Name: リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解 による 病原体の不活化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶリボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解による病原体不活化法。Staphylococcus aureusやE.coliなどの病原菌を安全に抑制する技術で、創傷治療や食品衛生への応用が可能です。

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著者らは、Tak-Wah Wong博士とZong-Jhe Hsieh氏の実験支援に感謝している。

1. 光分解システムのセットアップ
<ol><li>図1に示すように、不透明なプラスチックカップ(8cm×7cm)の内側に6個の発光ダイオード(LED)(DC12V)を取り付けて、光分解システム31を確立する。</li>
	<li>反応物(下記参照)をガラス試験管(直径13 mm、高さ100 mm)に加え、 図1に示すようにチューブをカップの上部に固定します。実験セットアップを25 ± 3°Cの安定した温度の部屋に置きます。</li>
	<li>赤外線温度計による光分解反応全体のテストユニットの温度を監視および記録します。 注意: 図2 は、校正されたUV-Vis光学分光計を使用して記録された、青、緑、赤、および紫の光の発光スペクトルを示しています。研究で使用された青、緑、赤、紫のLEDライトの吸光度の最大値に対応する波長は、それぞれ465、529、632、および405nmです。LEDチップは、照射実験中に装置を加熱することができます。したがって、各実験の光反応システム全体は、温度が25±3°Cに一定に保たれた部屋に置かれました。</li>
</ol>2. FMNの光分解に及ぼす光波長の影響(図3)
<ol><li>100 mM リン酸カリウムバッファー(PB)中の0.1 mM FMN溶液を調製します(pH 7.8)。FMNサンプル(各3 mL)を青、緑、赤、または紫の光に10 W / m2 の強度で5分間さらします。コントロールとして、3 mLのFMN溶液を暗所に保ちます。</li>
	<li>UV/可視分光光度計を使用して、照射されたFMNサンプルの吸光度を250〜750nmの範囲で記録します。</li>
</ol>3.ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)還元法を検出<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;">します(図4)。
注:ここで使用したNBT還元法は、リボフラビン光反応のアッセイからわずかに変更されました。NBT還元法は、FMN光分解から発生するレベル<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">を評価するために使用される。光化学的に励起されたFMNは、まずL-メチオニンによってセミキノンに還元され、セミキノンは電子を酸素に供与して31を生じさせる<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">。生成された<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">状態では、NBTをホルマザンに還元し、ホルマザンは560nmに特徴的な吸光度を有する32。
<ol><li>109.3 mgのL-メチオニンを73.3 mLのPB(100 mM;pH 7.8)に加えます。溶液をボルテックスしてL-メチオニンを溶解する。</li>
	<li>L-メチオニンが完全に溶解したら、10 mgのNBT粉末と1.53 mLの0.117 mM FMNを溶液に加えます。適用した反応溶液(すなわち、FMN、L-メチオニン、およびNBTの混合物)1 mLごとに、FMN、メチオニン、およびNBTの最終濃度はそれぞれ2.4 x 10-6 M、1.0 x 10-2 M、および1.6 x 10-4 Mです。</li>
	<li>反応溶液(1 mL)を青色または紫色のLED光照射に10 W / m2 で1〜5分間さらします。</li>
	<li>光化学反応によって生成された種を(560 nmの吸光度から)検出 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> し、NBTを減少させ、ホルマザンを生成します。</li>
</ol>4. FMN光分解後の 黄色ブドウ球菌 の生存率(図5)
