二軸の機械的特性評価と微細構造定量化のための三尖弁リーフレットの層マイクロダイセクション
February 10th, 2022
このプロトコルは、二軸機械的特性評価、偏光空間周波数領域イメージングベースのコラーゲン定量化、および三尖弁リーフレットの微小解剖を記述している。提供されたメソッドは、リーフレット層が全体的なリーフレットの動作にどのように寄与するかを解明します。
この方法は、組織全体の挙動に対する組織層の寄与を単離することができ、組織の微細構造に関する新しい洞察を提供する。当社のマイクロディスセクションおよび試験フレームワークにより、心臓弁リーフレットの機械的および微細構造的特性を独自の複合層に直接比較することができます。マイクロダイセクションは習得するのが難しい場合があるため、研究を開始する前にできるだけ多くを練習することを強くお勧めします。
まず、必要な材料、ワックスボード、DI水、ピペット、メス、マイクロハサミ、薄い鉗子、湾曲した鉗子、太い鉗子、ピンを集めます。2軸テスターから組織を取り外し、レーザー変位センサーを使用してその厚さを測定します。ティッシュをワックスボードの上に置きます。
組織の心室側で大きな和音の挿入を調べます。参考までに写真を撮ってください。心房を上に向けてワックスボード上に組織を平らに広げます。
ティッシュをボードに貼り付けるには、ティッシュから角度をつけて各コーナーに1本のピンを置き、ティッシュをわずかに引き締めます。ピンがティッシュを取り付けるときにタインによって作られた穴の外側にあり、ティッシュが正方形であり、層のマイクロダイセクション中にシフトしていないことを確認します。必要に応じて、解剖中に組織の側面に沿ってピンを配置し、組織をより伸ばす。
ガラスビーズの基準マーカーを取り外します。DI水をピペットで組織の表面に置き、組織を気泡状に完全に覆うようにする。最初のコーナーを作成するには、ピン留めされた標本のコーナーを選択し、壊れやすい領域に大きなコードが挿入されないようにします。
次に、機械的試験のために取り付け穴に沿ってメスを組織表面に軽くドラッグして、A / S層を切断する。カットのエッジが引き裂かれ始め、その下の F/V レイヤーが現れます。鈍くて細い鉗子で、切り口に沿ってしっかりとこすって、その端をさらに分離します。
A/S レイヤーのカットが引き裂かれない場合は、メスで同じカットをもう一度軽くなぞります。2 番目のカットを最初のカットに垂直にします。2つの切り口が接続されていない場合は、2つの切り口を隔てる組織の小さな領域の下に薄いピンセットを通します。
その後、はさみを慎重に使用して組織を切断します。組織がF / V層から離れるまで、薄い鉗子でコーナーの切り傷に沿ってこすります。小さな組織が分離したらすぐに、大きなピンセットでつかみ、静かに引っ張って複合層をさらに分離します。
A/Sコンポジット層の望ましくない破れや破れを防ぐために、大きなピンセットで組織をつかみながら組織を剥がし続け、コーナーのために作られた2つのカットの端に達するまで縫い目をこすります。最初のコーナーに分離に大きな問題がある場合は、別のコーナーを出発点として試してください。次に、第2のコーナーを作成するには、メスの先端を各カットの底に配置し、組織表面に沿って軽くドラッグして、カットエクステンションが元のカットに接続し、タインまたは縫合穴に追従し続けるようにして、最初のコーナー用に作られた2つのカットを伸ばします。
カットを伸ばし続け、上部のコンポジットA / Sレイヤーを剥がしながら、片側が終わるまで縫い目をこすります。組織が1つのカットに沿って完全に分離されることに注意してください。次に、完全に剥離した側の端部に垂直な第2の角を作成する。
大きな和音の挿入を避けながら、残りのカットを延長します。A/S分離領域から和音の挿入を除外するのは、この除外によって実験的な特性評価に十分な大きさのA/S標本が得られる場合のみにしてください。最初のコーナーで採用された擦りと引っ張りのテクニックを使用して、A / S層とF / V層を分離し続けます。
裂け目や穴が開いた場合は、直ちに組織を分離するのをやめてください。ピンセットが引っかからないようにするには、はさみを穴の開いたところに置き、組織を中心から離します。欠陥が分離の継ぎ目に沿って形成される場合は、別のエッジに沿って組織を分離し始めます。
組織を分離するときに現れ、さらなる組織分離を防ぐことができる層間接続を探します。これらは細いが強い糸であり、はさみを使って慎重に切断しなければならないことに注意してください。A/S レイヤーに穴を開けたり、F/V レイヤーに下向きにカットしたりしないでください。
A/S層の可能な限り大きなサンプルが分離されるまで、このプロセスを続けます。手術用ペンを使用してサンプルの向きをマークします。最後に、残りの組織端の分離の継ぎ目に沿ってはさみで切断する。
分離した A/S コンポジットレイヤーをカッティングマットの上に平らに置きます。必要に応じて、メスを使用して組織の縁をまっすぐにし、2軸の機械的試験に適した正方形の組織形状を作成します。A/S層をDI水に入れ、テストの準備が整うまで置きます。
ワックスボード上に残っているF/V層の向きをマークします。A/S レイヤーが削除された領域から、できるだけ大きな正方形を切り取ります。次に、DI水に入れます。
無傷の小葉と2つの解剖層の組織学的分析により、組織が海綿状体と線維症の境界に沿って正しく分離されているかどうかが確認されました。組織学顕微鏡写真を、ImageJソフトウェアを用いて組織層厚および構成質量分率を決定するために使用した。変位制御された機械的試験および後処理は、組織の非線形機械的挙動を記述する三尖弁前小葉、三尖弁後小葉、および三尖弁中隔小葉の膜張力対伸張データを生成した。
偏光空間周波数領域イメージングデータは、コラーゲン線維配向および光学異方性の程度のカラーマップをもたらした。具体的には、これらのカラーマップは、組織標本全体にわたるコラーゲン線維構造の包括的な理解を提供しました。複合層は、固定された組織から分離されると収縮することに注意することが重要です。
可能な限り大きなサンプルを収集して、その後の試験に十分な組織があることを確認します。
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概要
このプロトコルは、三尖弁弁膜の二軸機械的特性評価とコラーゲン定量化の方法を説明しています。これは弁膜層が全体的な弁膜の挙動にどのように寄与するかについての洞察を提供します。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 心血管生物学
- 組織力学
背景
- 心臓弁の力学を理解することは、心血管の健康にとって重要です。
- ミクロ切開技術は組織層の寄与を明らかにします。
- コラーゲン定量化は組織特性の評価に役立ちます。
- 機械的テストは組織の挙動についての洞察を提供します。
研究目的
- 組織層全体の挙動への寄与を分離すること。
- 心臓弁弁膜の機械的および微細構造特性を比較すること。
