Name: 成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぼう、TGTセンサープラットフォームを用いてEGFRとインテグリンの相互作用を定量し、Cos-7細胞における成長因子依存的な接着力と細胞伸展を解析する方法。この技術は細胞力学とシグナル伝達の理解に貢献します。

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著者らは、実りある議論と批評のためにMattheyes研究室のメンバーを表彰したいと思います。我々は、NSF CAREER 1832100及びNIH R01GM131099からのA.L.M.への資金提供を認める。

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<li>Luca, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-Jagged+complex+structure+implicates+a+catch+bond+in+tuning+ligand+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity.</a> Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).</li>
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<li>Brockman, J. M., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+proofreading%3A+a+general+mechanism+to+enhance+the+fidelity+of+information+transfer+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells.</a> Frontiers in Physics. 7, 14(2019).</li>
</ol>

著者は利益相反がないと宣言しています。

上記で概説した詳細なステップバイステップの手順により、TGT表面を調製して、EGFによる処理後の細胞付着および拡散中に接着細胞によって生成される細胞形態およびインテグリン張力を定量化することができる。簡単なプローブ設計と合成、表面処理、および簡単な実験セットアップにより、EGFRとインテグリンの相互作用を研究するための安定したプラットフォームが提供されました。全体として、この結果は、EGFRのリガンド依存性活性化が細胞拡散を増強し、インテグリン受容体の力保持特性を調整し、局所接着組織および成熟を促進することを検証した。TGTプローブを用いて得られた結果は、EGFRなどの成長因子が「メカノオーガナイザー」として作用し、インテグリン張力の量と空間組織を増加させ、焦点接着の向きと力学を調節するという包括的な仮説を支持しています。
TGT表面に適用すると、細胞はインテグリン(αVβ3)受容体がcRGDfKリガンドを感知して結合するように着陸、付着、および広がります。そうすることで、TGTプローブを機械的に破裂させ、リガンド結合部位で蛍光を発生させることができる。読み出しは、表面と相互作用する細胞の累積的な「力履歴」です。TGTサーフェスには、これらの実験中に存在する可能性のある一般的な問題がいくつかあります。高い表面バックグラウンド蛍光(図6A、B)、斑点のある表面外観、張力シグナルを生成する細胞の障害(図6C、D)、および細胞の拡散の障害(図6E、F)は、TGTプローブまたは表面合成の技術的欠点に起因する可能性がある。これらの一般的な問題の解決策を表 1 に示します。
TGTプローブの簡単な設計により、細胞生物学者は、特定のリガンドと刺激のみを提供することにより、他の細胞表面受容体からの干渉なしに、特定の成長因子インテグリンシグナル伝達結果を単離して研究するための強力なツールを提供します。さらに、TGTプローブは、pN感受性での細胞接着中の個々のインテグリン受容体に下線を引く張力閾値の調査を可能にする。代替アプローチは、固定サンプル31において高い空間分解能を有する個々の受容体によって及ぼされる力を報告することができない。牽引力顕微鏡は、個々のインテグリン受容体15によって加えられる力よりも一桁高いnN力にのみ敏感であり、分子張力プローブはpN力を測定するが、可逆的であるため、固定に堅牢に耐えない。これらの理由から、TGTプローブは、成長因子-インテグリン相互作用のメカニズムを研究するための魅力的なツールです。
TGTプローブに関連するいくつかの技術的なニュアンスは、実験を設計する前に考慮する必要があります。張力画像は時間のスナップショットであり、力の履歴を表し、任意の時点での受容体 - リガンドの関与の指標ではない。シグナル生成はプローブの分離に依存するため、TGT蛍光は、受容体-リガンド結合による活性緊張下にないオープンプローブから生じる。これは、TGT表面上で得られたインテグリン張力の読み出しが、本質的に歴史的かつ累積的であり、Ttolよりも大きい力があった場所を表すことを意味する。Ttol未満の現在の受容体リガンド力の位置は報告されていない19,32。TGT破裂は受容体-リガンド結合の終結をもたらすので、細胞拡散は、Ttolよりも低い力を経験するインテグリン-リガンド相互作用によるものである。したがって、ユーザーは、インテグリンベースの接着に関連する機械的結果を推定するために、めっき後の時間を定義する際に注意する必要があります。最後に、Ttol の意味を考慮する必要があります。ここで使用されるTGTプローブのTtolは56pNで、Ttolは2秒間印加したときにプローブの50%を破裂させるのに必要な一定の力です。複雑な生物学的システムを考慮すると、TGTは、異なる時間依存性を有する不均一で多様な力グラデーションを経験する可能性が高い。TGTがTtolより大きい力によって破裂した場合、蛍光は総張力の過小評価となる。あるいは、より長い時間適用されるTtol以下の力は、より短い時間に適用される高い閾値の力と同数のプローブを破裂させる可能性がある。これらのシナリオは両方とも、同じ蛍光強度読み出しをもたらし得、TGTプローブ33、34を用いて正確な張力の大きさまたはダイナミクスを解決することを困難にする。
全体として、成長因子刺激によるインテグリン張力の評価は、内部コントロールによる実験の設計、他のマトリックスコーティングされた表面での拡散プロファイルの比較、成長因子刺激の有無における細胞におけるTGT蛍光の並行評価、および異なるTtolを有するTGTの使用によって慎重に行われるべきである。.TGTは、インテグリン受容体のメカニズム、局所接着ダイナミクス、および細胞拡散の調節における成長因子シグナル伝達の役割の定量化を可能にする。このプロトコルは、異なるTtol、異なるリガンド、異なる細胞型、または異なる刺激条件を有するプローブを使用する多くのTGTベースの実験のテンプレートとして使用することができる。任意の目的のタンパク質を固定後に標識することができ、任意のタイプの定量的画像解析を実施することができる。そのため、多数のTGT実験のテンプレートを提示します。
TGTプローブの使用は、インテグリンの研究に限定されず、リガンドを修飾することによって、異なる細胞型にわたる細胞膜受容体の多様なアレイに拡張することができる。TGTプローブは、胚発生および神経新生35におけるNotch受容体力学の機械的役割の同定、B細胞受容体36による抗原の同定および内在化を媒介する力、およびシグナル伝達の強度および特異性を高める力の変化を検出するT細胞表面受容体の機械的プルーフリーディング能力37を含む、様々な受容体シグナル伝達カスケードを調節する力の役割を調査するために使用されてきた37.これらの知見は、さまざまな実験環境におけるTGTプローブの計り知れない可能性を浮き彫りにしています。