<ol><li> 黄色ブドウ球菌(BCRC 10451)のコロニーを培養プレートから15 mLスクリューキャップ試験管に採取した10 mLのLysogenyブロスに伝達します。振とう機で37°Cで16時間培養する。</li>
	<li>0.5 mLの培養液を1.5 mLの遠沈管に移します。滅菌水を遠沈管に加え、培養液を600 nmで0.5の光学密度(OD600)(~6 x 107 CFU/mL)に希釈します。</li>
	<li>培養液0.5 mLを1.5 mL遠沈管に移し、14,000 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントして細胞ペレットを得た。</li>
	<li>ステップ4.3と同様に得られた細胞ペレットに1 mLのFMN緩衝溶液(PB溶液30、60、および120 μM FMN)を加え、ボルテックスします。照射コントロールの場合は、PBを1mL単独で添加します。</li>
	<li>30 μM FMNとPBのみを含む生菌細胞液を各1 mLのガラス管に移し、紫色光を10 W/m2 で30分間照射します。</li>
	<li>30、60、120 μM FMNとPBのみを含む生菌細胞液を各1 mLのガラス管に移し、20 W/m2 の青色光を120分間照射します。120 μM FMNを含む生菌細胞溶液1 mLをガラス管に別のガラス管を設置し、20 W/m2 の青色光を60分間照射します。</li>
	<li>手順4.5および4.6の説明に従って試験管をセットアップし、厚いアルミホイルで覆います。これらのチューブはダークコントロールとして機能します。</li>
	<li>照射チャンバー(およびダークコントロール)を9〜1°Cの冷蔵室に保管し±30〜120分の照射期間中。 注:カップ内に配置されたLEDチップは、照射実験中に光反応システムを加熱する可能性があるため、LEDライトから放出される熱を無視することはできません。したがって、実験は9 ± 1°Cに維持された冷蔵室で実施されました。</li>
	<li>照射後、各反応液から0.2 mLをルリア寒天(LA)プレートに移します。L字型のガラス棒でプレート上に細菌を広げ、37°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>一晩の成長後の 黄色ブドウ球 菌の生存可能なプレート数と不活性化率を計算します。 注: 黄色ブドウ球菌 の不活性化率は、[1 -I / D] ×100%に等しい減少率として計算され、 I と D はそれぞれ照射されたサンプルとダークコントロールのCFUの数を示します。減少率は、不活性化率の負の値として定義されます。</li>
</ol>5. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;">黄色ブドウ球菌の検出(図6) 
<ol><li>ステップ4で説明したように 黄色ブドウ球菌 サンプルを準備します。</li>
	<li>サンプルの細菌密度を滅菌水で600 nmで0.5の光学密度に希釈します(OD600、~6 x 106 CFU/mL)。0.5 mLの培養液を1.5 mLの遠沈管に移します。14,000 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントして細胞ペレットを得た。</li>
	<li>75 mL PBに0.1093 gのL-メチオニン、0.1 gのNBT、および25 mLのFMN(400、240、または120 μM)を追加します。適用される反応物1mLごとに、FMN、メチオニン、およびNBTの最終濃度はそれぞれ100(60または30)x 10-6 M、7.3 x 10-3 M、および1.2 x 10-3 Mです。</li>
	<li>各反応剤溶液1mLを(すなわち、FMN濃度を変化させて)ステップ5.2のように得られた細胞ペレットに加える。紫色光を10W/m2 で10分間照射する。</li>
	<li>混合物を14,000 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントします。ペレットを1 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁して、還元されたNBTを抽出します。560 nmの吸光度から産生 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> 種を検出します。</li>
</ol>6.統計分析
<ol><li>データを3つの独立した検定の平均±標準偏差(SD)として表します。</li>
	<li>等分散2標本 t検定を適用して、2つの測定値が異なるかどうかを評価します。0.05&lt; p値は統計的に有意と見なされます。</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

