域イメージング7(pSFDI)は、これらの微細構造特性を理解することを目的としており、観察された組織レベルの機械的挙動に影響を与えるコラーゲン線維配向および繊維捲縮におけるリーフレット特有の違いを示している。これらの研究は、組織の微細構造と組織レベルの挙動におけるその役割についての我々の理解を著しく進歩させた。しかし、組織力学と基礎となる微細構造を実験的に結びつける際には、まだ多くの課題が残っています。
最近、本研究室では、2つの複合層(A/SとF/V)に分離されたテレビリーフレット層の機械的特性評価を、マイクロダイセクション技術を用いて行った9.その初期の研究は、層の機械的特性の違いを強調し、層状微細構造が組織の機械的挙動にどのように寄与するかについての洞察を提供するのに役立った。この調査により、テレビのリーフレットの微細構造の理解は向上しましたが、この手法にはいくつかの制限がありました。第一に、複合層の特性は無傷の組織と直接比較されず、力学と微細構造の関係の完全な理解の欠如につながった。第2に、複合層のコラーゲン線維構造は調べなかった。第三に、TVALの層のみが、他の2つのテレビリーフレットから複合層を収集することの困難さのために調査された。本明細書に記載される方法は、これらの制限を克服し、TVリーフレットおよびそれらの複合層の完全な特徴付けを提供する全体的な特徴付けフレームワークを提供する。
この論文では、2軸の機械的および微細構造的特性評価のために、3つのTVリーフレットをそれらの複合層(A / SおよびF / V)に分離するマイクロダイセクション技術について説明します10,11,12。この反復プロトコルには、(i)インタクトリーフレットの2軸機械的試験およびpSFDI特性評価、(ii)複合TV層を確実に得るための新規で再現可能な微小解剖技術、および(iii)複合TV層の2軸機械的試験およびpSFDI特性評価が含まれる。組織を、機械的試験のために様々な力比を有する二軸引張荷重に曝した。次いで、pSFDIを用いて、種々の負荷構成におけるコラーゲン線維配向および配向性を決定した。pSFDIは、ネイティブのコラーゲン線維アーキテクチャを維持し、負荷依存の解析を可能にし、第2高調波発生イメージングや小角光散乱などのコラーゲン線維アーキテクチャ解析のために組織を固定またはクリアする典型的な必要性を回避します。最後に、組織微細構造を視覚化するために標準的な組織学技術を用いて組織を調製した。この反復的で全体的なフレームワークにより、テレビリーフレットの機械的および微細構造的特性を複合層に直接比較することができます。

<table><tbody><tr><td>10% ホルマリン溶液、中性緩衝シ</td><td>グマ Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>アルコノックス洗剤</td><td>アルコノックス</td><td></td><td>洗浄剤</td></tr><tr><td>BioTester - 二軸テスター</td><td>CellScale 生体材料試験</td><td></td><td>1.5 N ロードセル容量</td></tr><tr><td>カッティングマット</td><td>Dahle</td><td>B0027RS8DU</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>先端の細いツール</td><td>HTI INSTRUMENTS</td><td>NSPLS-12</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - 湾曲した</td><td>科学実験器具</td><td>16122</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - 厚い</td><td>科学実験器具</td><td>161001078</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - 薄い</td><td>科学実験器具</td><td>16127</td><td></td></tr><tr><td>LabJoy</td><td>CellScale 生体材料検査</td><td>バージョン 10.66</td><td></td></tr><tr><td>レーザー変位センサー</td><td>キーエンス</td><td>IL-030</td><td></td></tr><tr><td>液体 シアノアクリレート 接着剤</td><td>ロックタイト</td><td>2436365</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>バージョン 2020a</td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>HTI Instruments</td><td>CAS55C</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>ベルマクス</td><td>360758081051Y4</td><td></td></tr><tr><td>偏光空間周波数領域 イメージングデバイス</td><td>N/A</td><td></td><td>デジタル光プロジェクター、直線偏光板、回転偏光子マウント、電荷結合素子カメラを使用して自社製. 詳細は doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028(PMCID:PMC8101699)を参照。</td></tr><tr><td>メス</td><td>THINKPRICE</td><td>TP-SCALPEL-3010</td><td></td></tr><tr><td>シングルエッジ工業用カミソリ刃 (外科用炭素鋼)</td><td>VWR International</td><td>H3515541105024</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Pen</td><td>LabAider</td><td>LAB-Skin-6</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins</td><td>事業 ソース</td><td>BSN32351</td><td></td></tr><tr><td>ワックスボード</td><td>N/A</td><td></td><td>モデリングワックスとベーキングトレイを使用して自社製</td></tr><tr><td>重量を量るボート</td><td>ピュアポンタ</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr></tbody></table>