細胞は、機械的力を感知し、生成し、応答する固有の能力を有し、細胞表現型の変化および局所微小環境のリモデリングをもたらす1,2。力は、接着、遊走、増殖、分化、創傷治癒など、細胞行動の多くの側面を調節する上で重要な役割を果たします3,4。細胞と微小環境との間の双方向の機械的交換における収差は、癌を含む罹患状態をもたらし得る5。多数の膜受容体が細胞マトリックス恒常性の維持に関与している。これらのうち、インテグリンおよび上皮成長因子受容体(EGFR)は、強固な相乗効果を有する6,7。古典的には、インテグリンは微小環境と細胞内細胞骨格との間の機械的リンクを確立し、EGFRは細胞増殖、増殖、および生存を調節する8,9。EGFRは、細胞内シグナル伝達を促進するアウトサイドイン調節に焦点を当てた、高度に研究された治療標的である。EGFR-インテグリンクロストークは、癌を含む複数の疾患の進行を調節するために遺伝的および生化学的に確立されている10、11。研究はEGFR-インテグリン相互作用の存在を示しているが、その転帰は原形質膜から離れたシグナル伝達経路に起因する7、12、13、14。EGFRまたは他の成長因子が細胞力学に及ぼす影響は、細胞力およびシグナル伝達結果を測定するためのツールの欠如のために、ほとんど未解明のままである。課題は、これらの並列シグナル伝達パラダイム間の通信を研究し、細胞力学への具体的な寄与を定量化するための適切なツールを特定することにあります。
細胞接着受容体によって生成される力を測定するためにいくつかのアプローチが開発されており、読者はこれらの技術の詳細なレビューに向けられている15、16。簡単に説明すると、牽引力顕微鏡法およびマイクロピラーアレイ検出は、ナノニュートン(nN)力を推測するために、個々の受容体力よりも一桁大きいナノニュートン(nN)力を推測するために、基礎となる基板の変形に依存する17、18。AFMおよび光ピンセットを含む単一分子技術は、単一タンパク質ピコネウトン(pN)力に敏感であるが、一度に1つの受容体のみを測定し、良好な(または任意の)空間分解能を提供しない。DNAベースの分子張力プローブおよびテンションゲージテザー(TGT)プローブは、回折制限(またはそれ以上)の空間分解能でpN力分解能を提供し、線維芽細胞、癌細胞、血小板、免疫細胞を含む多様な細胞型からの単一細胞力19,20を研究する上で独自の役割を果たします21,22,23,24.分子張力プローブは、リアルタイムイメージングに最適な拡張可能な「スプリング」要素を備えていますが、TGTプローブは不可逆的に破裂し、蛍光の「力履歴」を残します。TGTは、下地基板の張力閾値をさらに調節する。類似した化学組成を有するが、異なる破裂力、または張力公差(Ttol)を有する一連のプローブを使用して、焦点接着形成および細胞拡散に必要な最小張力を定量化することができる。TGTプローブは、2つの相補的なDNA鎖からなり、1つは表面に固定され、もう1つはリガンドを細胞に提示する。受容体がリガンドと結合し、プローブのTtolよりも大きい力を発揮すると、鎖は分離されます。Ttolは、理想的な条件下でプローブの50%を2秒間隔で破裂させるのに必要な一定の力として定義されます。「ターンオン」TGTプローブでは、トップストランドのクエンチャーをボトムストランドの蛍光色素分子から分離できます。TGTプローブが破裂した場所、おそらくTtol以上の力によってのみ、蛍光シグナルが生成されます。TGTプローブは固定することもでき、生物学的システムの操作や複数の条件の試験を容易に行うことができます。これらの理由から、TGTプローブがこの作業に使用された。
TGTプローブは、インテグリン依存性細胞接着および機械的力が活性化EGFR21によってどのように調節されるかを研究するために使用された。この研究は、EGFRを「メカノオーガナイザー」として確立し、焦点接着組織と張力発生をチューニングしました。さらに、EGF刺激が局所接着の分布および成熟および細胞拡散の増強に影響を及ぼすことが見出された。このアプローチは、成長因子が腫瘍の進行および動態における機械的力にどのように影響するかを調査するために、将来の研究で使用することができる。上皮から間葉への移行を調節する上でのEGFR-インテグリンクロストークの役割は確立されているが、このプロセスにおける機械的力の役割は未だに検討されていない10。
ここでは、56pN TGTプローブの合成および組み立て、ガラスカバーグラス上のTGT表面の生成、TGT表面上のCos-7細胞の適用およびEGFによる刺激、ファロイジンによる細胞の固定および染色、ならびに抗パキシリン抗体、高解像度全反射蛍光(TIRF)および反射干渉コントラスト顕微鏡(RICM)イメージング、 画像の定量化。このプロトコルは、Cos-7細胞のEGF刺激を調査するために書かれたものの、多くのTGTベースの実験に容易に適応可能である。異なるリガンド、Ttol、細胞型、刺激パラメータ、固定後に標識されたタンパク質、および定量分析で簡単に置換できるため、このプロトコルは堅牢で広く有用です。