- 心臓弁の微細構造の理解を深めること。
使用された方法
- 三尖弁弁膜の二軸機械テスト。
- コラーゲン定量化のための偏光空間周波数領域イメージング。
- 詳細な分析のための組織層のミクロ切開。
- 解剖に使用する特殊な道具（メスや鉗子など）。
主要な結果
- 異なる組織層の寄与を成功裏に測定しました。
- 機械的特性は層によって大きく異なります。
- コラーゲン定量化は組織構造についての洞察を提供しました。
- 方法論により、複合層の直接比較が可能になりました。
結論
- この研究は心臓弁の力学の理解を深めます。
- ミクロ切開技術は熟練するために練習が必要です。
- 得られた洞察は将来の心血管研究に情報を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Layer-specific mechanical and microstructural quantification of tricuspid valve leaflets addresses a critical gap in understanding tissue-level determinants of valve function and failure. This protocol enables direct comparison of intact and dissected leaflet layers, supporting predictive modeling and mechanistic de-risking in early cardiovascular device and therapeutic development. The approach enhances portfolio decision-making by providing high-resolution data for computational model validation and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tissue-layer contributions to overall valve mechanics for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying layer-specific biomechanical and microstructural properties.
- Provides data to refine computational models, increasing predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue samples for reproducible mechanical and imaging assays.
- Standardizes measurement of membrane tension and collagen architecture across tissue layers.
- Enables quantitative outputs for downstream screening of biomaterials or device-tissue interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microstructural and biomechanical data with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of valve repair or replacement strategies by clarifying tissue mechanics.
- Provides a framework for biomarker discovery linked to tissue integrity and function.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-fidelity tissue data for model development, assay validation, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of specific leaflet layers in valve function and pathology.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical and microstructural readouts for assay development.
- Analytics: Provides membrane tension-stretch curves and collagen orientation maps for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by aligning tissue mechanics with disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for tissue characterization across cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based research.
- Operational Value: Standardizes tissue dissection and testing for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage risk in device or therapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated tissue mechanics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and tissue handling for reproducible results.
- Needs access to biaxial mechanical testers, imaging systems, and histological analysis tools.
- Demands cross-team standardization of dissection and measurement protocols.
- May require adaptation for different valve types or species-specific tissues.
- Sample size and tissue integrity can limit downstream testing and analysis.