二軸の機械的特性評価と微細構造定量化のための三尖弁リーフレットの層マイクロダイセクション

Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification

三尖弁(TV)は、右心房から右心室への無酸素血液の一方向の流れを調節する。テレビは3つのリーフレットで構成されており、それぞれに独自の機械的挙動があります。3つのテレビリーフレット間のこれらのバリエーションは、心房(A)、海綿骨(S)、線維症(F)、および心室(V)である4つの解剖学的層を調べることによってさらに理解することができる。これらの層は3つのテレビリーフレットすべてに存在しますが、それぞれの機械的挙動にさらに影響を与える厚さと微細構造成分に違いがあります。 
このプロトコルには、層固有の違いを解明するための4つのステップが含まれています:(i)無傷のテレビリーフレットの機械的およびコラーゲンファイバーアーキテクチャ挙動を特徴付ける、(ii)テレビリーフレットの複合層(A / SおよびF / V)を分離する、(iii)複合層に対して同じ特性評価を実行する、(iv) 事後処理 を実行する 組織学評価。この実験フレームワークは、無傷のテレビ組織をその複合層のそれぞれに直接比較することを独自に可能にする。その結果、テレビリーフレットの微細構造および生体力学的機能に関する詳細な情報をこのプロトコルで収集することができる。このような情報は、テレビ病の臨床的治療のためのガイダンスを提供しようとするテレビ計算モデルを開発するために潜在的に使用することができる。

マイクロディスセクションは、(商用の)二軸試験装置に取り付けることができる比較的均一な厚さのA / SおよびF / V試料を得る。無傷の小葉と2つの解剖された層の組織学分析は、組織が海綿状体と線維症の間の境界に沿って正しく分離されたかどうかを検証します(図7)。さらに、組織学顕微鏡写真を使用して、ImageJソフトウェアを使用して組織層の厚さと構成質量分率を決定することができます。解剖の失敗は、2軸テスターに取り付けるには小さすぎるA/Sサンプルが生成されたときに発生します。これは、剥離中にA/Sが裂けたとき、または厚い弦のためにF / V層に穴が開いたときに最も頻繁に発生します。
変位制御された機械的試験と後処理は、組織の非線形機械的挙動を記述する応力-ひずみデータを生成します(図8)。サンプルは一般に異方性であり、円周組織方向は径方向組織方向よりも硬い機械的応答を有する(表 1)。これらの低引...

このプロトコルは、二軸機械的特性評価、偏光空間周波数領域イメージングベースのコラーゲン定量化、および三尖弁リーフレットの微小解剖を記述している。提供されたメソッドは、リーフレット層が全体的なリーフレットの動作にどのように寄与するかを解明します。

The tricuspid valve (TV) regulates the unidirectional flow of unoxygenated blood from the right atrium to the right ventricle. The TV consists of three ...