<table><tbody><tr><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>440140</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>3-ヒドロキシピコリン酸(3-HPA)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>56197</td><td>マルジ-TOF-MSマトリックス</td></tr><tr><td>酢酸、氷河</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A38S</td><td>希釈EGF</td></tr><tr><td>アセトニトリル(HPLC)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A998SK</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8878S</td><td>Immunocytochemistry</td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>A687</td><td>Immunocytochemistry</td></tr><tr><td>抗パキシリン抗体 [Y113]</td><td>Abcam</td><td>ab32084</td><td>Immunocytochemistry</td></tr><tr><td>BD Syringes only with Luer-Lok</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>Surface</td></tr><tr><td>Preparation Bio-Gel P-2</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1504118</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA) プロテアーゼフリー粉末</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP9703100</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>Cos-7 細胞</td><td></td><td>ATCC CRL-1651</td><td>細胞培養、継代番号 11-20</td></tr><tr><td>カバースリップ ミニラック、カバースリップ 8 枚用</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C14784</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸</td><td>ビビチド</td><td>PCI-3696-PI</td><td>オリゴヌクレオチド製剤</td></tr><tr><td>Cy3B NHSエステル</td><td>GEヘルスケア</td><td>PA63101</td><td>オリゴヌクレオチド製剤</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>PHR1553</td><td>オリゴヌクレオチド製剤</td></tr><tr><td>L-グルタミン、4.5g / Lグルコース、ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>MT10013C</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>上皮成長因子ヒトEGF</td><td>ミリポアシグマ</td><td>E9644</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ(100%)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22032601</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>ファルコン標準組織培養皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772E</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-438-026</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>フルロブライトDMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21244</td><td>Immunocytochemistry Goat</td></tr><tr><td>Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-210-064</td><td>Immunocytochemistry</td></tr><tr><td>Hank'Fisher</td> <td>Scientific</td><td>14-170-161</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>16050130</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>Nanosep MF 遠心装置</td><td>ポール研究室</td><td>ODM02C35</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>NHS-アジ</td><td>ド フィッシャー科学的な</td><td>88902</td><td>オリゴヌクレオチドの準備</td></tr><tr><td>窒素ガスシリンダー</td><td>空気ガス</td><td></td><td>表面処理</td></tr><tr><td>No.2丸いガラスカバースリップ-25 mm</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>表面処理</td></tr><tr><td>パラフィルムM実験室フィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-374-10</td><td>表面処理</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド16%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-980-487</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-030-CV</td><td>表面調製/免疫細胞化学</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (5,000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-070-063</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>PYREX 低型グリフィンビーカー</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540G</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-310</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S233</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP358</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>434301</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>スルホ-NHS-LC-ビオチン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>21335</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>フィッシャーScientific</td><td>A300-500</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>TEAA</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>NC0322726</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>471283</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td><td>フィッシャー サイエンティ</td>フィック <td>サイエン</td>ティフィック PI28901 <td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>THPTA</td><td>フィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィ</td><td>ック NC1296293</td><td>オリゴヌクレオチドの調製</td></tr><tr><td>Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>85111</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>水、DNA グレード、DNASE、プロテアーゼフリー</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24701</td><td>オリゴヌクレオチド Preparation</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 カラム、4.6 x 150 mm、2.7 &mu;m</td><td>Agilent</td><td>653950-702</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー</td><td>Agilent</td><td>1100</td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>低速軌道シェーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-320-813</td><td>免疫細胞化学</td></tr><tr><td>マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析計 (MALDI-TOF-MS)ボ</td><td>イジャー STR</td><td></td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>分子プローブ Attofluor セルチャンバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A7816</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>ナノドロップ2000 UV-Vis分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>ニコンエクリプス Ti倒立顕微鏡</td><td>PE ニコン</td><td>顕微鏡</td>ニコン<td></td></tr><tr><td>パーフェクトフォーカスシステム</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 デジタルCMOSカメラ</td><td>浜松顕微鏡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クワッドバンド TIRF 405/488/561/647 cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>RICM Cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>SOLA v-nIR Light Engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>Thermo Forma Steri Cycle370 CO2インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>VWR75D超音波</td><td>クリーナーVWR13710</td><td></td><td>表面準備</td></tr><tr><td>データ分析</td><td></td><td></td><td>Use</td></tr><tr><td>フィジー(画像J)</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td>定量分析</td></tr><tr><td>グラフパッドプリズム</td><td>グラフパッド</td><td></td><td>統計解析</td></tr><tr><td>オリゴ名<</td><td>strong>5'修飾/ 3'修飾</td><td>配列(5'〜3')</td><td>Use</strong</td></tr><tr><td>>Alkyne-21-BHQ2</td><td>5'ヘキシニル/ 3'BHQ_2</td><td>GTGAAATACCGCAGATGCG</td><td>トップストランドTGTプローブ</td></tr><tr><td>56pN TGT</td><td>5'Biosg/TTTTTT/iUniAmM</td><td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td><td>ボトムストランド TGT プローブ</td></tr><tr><td>12 pN TGT</td><td>5' AmMC6/ 3' BioTEG</td><td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td><td>ボトムストランド TGT プローブ</td></tr></tbody></table>

