Name: CD226の発現を検出するためのマウス鼻粘膜からのグループ2自然リンパ系細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶマウス鼻粘膜からのILC2単離法とCD226発現検出によるフローサイトメトリー解析。アレルギー性鼻炎モデルにおける自然リンパ系細胞の役割を解明するための免疫学研究手法です。

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R.Z.は、中国国家自然科学財団(第81871258号)と第4軍事医科大学(No.2020rcfczr)から提供された資金によって支援されました。Y.Z.は、陝西省自然科学基礎研究プログラム(No. 2021JM-081)の支援を受けました。

すべての実験は、実験動物の世話と使用のガイドラインに従って実施されました。すべての手順とプロトコルは、第4軍事医科大学の科学研究倫理委員会(第20211008号)によって承認されました。
1. マウスARモデル確立
<ol><li>特定の病原体のない条件下で8〜12週齢のオスとメスの野生型(WT)C57BL / 6マウスを飼育し、標準的な実験用飼料と水を提供します。</li>
	<li>水酸化アルミニウム2 mgを含む滅菌PBS0.2 mLに50 μgのオボアルブミン(OVA)をクリーンベンチで乳化し、無菌性を維持します。0、7、および14日目に、雌または雄のマウスにそれぞれ50μgの乳化OVAを腹腔内注射します。</li>
	<li>21、22、23、24、および25日目に、吸入麻酔下で30 μLの滅菌PBS(鼻孔あたり15 μL)に溶解した50 μgのOVAをマウスに鼻腔内投与します(酸素流量または0.5 L / minの2〜3%イソフルラン)。</li>
	<li>最後のチャレンジ(26日目)の24時間後にマウスを安楽死させる。</li>
</ol>2.鼻粘膜からの単核細胞(MNC)の分離
<ol><li>深い麻酔下で頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。マウスの頭を75%エタノールに5分間浸し、エタノールが外鼻孔に入らないようにします。腹部を手術台の下に置きます。</li>
	<li>前歯を切り落とします。頭の正中線を切開し、ハサミを使って皮膚を切り開きます。</li>
	<li>下顎を取り除き、口蓋の端に沿って鼻全体を切り取り、5mLの氷冷PBSを含む60mmのペトリ皿に組織を置きます。はさみと鉗子を使用して、骨に付着している肉と筋肉を取り除きます。</li>
	<li>マウスの鼻を、5 mLの氷冷PBSを含む新しい60 mmペトリ皿に移します。5 mLの氷冷PBSで骨を2回洗います。</li>
	<li>鼻を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。</li>
	<li>鼻を十分に粉砕し、2 mLの予温した消化バッファー(1 mg / mLのコラゲナーゼIVと10 U / mLのDNase Iを添加したRPMI 1640培地)を含む15 mLチューブに移します。</li>
	<li>蓋を締め、チューブを37°Cのオービタルシェーカーに垂直に置き、120〜150rpmで40分間連続攪拌します。 注:消化バッファーを37°Cに予熱して、最高の酵素活性を達成します。</li>
	<li>10%ウシ胎児血清(FBS)を含む氷冷RPMI 1640培地5 mLを加えて、消化プロセスを停止します。</li>
	<li>70 μmのセルストレーナーでろ過し、固体片を除去します。</li>
	<li>500 x g で5分間遠心分離し、上清を静かに捨てます。</li>
	<li>ペレットを氷冷RPMI 1640培地に再懸濁し、500 x g で5分間遠心分離します。上清をそっと捨てます。</li>
	<li>細胞ペレットを4 mLの40%密度勾配培地(160 μLの10x PBS + 1.44 mLの密度勾配培地ストック溶液+ 2.4 mLのRPMI 1640培地)に再懸濁します。</li>
	<li>パスツールピペットをチューブの底にそっと挿入し、2.5 mLの80%密度グラジエント培地(200 μLの10x PBS + 1.8 mLの密度グラジエント培地ストック溶液+ 0.5 mLのRPMI 1640培地)をゆっくりと加えます。</li>
	<li>遠心分離機の加速と減速の速度を3速より低く設定し、室温(RT)で400 x g で15分間遠心分離機を15分間行います。</li>
	<li>潜在的な汚染を避けるために、界面でセルを排出する前に不純物の最上層を除去してください。ピペットを使用して、40%/80%密度勾配培地界面の単核細胞(MNC)層を、2 mLの氷冷PBSを含む15 mLチューブに慎重に排出します。氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。</li>
</ol>3. FCM分析のための表面染色
<ol><li>細胞を回収し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞ペレットを染色バッファー(2%FBSおよび0.1%NaN3を添加したPBS)に再懸濁し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。 注意: 染色バッファーを調製するときは注意してください。NaN3は非常に有毒であり、飲み込んだり、吸入したり、皮膚に接触したりすると臓器に損傷を与える可能性があります。また、環境への放出は避けてください。</li>
	<li>細胞をチューブあたり80 μLのブロッキング溶液(染色バッファーで希釈した抗CD16/32抗体(1:100))に再懸濁します。4°Cの暗所で30分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄せずに、表面染色抗体カクテルの適切な希釈液を20 μL加えます(表1)。</li>
	<li>抗体カクテルをサンプルに加える直前に、固定可能な生存率色素520(FVD)を1 μL(試験あたり)加えます。暗所で4°Cで30分間インキュベートします。一致するアイソタイプ抗体と蛍光マイナス1(FMO)をネガティブコントロールとして設定します。</li>
	<li>500 μLの染色バッファーで細胞を500 μLの染色バッファーで洗浄し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞ペレットを200 μLの染色バッファーに再懸濁します。染色した細胞に50 μLのボルテックス絶対計数ビーズを加え、撹拌します。フローサイトメトリー(FCM)分析にかけます。 注:FCMデータは、スペクトルセルアナライザーを使用して取得し、フローサイトメトリー(FCM)分析ソフトウェアで分析しました。</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ILC2は、ますます多くの研究によって実証されているように、2型炎症および炎症性疾患と密接に関連しています。マウスモデルと人間の観察の両方が、上気道におけるその機能のより良い理解に貢献します。喘息の病態生理学では、ILC2は主に上皮細胞によって産生される胸腺間質リンパオポエチン、IL-25、およびIL-33を介して活性化されます。次に、Th2細胞をミラーリングすると、ILC2はIL-4、IL-5、およびIL-13を産生して2型炎症を悪化させます32。さらに、ILC2の異なるサブセットもIL-10およびIL-17を産生する33,34,35。ARは、2型細胞によって引き起こされる気道アレルギー性炎症の一種でもあります。AR病態生理学におけるILC2の関与が最近実証された14。しかし、ARの下でのILC2の潜在的な調節メカニズムはほとんど知られていない。
...

