標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化
February 1st, 2022
CUT&RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。
CUT&RUNはクロマチン上のタンパク質の局在を決定するための強力な技術であり、ここではこの技術の単一細胞バージョンを手動の96ウェル形式で説明します。ChIP-seqのようなほとんどのタンパク質局在化技術は、高い細胞入力を必要とし、完了までに約3日かかります。CUT&RUNは、高信号と低バックグラウンドのため、ローセルおよびシングルセルアプリケーション向けに最適化されており、1日で完了できます。
この技術は、ほぼすべての生物学的サンプルに適用でき、貴重な患者サンプルなどの希少で存在量の少ないサンプルにおける因子の局在を決定するのに特に強力であると想定しています。単一細胞実験を行う前に、抗体と技術を多数の非貴重細胞でテストしてください。この実験の主な限界は、堅牢な抗体への依存性です。
手順を実演しているのは、私の研究室の経験豊富な研究専門家であるサンタナ・ラルドです。単一細胞を選別し、ビーズに核を結合させた後、96ウェルプレートを96ウェル磁気ラックの上に置き、ビーズが最低5分間結合するのを許します。その後、上澄み液を取り出して廃棄する。
100マイクロリットルのブロッキングバッファーを核結合ビーズに加え、穏やかなピペッティングで混合し、室温で5分間インキュベートする。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、上清を最低 5 分間除去します。その後、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して廃棄する。
磁気ラックからプレートを取り出し、穏やかなピペッティングで反応ごとにビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。プレートを 96 ウェル磁気ラックに戻し、上清が除去されるのを待ってから、上清を取り出して廃棄します。穏やかなピペッティングで反応ごとに25マイクロリットルの洗浄バッファーにビーズを再懸濁する。
反応ごとに25マイクロリットルの洗浄バッファーを小分けして一次抗体マスター混合物を作り、次いで反応ごとに0.5マイクロリットルの抗体を加える。25.5マイクロリットルの抗体洗浄バッファーミックスを加え、続いて、目的のタンパク質を標的とする抗体で処理されている各サンプルに穏やかにピペッティングを行った。室温で1時間インキュベートする。
その後、サンプルを再び96ウェル磁気ラックに戻します。上清が透明になったら、ビーズを邪魔することなく取り除いて捨ててください。磁気ラックからプレートを取り出した後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、ピペッティングで再懸濁します。
プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、前述のように上清を捨てた後、各サンプルを25マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。プロテイン A MNase マスター混合物は、25 マイクロリットルの洗浄バッファーと、反応ごとに最適化された量のプロテイン A MNase を加えて作成します。25マイクロリットルのプロテインA MNaseマスター混合物を、対照試料を含む各試料に加える。
試料を室温で30分間インキュベートする。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置きます。上澄み液を最低5分間クリアしてから、ビーズを乱すことなく上清を取り出して捨てます。
磁気ラックからプレートを取り出した後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、穏やかなピペッティングで再懸濁します。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、前述のように上清を捨てます。その後、磁気ラックからサンプルを取り出し、穏やかなピペッティングによってビーズを50マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁する。
氷水混合物中でサンプルを摂氏0度まで5分間平衡化してから、氷水浴からサンプルを取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して1マイクロリットルの100ミリモルの塩化カルシウムを加える。大容量のマルチチャンネルピペットを使用して穏やかなピペッティングで3〜5回よく混ぜ合わせ、サンプルを摂氏0度に戻します。