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

多細胞生物は、周囲の細胞外マトリックス(ECM)中の膜受容体と同族リガンドとの間の相互作用に依存して、接着、増殖、遊走、分化を含む複数の機能を調整する。機械的力は、接着受容体インテグリン を介して 細胞からECM内のリガンドに伝達することができる。これらの細胞生成力の量および空間組織は、上皮成長因子受容体(EGFR)を含む成長因子受容体によって調節することができる。細胞力学におけるクロストーク媒介性の変化を定量化し、それらを焦点接着、細胞形態学、およびシグナル伝達に関連付けるために現在利用可能なツールは限られている。張力ゲージテザー(TGT)として知られるDNAベースの分子力センサは、これらの変化を定量化するために採用されている。TGTプローブは、根底にある力閾値を調節し、回折制限された空間分解能で付着細胞表面全体にわたってピコネウトンスケール受容体力を報告する能力においてユニークである。ここで使用されるTGTプローブは、蛍光シグナルを生成する受容体 - リガンド力によるDNA二重鎖の不可逆的解離に依存している。これにより、細胞の累積インテグリン張力(力履歴)の定量化が可能になる。この記事では、インテグリン力学および接着形成に対するEGFRの影響を研究するためにTGTを使用するプロトコルについて説明します。TGTメカニカルセンシングプラットフォームの組み立ては体系的に詳細であり、力、焦点接着、および細胞拡散を画像化する手順が概説されています。全体として、プローブの根底にある力閾値、接着リガンド、および刺激に使用される成長因子の種類と濃度を調節する能力は、インテグリン媒介性力を調節する際の多様な膜受容体の相互作用を研究するための堅牢なプラットフォームとなる。