グループ2の自然リンパ系細胞(ILC2)は、マウスの腹腔組織で最初に発見され、その後、血液および肺、皮膚、鼻腔などの他の末梢組織に存在することが実証されました1,2,3。組織常在細胞として、ILC2は主に局所的に維持および増殖し、多数の2型サイトカインを産生し、2型免疫を誘導することにより、外因性の有害な刺激に応答する最初のガードとして機能します4,5,6。ILC2は、感染した組織に向かって輸送することによってもその効果を発揮することができる7,8。
Tヘルパー2(Th2)細胞と同様に、ILC2の複雑な調節ネットワークは、気道アレルギー疾患を含むさまざまな2型炎症性疾患の進行への重要な関与を保証します8,9。喘息では、上皮細胞由来のアラームンがILC2を活性化し、インターロイキン(IL)-4、IL-5、およびIL-13の分泌を通じて肺の炎症をさらに促進します10。臨床研究では、重度の喘息患者の喀痰と血液中のILC2レベルが有意に上昇していることも示されており、ILC2と喘息の重症度および喘息進行の予測因子としてのそれらの機能との関連が示唆されています11。
アレルギー性鼻炎(AR)は、毎年何百万人もの人々が罹患する一般的な慢性炎症性疾患であり、この病気の効果的な治療法は限られています12,13。ILC2は、感作期であれ、症状発生および炎症期14であれ、ARの病態生理学において重要な役割を果たします。AR患者では、末梢血中のILC2レベルが局所的および全身的に上昇することが報告されています15。しかし、ARの病態生理学と進行に対するILC2の特定の影響と根底にあるメカニズムは、依然としてさらなる調査が必要です。
共刺激分子として機能する膜貫通糖タンパク質であるCD226は、主にナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、およびその他の炎症性単球で発現します16,17。CD226とそのリガンド(CD155および/またはCD112)または競合物質(TIGIT)の相互作用により、様々な免疫細胞の生物学的機能に関与することができる18。抗原提示細胞上のリガンドが細胞傷害性リンパ球(CTL)上のCD226に結合すると、両方の細胞の活性化が同時に促進され、CTLの活性化は、CD22619,20の競合者であるTIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体)によってさらに抑制され得る。ヒトのex vivo研究では、T細胞上のCD226とCD155が、Thサブセット21を差動的に調節することにより、Th1 / Th17とTh2のバランスを調節することが明らかになりました。CD226は同様に血小板接着およびNK腫瘍殺傷活性を媒介することができる22,23。一方、CD226は、様々な感染症、自己免疫疾患、および腫瘍の病因においてよく研究されている18、24、25。現在、CD226は免疫療法の新しい明るいスポットになっています。研究によると、細胞外小胞はNK細胞上のCD226発現を逆転させて細胞傷害活性を回復させ、肺がんの進行に介入することができます26。最近の研究では、単一細胞RNAシーケンシング27によって高いCD226発現を特徴とする胎児腸グループ3ILCのサブクラスターが明らかになり、CD226が自然リンパ系細胞媒介免疫において役割を果たす可能性があることが示されました。
気道炎症におけるILC2に関する私たちの知識は、主に喘息に関する研究に基づいています。しかし、鼻粘膜免疫におけるそれらの機能についてはほとんど知られていない。したがって、鼻粘膜からILC2を分離および同定するためのプロトコルが確立されました。この研究は、鼻組織のILC2に対するCD226の発現と、健康なマウスとARマウスの間のその変動に焦点を当てています。これは、局所免疫におけるILC2を介した調節の根底にあるメカニズムへの新しい洞察を提供し、AR治療のための新しいアプローチを開発するための基礎として役立つ可能性があります。