光増感剤は、化合物の光化学反応を高めてROSを生成します。病原性微生物は、光増感剤の存在下で光照射することによって不活性化することができる。本研究では、外因性光増感剤FMNの紫色光照射により発生するROSに起因する 黄色ブドウ球菌 のaPDIを決定した。
図3に示すように、FMNの場合、紫色または青色光を用いた5分間の照射後に444nmの吸光度は有意に低下し、緑色または赤色光の照射下でのFMN吸光度に大きな変化はありません。NBT化は、電荷移動プロセス10、33を介したの形成<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">を決定するために使用される。著者らによる以前の研究では、青色、緑色、または赤色光照射下でFMNを使用して、NBT還元を使用した...

リボフラビン-5′-リン酸(FMN)は、リビチル側鎖のリボフラビン5'位でのリン酸化によって形成され、エネルギーを生成するための多数の細胞プロセスのためにすべてのフラボタンパク質によって必要とされます。また、人体のいくつかの機能のためのビタミンの役割を果たします1。FMNは、リボフラビン2よりも約200倍水に溶けやすい。
細菌の抗菌光力学的不活性化(aPDI)は、細菌耐性の様式に依存しないため、細菌3,4に対する耐性を制御するための効率的な方法です。臨床的には、aPDIは、多耐性菌による院内皮膚の感染を減少させるために軟部組織感染症を治療するために使用されます5,6,7,8,9。aPDIはまた、活性酸素種(ROS)を生成することによって細胞死を引き起こす。スーパーオキシドラジカル()、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">•OH)、およびペルオキシルラジカルなどのROSは、活性酸素10,11,12を含み、通常は反応性13であるフリーラジカルまたは分子です。ROSによって引き起こされるDNA損傷と同様に、膜過酸化および内皮細胞の破壊もまた、細胞12におけるROSに起因する有害な生化学反応である。
病原性細菌に対するaPDIの使用は、塩化メチルチオニニウム14、PEI-ce6コンジュゲート15、ポルフィリン16、二酸化チタン17、トルイジンブルーO18、および酸化亜鉛ナノ粒子19などの化合物の存在下で微生物を不活性化するための可視光源またはUV光源を含む。トルイジンブルーOおよびメチレンブルーはフェノチアジニウム色素であり、メチレンブルーは毒性を有する。酸化亜鉛ナノ粒子とUV照射は、健康と環境への悪影響に関連しています。そのため、可視照射下での光分解による信頼性が高く、安全で、単純な光増感剤の開発は、さらなる研究に値します。
微量栄養素であるリボフラビンまたはFMNは毒性がなく、実際に食品の製造または給餌に使用されます20。FMNとリボフラビンはどちらも光照射に非常に敏感です2。UV1,2,21,22,23および青色光照射10,24の下で、これら2つの化合物は励起状態を達成する。光分解によって生成される活性化リボフラビンまたはFMNは、そのトリプレット状態に促進され、ROSが同時に生成されます2,25。Kumarらは、UV光によって活性化されたリボフラビンが病原性微生物におけるDNAのグアニン部分への傷害の増加を選択的に引き起こすことを報告した26。UV光の照射下で、光力学的に活性化されたリボフラビンは、二本鎖DNAにおいて、酸化ストレスのバイオマーカーである8-OH-dGの生成を促進することが実証されている27。黄色ブドウ球菌および大腸菌は、リボフラビンまたはFMN光分解中にROSによって不活性化されることが報告されています10、24、28。著者らによる以前の研究では、リボフラビンとFMNが関与する光分解反応が、クリスタルバイオレット、トリアリールメタン染料、および生成<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">する抗菌剤を減少させ、クリスタルバイオレット28の抗菌能力のほとんどを排除することが示されました。フラビンアデニンジヌクレオチドまたはFMNに青色光を照射すると、得られたROSは、インビトロでの中毒のためにHeLa細胞にアポトーシスを生じます29。リボフラビンの存在下での光化学的処理を用いて、Cuiらはそれらの増殖およびサイトカイン産生を阻害することによってリンパ球を不活性化した30。
リボフラビンの光分解は、UV 10,24による血液病原体の不活性化に使用されるが、UV光照射下で血液成分が損なわれ得る30。また、UVに曝露された血小板は、それらの膜上の活性化マーカーP-セレクチンおよびLIMP-CD63の性能を徐々に増強することが報告されています。UVおよび高強度照射の細胞毒性を調べる必要があり、可視光を含むFMN光反応中に複雑で安全な光増感剤が非常に役立ちます。
より短い波長の光はより多くのエネルギーを持ち、細胞に深刻な損傷を引き起こす可能性がはるかに高くなります。しかしながら、適切な光増感剤の存在下では、低強度の紫色光の照射は病原性微生物を阻害することができる。したがって、紫色光を照射したときのFMNによる光増感と生成は、FMN光分解からのROSが細菌の <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> 不活性化を増加させる経路を決定するために研究することが重要です。
抗菌剤の制御は一般的な問題であり、新しい抗生物質の開発には数十年かかることがよくあります。紫色光を照射した後、FMNによって媒介される光不活性化は、環境病原菌を全滅させることができる。この研究は、FMN光分解を促進し、したがってaPDIを生成する<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">ために紫色光を使用するin vitroで効果的な抗菌プロトコルを提示します。黄色ブドウ球菌の微生物生存率は、FMN誘発性aPDIの実現可能性を決定するために使用されます。