ターンオンTGTプローブを用いて、Cos−7細胞21におけるインテグリン媒介性細胞力学および接着形成に対するリガンド活性化上皮成長因子受容体(EGFR)の効果を調査した。プローブは、リガンド環状Arg−Gly−Asp−Phe−Lys(cRGDfK)21、23、25、26を提示し、これはα5β1インテグリン27、28、29、30に対してわずかな親和性しか持たないインテグリンヘテロ二量体αVβ3に対して選択的である。TGTプローブは、ビオチン-ストレプトアビジン結合を使用してボトムストランドを介してガラスカバースリップ表面に官能化された二重鎖DNAを含む。一番上の鎖はインテグリンリガンドを表示し、細胞膜上の同族インテグリン受容体に結合するために利用可能である(図5A)。下部の鎖は蛍光色素分子で標識され、上部の鎖は消光剤で標識されているため、二重鎖TGTが無傷のときにバックグラウンド蛍光が最小限に抑えられます。インテグリンがリガンドと結合し、プローブのTtolよりも大きな大きさの力を加えると、DNA二重鎖が分離して蛍光が発生します(図5A)。機械的な力によって破裂していないTGTプローブは、非蛍光性のままです。この力選択的ターンオン蛍光は、回折制限分解能でpNスケールのインテグリン生成力の系統的かつ定量的なマッピングを可能にします。TGTプローブは、基質の張力閾値をさらに調節する。
ここに示すのは、56pNのTtol を有するTGT表面の代表例である。EGF刺激の有無にかかわらず、このTGT表面にCos-7細胞を播種し、リガンド刺激によるEGFR活性化が細胞接着およびインテグリン力学に及ぼす影響を調べた(図5A、B)。細胞をTGT表面上のEGFの有無にかかわらず60分間インキュベートし、固定し、免疫染色して、細胞骨格(F-actin)の焦点接着分布(パキシリン)および組織を表示した(図5B)。次いで、細胞をRICMおよびTIRF顕微鏡を用いて画像化した。RICM画像に明瞭に見られるように、56pN TGT表面上のCos−7細胞拡散は、刺激なしと比較してEGF刺激で有意に増強された。これをRICM画像から細胞間基質接触領域の大きさを測定することにより各条件における50個の細胞について定量した(図5C)。EGFによる刺激は、より円形の形態をもたらし、Cos−7細胞がそれらの天然の生理学的環境において拡散および増殖するのを表す(図5D)。オープンプローブからの蛍光は、張力蛍光画像で観察されるようにEGF刺激でも高い。オープンプローブの数に比例するオープンプローブの積分強度は、EGF刺激がない場合と比較してはるかに高かった(図5B、E)。これは、インテグリンがTtol (56pN)を超える力を加えたすべての受容体 - リガンド結合の表現である。
パキシリンによる染色は、焦点癒着の分布、数、成熟(サイズ)、および組織もEGF刺激によって影響を受けることを示した。EGF刺激細胞における焦点接着は、EGF対照なしと比較して、より成熟し、放射状に配向しているように見えた。F-アクチン細胞骨格組織も、ファロイジン染色によって評価されるように、EGF刺激で増強された(図5B)。これらの定性的評価は、両方の治療群からの画像の視覚的比較によって行われた。焦点接着の定量的分析は行うことができるが、このプロトコルの範囲外である。この実験では、TGT表面は、細胞拡散、インテグリン力学、および焦点接着形成に対するEGFR活性化の影響を体系的に詳述するためのプラットフォームを提供しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig01.jpg"> 図1:TGT表面処理の1日目の概略図。(A)カバーグラスを清掃する。(B)カバースリップ面をエッチングする。(C)ピラニア溶液を中和する。(d)表面をシラン化して反応性アミン基を作る。(E)カバースリップを有機相に平衡化する。(F) カバースリップを不活性ガスで乾かします。(g)表面アミン基をビオチン化する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig02.jpg"> 図2:TGT表面処理の2日目の概略図(A)カバースリップをきれいにして乾燥させ、前日から残留ビオチンを除去します。(B)BSAで不動態化して、後続のステップにおける試薬の非特異的結合を防止する。(C)ストレプトアビジンでカバースリップを機能化します。(D)サーモサイクラーでプローブをハイブリダイズさせる。(E)合成したプローブをカバースリップに塗布する (F)カバースリップを細胞イメージングチャンバー内で組み立てる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig03.jpg"> 図3:実験セットアップ全体にわたる幅広いステップを強調する一般的なワークフロー(A)EGF刺激の有無にかかわらず、基礎培地(DMEM)中のTGT表面上の細胞剥離およびめっきのプロセス。(b)TGT表面への付着後および拡散後の固定および免疫染色に関与するステップのフローチャート。(c)染色後、細胞をRICMおよびTIRF顕微鏡による倒立蛍光顕微鏡上で画像化する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig04.jpg"> 図4:データ処理と定量分析の例(A)フィジーでRICMと張力画像の定量化に採用されている分析パイプライン(ImageJ)の段階的な内訳。(b)上記のパイプラインを用いて解析された細胞形態測定結果の代表例。(c)上述のパイプラインを用いて分析された細胞機械的転帰の代表例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig05.jpg"> 図5:TGT実験からのデータ例(A)細胞膜-TGT表面界面における接触ゾーンを強調する図。インセットは、その同族リガンドcRGDfKと相互作用するインテグリンを、EGF刺激(右)またはなし(左)で投影する。(B)56pN TGT表面に広がるCos-7細胞のRICMおよびTIRF画像。画像は、EGF刺激の有無にかかわらず60分ポストプレーティングで得られる。個々のRICM(取得済み)、インテグリン張力(グレースケール)、パキシリン(オレンジホット)、およびF-アクチン(青緑色)の画像を、両方の刺激条件についてオーバーレイで示しています。スケールバー:10μm。挿入図は、パキシリンによってマークされる接着形成部位で生成されたインテグリン張力の共局在、およびアクチンによってマークされる基礎となる細胞内細胞骨格組織の共局在を詳述するズームインROI(関心領域)を強調する。スケールバー:5μm。(C-E)EGF刺激の有無にかかわらず、Cos-7細胞の拡散領域(RICM細胞フットプリント)(C)、円形度(D)、および統合張力(E)の散布図。小節は平均±s.d.を示します。群間の差は、スチューデントのt検定で統計的に評価された。P &lt; 0.0001.n=3つの独立した実験にわたって50細胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig06.jpg"> 図 6: 考えられるさまざまな問題を持つ TGT サーフェスの例。 (A)細胞接着前にクエンチされたプローブを組み立てた理想的なTGT表面の張力およびRICM画像。(B)TGTプローブがトップストランド(クエンチャー)を欠いているTGT表面の張力およびRICM画像。張力画像は、最下鎖における開いた蛍光色素分子からの均一な蛍光を示す。(C)理想的なTGT表面に広がる細胞の張力およびRICM画像。(D)細胞の張力およびRICM画像は、限られたパッシベーションまたは劣化プローブで、あまり作られていないTGT表面に広がる。(E) cRGDfK-インテグリン相互作用を示すcRGDfKリガンドで理想的な表面にメッキされた細胞の張力、RICMおよび明視野画像は、細胞の付着および張力生成に不可欠であることを示す。(F)TGT上にcRGDfKリガンドを含まない表面に播種された細胞の張力、RICMおよび明視野画像。細胞は明視野画像で可視であるが、細胞付着または生成されたインテグリン張力は観察されない。スケールバー:10μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