<table><tbody><tr><td>水酸化アルミニウム</td><td>Meilun biological Technology</td><td>21645-51-2</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td>抗体コクテール</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117306</td><td>抗体コクテール</td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>クローンに使用:93;希釈 1:100</td></tr><tr><td>CD226</td><td>BioLegend</td><td>128812</td><td>抗体コクテールに使用</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BioLegend</td><td>100306</td><td>抗体コクテールに使用</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>抗体コクテールに使用</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>eBioscience</td><td>11-0452-82</td><td>抗体コクテールに使用</td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553014</td><td>抗体に使用コクテール</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV</td><td>DIYIBio</td><td>DY40128</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolute counting beads</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td>absolute counting beads</td></tr><tr><td>Dnase <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63525/63525eq01v2.jpg" style="margin: auto;"></td><td>Beyotime</td><td>D7076</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC)</td><td>eBioscience</td><td>65-0867-14</td><td>FVD</td></tr><tr><td>HBSS, Calcium, Magnesium</td><td>Servicebio</td><td>G4204-500</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1</td><td>eBioscience</td><td>17-5893-81</td><td>抗体コクテール</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>SIGMA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpressソフトウェア</td><td>AgilentTechnologies</td><td>バージョン1.5.0</td><td>フローサイトメトリー(FCM)解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>9006-59-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS、1x</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS、10x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Yeasen</td><td>40501ES60密度</td><td>グラジエント培地</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRV</td><td></td></tr><tr><td>スペクトル細胞分析装置</td><td>SONY</td><td>SA3800</td><td></td></tr></tbody></table>