この方法は、組織全体の挙動に対する組織層の寄与を単離することができ、組織の微細構造に関する新しい洞察を提供する。当社のマイクロディスセクションおよび試験フレームワークにより、心臓弁リーフレットの機械的および微細構造的特性を独自の複合層に直接比較することができます。マイクロダイセクションは習得するのが難しい場合があるため、研究を開始する前にできるだけ多くを練習することを強くお勧めします。まず、必要な材料、ワックスボード、DI水、ピペット、メス、マイクロハサミ、薄い鉗子、湾曲した鉗子、太い鉗子、ピンを集めます。2軸テスターから組織を取り外し、レーザー変位センサーを使用してその厚さを測定します。ティッシュをワックスボードの上に置きます。組織の心室側で大きな和音の挿入を調べます。参考までに写真を撮ってください。心房を上に向けてワックスボード上に組織を平らに広げます。ティッシュをボードに貼り付けるには、ティッシュから角度をつけて各コーナーに1本のピンを置き、ティッシュをわずかに引き締めます。ピンがティッシュを取り付けるときにタインによって作られた穴の外側にあり、ティッシュが正方形であり、層のマイクロダイセクション中にシフトしていないことを確認します。必要に応じて、解剖中に組織の側面に沿ってピンを配置し、組織をより伸ばす。ガラスビーズの基準マーカーを取り外します。DI水をピペットで組織の表面に置き、組織を気泡状に完全に覆うようにする。最初のコーナーを作成するには、ピン留めされた標本のコーナーを選択し、壊れやすい領域に大きなコードが挿入されないようにします。次に、機械的試験のために取り付け穴に沿ってメスを組織表面に軽くドラッグして、A / S層を切断する。カットのエッジが引き裂かれ始め、その下の F/V レイヤーが現れます。鈍くて細い鉗子で、切り口に沿ってしっかりとこすって、その端をさらに分離します。A/S レイヤーのカットが引き裂かれない場合は、メスで同じカットをもう一度軽くなぞります。2 番目のカットを最初のカットに垂直にします。2つの切り口が接続されていない場合は、2つの切り口を隔てる組織の小さな領域の下に薄いピンセットを通します。その後、はさみを慎重に使用して組織を切断します。組織がF / V層から離れるまで、薄い鉗子でコーナーの切り傷に沿ってこすります。小さな組織が分離したらすぐに、大きなピンセットでつかみ、静かに引っ張って複合層をさらに分離します。A/Sコンポジット層の望ましくない破れや破れを防ぐために、大きなピンセットで組織をつかみながら組織を剥がし続け、コーナーのために作られた2つのカットの端に達するまで縫い目をこすります。最初のコーナーに分離に大きな問題がある場合は、別のコーナーを出発点として試してください。次に、第2のコーナーを作成するには、メスの先端を各カットの底に配置し、組織表面に沿って軽くドラッグして、カットエクステンションが元のカットに接続し、タインまたは縫合穴に追従し続けるようにして、最初のコーナー用に作られた2つのカットを伸ばします。カットを伸ばし続け、上部のコンポジットA / Sレイヤーを剥がしながら、片側が終わるまで縫い目をこすります。組織が1つのカットに沿って完全に分離されることに注意してください。次に、完全に剥離した側の端部に垂直な第2の角を作成する。大きな和音の挿入を避けながら、残りのカットを延長します。A/S分離領域から和音の挿入を除外するのは、この除外によって実験的な特性評価に十分な大きさのA/S標本が得られる場合のみにしてください。最初のコーナーで採用された擦りと引っ張りのテクニックを使用して、A / S層とF / V層を分離し続けます。裂け目や穴が開いた場合は、直ちに組織を分離するのをやめてください。ピンセットが引っかからないようにするには、はさみを穴の開いたところに置き、組織を中心から離します。欠陥が分離の継ぎ目に沿って形成される場合は、別のエッジに沿って組織を分離し始めます。組織を分離するときに現れ、さらなる組織分離を防ぐことができる層間接続を探します。これらは細いが強い糸であり、はさみを使って慎重に切断しなければならないことに注意してください。A/S レイヤーに穴を開けたり、F/V レイヤーに下向きにカットしたりしないでください。A/S層の可能な限り大きなサンプルが分離されるまで、このプロセスを続けます。手術用ペンを使用してサンプルの向きをマークします。最後に、残りの組織端の分離の継ぎ目に沿ってはさみで切断する。分離した A/S コンポジットレイヤーをカッティングマットの上に平らに置きます。必要に応じて、メスを使用して組織の縁をまっすぐにし、2軸の機械的試験に適した正方形の組織形状を作成します。A/S層をDI水に入れ、テストの準備が整うまで置きます。ワックスボード上に残っているF/V層の向きをマークします。A/S レイヤーが削除された領域から、できるだけ大きな正方形を切り取ります。次に、DI水に入れます。無傷の小葉と2つの解剖層の組織学的分析により、組織が海綿状体と線維症の境界に沿って正しく分離されているかどうかが確認されました。組織学顕微鏡写真を、ImageJソフトウェアを用いて組織層厚および構成質量分率を決定するために使用した。変位制御された機械的試験および後処理は、組織の非線形機械的挙動を記述する三尖弁前小葉、三尖弁後小葉、および三尖弁中隔小葉の膜張力対伸張データを生成した。偏光空間周波数領域イメージングデータは、コラーゲン線維配向および光学異方性の程度のカラーマップをもたらした。具体的には、これらのカラーマップは、組織標本全体にわたるコラーゲン線維構造の包括的な理解を提供しました。複合層は、固定された組織から分離されると収縮することに注意することが重要です。可能な限り大きなサンプルを収集して、その後の試験に十分な組織があることを確認します。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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このプロトコルは、積極的に収縮している心臓の柱状の筋柱からサルコメア、カルシウム、および巨視的幾何学的データの集合...

心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

急速な心筋および心臓の弛緩は、正常な生理機能に不可欠です。機械的緩和機構は、ひずみ速度に依存することが現在知られている。このプロトコルは、リラクゼーションの機械的制御をさらに研究するための実験の取得と分析の概要を提供します。...

無傷の心臓小柱を用いたリラクゼーションの機械的制御

このプロトコルはマウスの肺静脈の顕微鏡検査導かれた隔離そしてimmunofluorescenceの汚損を示す。左心房、肺静脈、および対応する肺を含む組織サンプルを調製し、心臓トロポニンTおよびコネキシン43について染色します。...

マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

合成声帯モデルを製造するための方法論が説明されています。モデルは等身大であり、人間の声帯の多層構造を模倣する。結果は、モデルは肺の圧力に匹敵する圧力で自己発振し、人間の声帯に似ている流動誘起振動応答を示すことを示しています。...

合成、マルチレイヤ、自己発振声帯モデルの作製

学ぶ三尖弁リーフレットの層マイクロダイセクションによる二軸機械的特性評価とコラーゲン定量化法。組織層の寄与を分離し、心臓弁膜の微細構造と力学的特性を詳細に解析する技術を習得できます。

二軸の機械的特性評価と微細構造定量化のための三尖弁リーフレットの層マイクロダイセクション

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