TGT表面は、成長因子 - インテグリンクロストークを研究するための革新的なプラットフォームです。柔軟なプローブ設計、接着リガンドの特異性、刺激条件の正確な変調により、EGFR-インテグリン相互作用の堅牢な定量的評価が可能になります。この結果は、EGFRがインテグリン力学を「メカノオーガナイザー」チューニングし、焦点接着アセンブリと細胞拡散に影響を与えることを強調しています。

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

このプロトコルは、EGFR-インテグリンクロストークと細胞の機械的力に対するその影響を研究するために使用されるTGTセンサプラットフォームの単純さのために重要です。Raoは、細胞力学のEGF依存性調節を調査することを概説した。このプロトコルは、さまざまなリガンド、細胞型、刺激パラダイムに適応可能であり、さまざまな張力閾値のTGTと組み合わせることができます。表面合成は、最初は威圧的に思えるかもしれません。鍵となるのは、試薬の調製と計算のチェックリストを採用して、複雑なステップを正確に実行するための準備と整理です。1 日目に、最大 8 つの 25 mm ガラス カバー スリップをポリテトラフルオロエチレンラックに入れます。ラックを、40 ミリリットルの 200 プルーフエタノールを含む 50 ミリリットルのホウケイ酸ビーカーに入れます。室温で10〜15分間、35キロヘルツの動作周波数で超音波処理する。パイレックスビーカーに硫酸と過酸化水素を3:1の比率で混合し、ガラスピペットで攪拌したてのピラニア溶液40ミリリットルを50ミリリットルのビーカーに充填する。カバースリップラックをビーカーに移し、ヒュームフード内で室温で30分間インキュベートしてカバースリップ表面をエッチングする。エッチング後、カバースリップラックをピンセットで超純水を入れたビーカーに移します。カバースリップを目視で検査し、ガラス表面に模様やほこりの粒子がなく、表面がきれいに見えることを確認します。カバースリップラックを200プルーフエタノールでビーカーに移し、15秒間2回洗浄して表面を有機溶媒に平衡化させます。カバースリップラックを3%APTESを含む200プルーフエタノール溶液に室温で1時間移し、カバースリップをシラン化します。ラックを 200 プルーフのエタノール溶液の入った清潔なビーカーに浸します。出口圧力の低い窒素ガスを使用してカバースリップを乾かします。カバースリップを10センチメートルのポリスチレン皿に入れ、その中にパラフィンフィルムを平らに置きます。パラフィンフィルム上に置かれた4つのカバースリップに、DMSO中の1ミリリットル当たり2ミリグラムの100マイクロリットルのNHSビオチン溶液を加える。他の4つのカバースリップを上にしてサンドイッチをセットし、2つのカバースリップを互いに向かせ、その間に機能化ソリューションを置きます。2日目に、皿を摂氏4度から取り出し、サンドイッチしたカバースリップを分離します。サンドイッチを分離している間、機能化された表面を傷つけたり傷つけたりしないでください。次に、カバー・スリップをラック内の、コーティング面が互いに対向するように向けます。窒素ガスで乾燥させます。カバースリップを新しい皿に入れ、その中にパラフィンフィルムを入れます。各カバースリップに1X PBS中の0.1%ウシ血清アルブミン800マイクロリットルを加える。カバースリップを室温で30分間インキュベートして表面を不動態化し、その後の機能化試薬の非特異的結合を遮断する。カバースリップを機能化するために、室温で45〜60分間、1X PBS中のストレプトアビジン1ミリリットルあたり1マイクログラムの800マイクロリットルを加える。TGTプローブをサーモサイクラーを使用してPCRチューブに組み立てます。インキュベーション後、カバースリップを1X PBSで3回洗浄する。4つのカバースリップに100マイクロリットルの組み立て済みTGTプローブを追加し、残りの4つのカバースリップを使用してサンドイッチを作り、機能化された側をプローブに向けます。