cd226の発現を検出するためのマウス鼻粘膜からのグループ2自然リンパ系細胞の単離

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

ILC2は、グループ2の自然リンパ系細胞(ILC2)に関する豊富な研究が長年にわたって発表されており、抗蠕虫免疫、組織修復、熱発生、喘息やアレルギー性鼻炎(AR)などの自己免疫疾患など、さまざまな病理学的プロセスの調節に関与していることが広く知られています。ILC2は、皮膚、腸、肺、鼻腔などの末梢組織に恒久的に存在します。しかしながら、鼻粘膜免疫におけるそれらの正確な機能についての情報は限られている。CD226は活性化共刺激分子であり、主にナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、および炎症性単球に発現します。しかし、ILC2がCD226を発現するのか、それともILC2s関連疾患の病因に役割を果たすのかは不明である。ここでは、鼻粘膜からILC2を単離・同定する方法を確立し、健常マウスやARマウスから得られたILC2のCD226発現を検出しました。ここでは、マウス鼻粘膜からのILC2の単離と同定のためのこのプロトコルについて説明し、鼻粘膜疾患における免疫疾患の内部病理学的メカニズムの探索に役立ちます。

ARにおけるILC2の役割を調べるために、OVA誘発マウスモデルが開発されました。ARマウスモデルの構築は、以前の研究に基づいており、わずかな変更を加えました28,29,30,31。最後の鼻チャレンジ後のくしゃみと鼻掻きの頻度を測定するために、10分間のビデオをキャプチャしました。OVA誘発ARマウスのアレルギー症状を図1に提示した。ARマウスの鼻こすりとくしゃみの頻度は、対照群よりも有意に高かった。
次に、マウス鼻粘膜から多国籍細胞を分離し、FCM分析を用いてその特性評価を行う手順について説明しました。約2〜3 x 106リンパ球を各マウス鼻から得た。死細胞はFVD染色により除外した。単離された細胞間のILC2のゲーティング戦略は、Lin(CD1...

2型炎症に関与するグループ2の自然リンパ系細胞(ILC2)は、主に蠕虫感染、アレルギー疾患、代謝恒常性、および組織修復に応答します。この研究では、マウス鼻粘膜からILC2を分離し、CD226の発現を検出する手順が実証されています。