<table><tbody><tr><td>青、緑、赤のLEDライト</td><td>Vita LED Technologies Co., 台南, 台湾</td><td></td><td>DC 12 V 5050</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>190186</td><td></td></tr><tr><td>赤外線温度計</td><td>Raytek Co. Santa Cruz, CA</td><td>MT4</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Difco Co., NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>1.05707</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Bio Basic, Inc. カナダ オンタリオ</td><td></td><td></td>州マーカム</tr><tr><td>Power supply</td><td>China tech Co., New Taipei City, Taiwan</td><td>YP30-3-2</td><td></td></tr><tr><td>リボフラビン 5&prime;-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R7774</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>New England BioLabs, Inc. マサチューセッツ州</td><td></td><td></td>イプスウィッチ</tr><tr><td>ソーラーパワーメーター</td><td>Tenmars Electronics Co., 台北, 台湾</td><td>TM-207</td><td></td></tr><tr><td>黄色ブドウ球菌亜種 黄色ブドウ球</td>菌<td>バイオリソースコレクション研究センター(BCRC)、新竹市</td>、<td>台湾 10451</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis光学分光計</td><td>Ocean Optics、ダニーデン、フロリダ州</td><td>USB4000</td><td></td></tr><tr><td>紫外可視分光光度計</td><td>日立ハイテクサイエンス株式会社、東京、日本</td><td>U-2900</td><td></td></tr><tr><td>Violet LED</td><td>Long-hui Electronic Co., LTD,東莞, 中国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解 による 病原体の不活化

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

リボフラビン-5'-リン酸(またはフラビンモノヌクレオチド;FMN)は可視光に敏感です。活性酸素種(ROS)を含む様々な化合物は、可視光の照射によるFMN光分解から生成することができる。FMN光分解から発生するROSは、黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)などの病原菌を含む微生物に有害です。本稿では、例として、可視光照射下でFMNが関与する光化学反応を介して黄色ブドウ球菌を不活性化するためのプロトコルを紹介します。FMN光分解中に生成されたスーパーオキシドラジカルアニオン()は、ニトロブルーテトラゾリウム(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;">NBT)還元を介して評価されます。反応性<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;">種に起因する黄色ブドウ球菌の微生物生存率を使用して、プロセスの有効性を決定しました。細菌の不活化率はFMN濃度に比例します。紫色光は青色光照射よりも黄色ブドウ球菌の不活性化に効率的ですが、赤色または緑色の光はFMN光分解を促進しません。本稿では、衛生プロセスのための簡単で安全な方法としてのFMN光分解を示しています。

FMNに対する光波長の影響 青、緑、赤、紫のLEDを使用して照射された0.1 mM FMNの吸光度スペクトルを 図3に示します。ダークコントロールのFMNには2つのピーク(372nmと444nm)があります。緑と赤の光は、スペクトルの変化が重要ではないため、効果はありません。一方、444 nmのFMNの吸光度は、10 W/m2 で5分間青色光照射後、紫色光をそれぞれ約19%、34%減少させ、青色/紫色光の照射がFMN光分解を増加させることが示唆された。
の検出 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq10.jpg" style="margin: auto;">青色または紫色の光を使用して照射されたFMNから NBT化は、32の形成<img alt="Equation...

ここでは、フラビンモノヌクレオチド(FMN)の光分解時に生成される活性酸素種を低強度の青色および紫色光照射下で不活化する病原菌を不活化するプロトコルを提示する。FMN光分解は、衛生プロセスのための簡単で安全な方法であることが実証されています。