アルミホイルで覆います。インキュベーション後、サンドイッチを分離し、カバースリップを1X PBSで3回洗浄します。カバースリップを事前に清掃されたイメージングチャンバーに慎重に組み立てます。Cos-7のメカニズム、接着、および細胞拡散に対する上皮成長因子刺激の影響を調べるために、Cos-7細胞を0.05%トリプシン-EDTAで2分間トリプシン化する。HBSSで洗浄し、800Gで5分間遠心分離することにより、トリプシンを中和する。DMEM中で組み立てられたTGT表面上の40,000細胞の密度のプレート細胞は、EGFまたはEGFを含まないDMEM当たり50ナノグラムのEGFを補充した。インキュベーションに続いて、細胞を1X PBSで3回洗浄する。2ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで室温で12分間固定する。カバースリップを室温で5分間隔で1X PBSで5回洗浄します。任意選択で、カバースリップを1X PBS中の50ミリモル塩化アンモニウムと共に摂氏37度で30分間インキュベートする。バッファーAを追加し、カバースリップ付きのイメージングチャンバーを湿度容器に入れます。摂氏37度で30分間インキュベートし、細胞をブロックして透過させます。一次抗パキシリン抗体をブロッキングバッファー中で1:250希釈で希釈する。カバースリップあたり200マイクロリットルの一次抗体溶液とともに摂氏37度で2時間インキュベートします。カバースリップあたり200マイクロリットルのブロッキングバッファー中の1:800希釈でジコンジュゲートヤギ/抗ウサギ二次抗体の混合物と1:400希釈でジコンジュゲートファロイジンの混合物と同時に細胞を標識します。5分間隔で1X PBSで表面を5回洗浄します。まず、対物レンズにオイルを加え、サンプルチャンバーのカバースリップ底部を清掃し、サンプルをステージに置きます。細胞に集中し、完璧な焦点を当てます。落射照明絞りを閉じてセンタリングして、RICMを合わせます。488ナノメートルのレーザーを部屋の天井の小さなスポットに焦点を合わせ、臨界角を過ぎるまで入射角を大きくし、ライブモードでカメラの蛍光を監視します。臨界角を超えたときの背景蛍光と単一の焦点面の急激な減少を観察します。RICMを使用してカメラのライブモードを使用してイメージングする細胞を同定する。488ナノメートル励起でのアクチン、561ナノメートル励起でのインテグリン張力、および647ナノメートル励起でのパキシリンのRICMおよびTIRF画像を取得します。200ミリ秒の露光時間を用いて画像を順次取得する。カバースリップを変更し、焦点を合わせ、繰り返します。EGF刺激の有無にかかわらず、このTGT表面にCos-7細胞を播種し、リガンド刺激によるEGFR活性化がインテグリン力学に及ぼす影響を調べた。インテグリンがリガンドに結合し、プローブの張力閾値合計よりも大きい力を加えると、DNA二重鎖が分離し、蛍光が発生します。機械的な力が破裂していないTGTプローブは、非蛍光性のままです。細胞をTGT表面上のEGFの有無にかかわらず60分間インキュベートし、固定し、免疫染色して、細胞骨格の焦点接着分布および組織を表示した。RICM画像において、56−ピコネウトンTGT表面上のCos−7細胞拡散は、刺激なしと比較してEGF刺激で有意に増強された。EGFによる刺激は、より円形の形態をもたらし、Cos−7細胞の拡散および増殖を表す。オープンプローブからの蛍光は、張力蛍光画像で観察されるように、EGF刺激でも高い。オープンプローブの数に比例するオープンプローブの積分強度は、刺激なしよりもEGF刺激の方がはるかに高かった。カバースリップの向きを常に覚えておき、機能化された表面を上向きに保ちます。サンドイッチを分離するときは、表面を傷つけたり傷つけたりしないように優しくしてください。表面合成に続いて、細胞接着または機械的形質導入を調節する細胞質タンパク質のプローブができる。これにより、原形質膜における細胞力学のオーケストレーションに関与する下流のシグナル伝達分子の同定が可能になる。