CD226の発現を検出するためのマウス鼻粘膜からのグループ2自然リンパ系細胞の単離

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

このプロトコルは、マウス鼻粘膜からグループ2の自然リンパ系細胞を単離および同定し、鼻疾患におけるILC2の特定の効果および根底にあるメカニズムを探求するために確立される。この技術により、研究者は局所中皮からILC 2を単離し、フローサイトメトリーによって表面抗原の発現を明らかにすることができます。私たちのテクニックには、複雑な操作は含まれていません。しかし、重要なことの1つは、他の近くの組織の影響を避けるために、小さな骨に付着した肉を完全に除去しようとすることです実験を開始する前に、標準的な実験用固形飼料と水を備えた特定の病原体のない条件下で、8〜12週齢の野生型C57ブラック6匹のオスとメスのマウスを収容します。アレルギー性鼻炎モデルを確立するには、2ミリグラムの水酸化アルミニウムを含む0.2ミリリットルの滅菌PBSに50マイクログラムのオボアルブミンを乳化し、50マイクログラムの乳化オボアルブミンを各マウスに0日、7日、および14日に腹腔内注射します。21、22、23、24、および25日目に、30マイクロリットルの滅菌PBSに溶解した50マイクログラムのオボアルブミンをマウスに鼻腔内投与し、続いて最後のチャレンジの24時間後にマウスを安楽死させた。安楽死させたマウスの頭を75%エタノールに5分間浸し、エタノールが外鼻孔に入らないようにします。腹部を手術台の下に置きます。4本の歯を切り取り、頭の正中線で切開し、ハサミを使って皮膚を切り開きます。次に、下顎を取り外し、口蓋の端に沿って鼻全体を切り取り、5リットルの氷冷PBSを含む60ミリメートルのペトリ皿に組織を置きます。はさみと鉗子を使用して、骨に付着している肉と筋肉を取り除きます。次に、マウスの鼻を5ミリリットルの氷冷PBSを含む新しい60ミリメートルのペトリ皿に移し、骨を洗います。2回目の洗浄後、鼻を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。組織を十分に粉砕し、2ミリリットルの予熱した消化バッファーを含む15ミリリットルのチューブに移します。蓋を締め、チューブを摂氏37度、120〜150RPMのオービタルシェーカーに40分間垂直に置きます。次に、10%ウシ胎児血清を含む5ミリリットルの氷冷RPMI 1640培地を加えて消化を停止します。次に、70ミクロンのセルストレーナーで内容物をろ過し、固体片を除去します。ろ液を500Gで5分間遠心分離した後、上清を穏やかに廃棄し、ペレットを氷冷RPMI 1640培地に再懸濁します。前に示したように遠心分離を繰り返すには、細胞ペレットを4ミリリットルの40%密度勾配培地に再懸濁します。次に、パスツールピペットをチューブの底にそっと挿入し、2.5ミリリットルの80%密度勾配培地を追加します。チューブを400Gで室温で15分間遠心分離し、加速と減速の速度を3速よりも低く設定します。界面でセルを排出する前に、潜在的な汚染を避けるために不純物の最上層を取り除きます。次に、ピペットを使用して、40%x 80%密度勾配媒体界面にある単核細胞の層を、2ミリリットルの氷冷を含む15ミリリットルのチューブに排出します。氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。細胞を回収し、摂氏4度で500 Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを染色バッファーに再懸濁し、500 Gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を再懸濁し、80マイクロリットルのブロッキング溶液に暗所で摂氏4度で30分間インキュベートします。適切な希釈液の20マイクロリットルの表面染色抗体カクテルをサンプルに加える直前に、1マイクロリットルの固定可能な生存率色素520を加える。また、一致するアイソタイプ抗体と蛍光マイナス1をネガティブコントロールとして設定する。次に、500倍Gで5分間、摂氏4度で5分間遠心分離することにより、細胞を500マイクロリットルの染色バッファーで洗浄します。次いで、細胞ペレットを200マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁する。最後に、50マイクロリットルのボルテックスアブソリュートカウントビーズを染色細胞に加えます。撹拌し、フローサイトメトリー分析にかけます。第2群の自然リンパ系細胞の役割を調べるために開発された卵子誘発マウスモデルは、アレルギー性鼻炎マウスの鼻こすりとくしゃみの頻度が対照群よりも有意に高いことを示しました。健常対照マウスの鼻粘膜において、約2〜3%の系統陰性およびCD45陽性細胞が同定された。グループ2の自然リンパ系細胞の絶対数は2, 000から4, 000まで変化しました。フローサイトメトリー解析の結果、アレルギー性鼻粘膜の2群自然リンパ系細胞の総数は、健常対照マウスと比較して顕著に増加した。CD226の発現は、対照マウスよりもアレルギー性鼻炎マウスにおいて2群の自然リンパ系細胞で検出された。加えて、CD226の平均蛍光強度は、ARマウスにおいて有意にアップレギュレーションされた。鼻骨に付着した肉を除去する工程、培地を遠心分離する際の加速・減速率の設定、単核球の排出工程に注意する。同定されたILC twoは、細胞培養用にソートされたフローサイトメトリー特性評価の略であるか、in vitroで刺激され、鼻組織におけるILC twoの特異的リスクの調査に役立ちます。リンパ球、特に鼻粘膜の自然リンパ細胞を分離して特徴付けるこの手順により、このプロトコルは、局所的な鼻免疫環境を探索する研究者にとって予備的なリファレンスになります。

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