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

このプロトコルは、可視紫色光照射を使用してフラビンモノヌクレオチド光分解を誘導します。これにより、黄色ブドウ球菌や大腸菌などの病原菌を阻害する大量のフリーラジカルが生成されます。適切な光増感剤としてフラビンモノヌクレオチドをテストしました。このプロトコルでは、安全で高価な機器を必要としない可視紫色光を使用します。この方法は、照明用の光ファイバーを挿入することにより、損傷した皮膚または感染した皮下組織の治療に使用できます。また、食品産業における衛生慣行にも適用できます。手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるTang-Yu Chenです まず、不透明なプラスチックカップの内側にそれぞれ12ボルトの6つの発光ダイオードを取り付けます。直径13ミリメートル、高さ100ミリメートルのガラス試験管を取り、反応物をチューブに加えます。チューブをカップの上部に固定し、このセットアップを摂氏25度3度の一定温度に置きます。赤外線温度計による光分解反応全体のテストユニットの温度を監視および記録します。次に、pH 7.8で100ミリモルのリン酸カリウム緩衝液中の0.1ミリモルFMN溶液を調製します。3ミリリットルのFMNサンプルをそれぞれ青、緑、赤、または紫の光に5分間さらします。並行して、コントロールとして3ミリリットルのFMN溶液を暗所に保ちます。サンプルを紫外可視分光光度計に入れ、照射されたサンプルの吸光度を250〜750ナノメートルの範囲で記録します。スーパーオキシドラジカルの検出を準備するには、まずpH 7.8で109.3ミリグラムのL-メチオニンを73.3ミリリットルの100ミリモルリン酸緩衝液に加えます。溶液に、10ミリグラムのNBT粉末と1.5ミリリットルの0.117ミリモルFMNを加える。1ミリリットルの反応液を青色または紫色のLEDライトに1〜5分間さらします。516ナノメートルの吸光度を記録して、NBTの光化学反応によって生成されるホルマザンを検出します。黄色ブドウ球菌のコロニーを、15ミリリットルのスクリューキャップ付き試験管内の10ミリリットルのリソゲンブロスに接種します。シェーカーで16時間摂氏37度で培養物を育てます。0.5ミリリットルの培養液を1.5ミリリットルの遠沈管に移します。滅菌水を加えて、培養液を600ナノメートルで0.5の光学密度に希釈します。次に、0.5ミリリットルの培養物を1.5ミリリットルの遠沈管に移します。14, 000 Gで10分間遠心分離し、上清をデカントします。1ミリリットルのFMN緩衝溶液をセルペレットとボルテックスに加えます。照射対照のために、1ミリリットルのリン酸緩衝液を加える。30マイクロモルのFMNとリン酸緩衝液を含む1ミリリットルの細菌細胞溶液をガラス管に移します。紫色の光の下で10ワット/平方メートルで30分間放射線のためにそれらを置きます。次に、30-60-および120-マイクロモルのFMNとリン酸緩衝液を含む1ミリリットルの細菌細胞溶液をガラス管に移します。1平方メートルあたり20ワットで120分間青色光を照射します。また、1ミリリットルの120マイクロモルFMNを入れたチューブに60分間照射する。照射後、反応液0.2ミリリットルをルリア寒天プレートに加える。L字型のガラス棒を使用して溶液を広げ、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、黄色ブドウ球菌の生存可能なプレート数と不活性化率を計算します。前述のように黄色ブドウ球菌サンプルを調製し、細胞ペレットを得た。75ミリリットルのリン酸緩衝液に、0.1093グラムのL-メチオニン、0.1グラムのNBT、および25ミリリットルのFMN溶液を加える。FMN濃度を変化させた各反応液1ミリリットルをセルペレットと渦に加えます。紫色光の下で10ワット/平方メートルの溶液を10分間照射します。混合物を14, 000 Gで10分間遠心分離し、上清をデカントします。ペレットを1ミリリットルのジメチルスルホキシドに再懸濁して、還元されたNBTを抽出します。560ナノメートルの吸光度を記録します。FMNに緑光と赤光を照射しても、暗対照と比較して372ナノメートルと444ナノメートルのピークに影響は見られませんでしたが、青光と紫色光では444ナノメートルのFMNの吸光度の低下が観察され、光分解の増加が示されました。青色または紫色光下でのFMN光分解中に形成されるスーパーオキシドラジカルの検出は、NBT還元を使用して行われました。FMNの光化学的効果は照射時間に依存していた。青色または紫色の光照射を用いたFMN光分解は、黄色ブドウ球菌の有意な不活性化をもたらした。青色光照射では線量依存的な不活性化が観察され、120マイクロモルのFMNでは97%の不活性化が達成されました。紫色光下では、黄色ブドウ球菌で96%の不活化率が達成され、30マイクロモルのFMNは細菌の不活性化に対してより高い有効性を示しました。NBTの減少は、黄色ブドウ球菌における紫色光下でのFMNの光分解効果がFMN濃度に比例することを示した。未処理条件では、スーパーオキシドラジカルの存在量が少ないほど560ナノメートルの吸光度が低いことが示されましたが、FMN処理の吸光度値が高いほど、スーパーオキシドラジカルが豊富に生成され、光化学的効果が増加しました。優れたLED光源を用意することが重要です。紫外線は危険である可能性があるため、紫色光領域のスペクトル幅は、UV吸収との重なりを避けるために狭くする必要があります。手順に続いて、他の化合物、例えばテトラサイクリン、ドキシサイクリン、カテキン、およびFMNと同様の光分解について試験することができる。

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