tension-gauge-tether-probes-for-quantifying-growth-factor-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、ポリエチレングリコールアンカー金ナノ粒子とDNAヘアピンテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体力を評価する方法を示しています。CD8陽性T細胞の相互作用は、プローブのアンフォールディングをトリガーし、蛍光を発しながら、鎖をロックしてシグナルを維持し、免疫細胞が加える力を定量化します。...

DNAベースのテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体の力を評価する

我々は部分的に軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブで行わ同時力分光測定によってレーザーディセクタで損傷された軸索の緊張放出を測定した。開発された実験プロトコルは、培養基板に軸索の接着性を評価します。...

ピコニュートンとミリ秒の分解能で基板への軸索の接着性を評価するために、レーザー誘起軸索病変の間にテンションリリースの測定

彼らは機械的張力を送信し、組織の恒常性と開発に関与するシグナル伝達経路を開始するように、細胞表面の癒着は、メカノの中心です。ここでは、接着受容体へのリガンドで被覆された磁性マイクロビーズと力のアプリケーションを使用して、張力に応答して活性化される生化学的経路を切開するためのプロトコルを提示します。...

磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

ここでは、プロトコルを提案フェルスター共鳴の同時使用のため力感受性の測定を有効にするタンパク質ダイナミクスを測定するため退色後蛋白質負荷と蛍光の回復を測定するエネルギー転送ベースのテンション...

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

インテグリンの緊張は、様々 な細胞機能に重要な役割を果たしています。統合テンション センサーとインテグリンの緊張はピコニュートン (pN)...

イメージング インテグリン張力と細胞の力でサブミクロン解像度統合テンション センサーで

この方法は、細胞接着の初期ダイナミクスを定量化し、アンカレッジ依存性細胞をフィブロネクチンに広めるのに有用である。さらに、このアッセイは、細胞拡散および/または細胞接着関連細胞内シグナル伝達経路に対する改変された酸化還元恒常性の影響を調製するために使用することができる。...

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

この論文では、DNAベースのテンションプローブを使用して免疫細胞によって加えられる受容体力を画像化するための詳細なプロトコルについて説明します。このアプローチは、受容体の力&gt;4.7pNをリアルタイムでマッピングし、時間の経過とともに力を積分することができます。...

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

このプロトコルは、高速細胞圧延接着中に接着イベントを画像化するために、接着フットプリントアッセイを実行するための実験的手順を提示する。...

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

前進するためには、成長コーンは外部環境に対して牽引力を発揮しなければならない。牽引力の生成はアクチンの動態およびクラッチの結合に依存する。本研究では、成長コーンアドバンスのためのアクチンダイナミクス、クラッチカップリングおよび牽引力を分析する方法について説明する。...

アクチンダイナミクス、クラッチカップリング、成長コーンアドバンスの牽引力の解析

RGD官能基化されたアビジン-ビオチンテザーを使用して、密度を調整可能な単一の移動血小板をイメージングするための詳細なプロトコルが提供されており、血小板がアビジン-ビオチン結合を破裂するのに十分な力を生成することが明らかになりました。...

RGD官能化アビジン-ビオチンテザーを用いた血小板遊走を研究するためのIn vitroアッセイ

この方法では、リガンドを提示する固定化されたDNA二本鎖を切断する細胞の傾向を測定して、相対的な細胞牽引力を報告します。破裂した蛍光オリゴを細胞内に送達し、フローサイトメトリーで解析して、細胞の機械的履歴を記録します。これにより、細胞メカノフェノタイピングの文脈で細胞力発生のハイスループット測定が可能になります。...

DNAテンションプローブの細胞内破壊と送達に基づく細胞メカノタイプのハイスループットフローサイトメトリー測定

学ぼう、TGTセンサープラットフォームを用いてEGFRとインテグリンの相互作用を定量し、Cos-7細胞における成長因子依存的な接着力と細胞伸展を解析する方法。この技術は細胞力学とシグナル伝達の理解に貢献します。

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

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