プレートが氷水浴に戻ったらすぐに10分のタイマーを開始します。2倍の濃度のRSTOP+を含む溶液50マイクロリットルをピペッティングして反応を停止し、塩化カルシウムと同じ順序で緩衝液を各ウェルに添加した。サンプルを摂氏37度で20分間インキュベートする。
プレートを16, 000倍Gで4°Cで5分間回転させます。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置きます。上清を最低5分間クリアします。
その後、上清を新鮮な96ウェルプレートに移し、ビーズを捨てる。DNA抽出のために、10%SDSの1マイクロリットルと1ミリリットルのプロテイナーゼKあたり0.83マイクロリットルの20ミリグラムを各サンプルに加え、穏やかなピペッティングによってサンプルを混合する。サンプルを摂氏70度で10分間インキュベートする。
プレートを室温に戻します。46.6マイクロリットルの5モルの塩化ナトリウムと90マイクロリットルの50%PEG4000を加え、穏やかなピペッティングで混合する。各サンプルに33マイクロリットルのポリスチレンマグネタイトビーズを加え、室温で10分間インキュベートする。
プレートを磁気ラックの上に置き、上澄み液を約5分間透明にします。その後、ビーズを乱すことなく上澄み液を慎重に捨てる。ビーズを乱すことなく、150マイクロリットルの80%エタノールで2回すすいでください。
プレートを1000倍Gで30秒間短時間回転させる。プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、ビーズを乱すことなく残留エタノールをすべて除去します。サンプルを約2〜5分間空気乾燥させます。
ビーズをpH8の10ミリモルTRIS塩酸塩37.5マイクロリットルに再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。プレートを磁気ラックに戻し、ビーズが 5 分間結合するのを許します。36.5マイクロリットルの上清を新鮮なサーモサイクラー対応の96ウェルプレートに移し、ビーズを捨てる。
細胞品質評価を実施した後、細胞の外観およびパーセンテージを調べ、低品質の胚性幹細胞を使用すべきではないことを実証した。単一細胞ソーティングをヘキスト33342染色を用いて行い、試験細胞を計数して、各ウェルに0個または1個の細胞が見出されることを確認した。アガロースゲル分析により、低分子量ラダーと個々の単一細胞uliCUT&RUNライブラリーが明らかになった。
最適でないライブラリー分析および最適ライブラリー分析は、低分子量はしご、非効率なムナーゼ消化による最適でないライブラリー、および適切な消化を伴う成功したライブラリーを示す。フラグメントアナライザー分布は、単一細胞の予想されるサイズが150〜500塩基対の範囲であることを示している。しかし、大きなタンパク質では、DNAは約270塩基対を有するであろう。
高細胞数または陰性対照を描写した単一遺伝子座ゲノムブラウザと単一細胞CTCF uliCUT&RUNを用いたタンパク質占有率は、単一細胞が高細胞uliCUT&RUNと同様に、主に強いピークを表すことを明らかにした。単一細胞CTCFまたはネガティブコントロールのヒートマップは、細胞内の確立されたCTCF結合部位に直接かかる読み取り濃縮の明確なパターンを明らかにした。1次元ヒートマップは、単一細胞ライブラリーの確立されたCTCF結合部位よりも、周囲の領域および抗体のない対照と比較して高い読み取り密度を示し、確立された結合部位における抗体特異的濃縮を実証する。
氷水浴上でビーズ結合核を平衡化し、塩化カルシウム添加時にサンプルを過熱させないことは、クロマチンの過剰消化を防ぐために重要です。
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概要
CUT&RUNは、クロマチン上のタンパク質局在を決定するための強力な技術であり、手動の96ウェル形式で単一細胞分析を容易にします。このプロトコルは、ChIP-seqなどの従来の方法と比較して入力要件を最小限に抑え、1日以内に完了できるため、希少および低頻度の生物学的サンプルへの応用を可能にします。
主要な研究要素
研究領域
- クロマチン生物学
- 単一細胞分析
- タンパク質局在技術
背景
- CUT&RUNは従来の方法と比較して、高い信号と低い背景を提供します。
- 正確な結果を得るためには、堅牢な抗体に大きく依存しています。
- 貴重な患者サンプルや希少細胞の分析に理想的です。
使用した方法
- 手動96ウェル形式のCUT&RUN
- Hoechst 33342染色による単一細胞ソーティング
- 免疫沈降後のタンパク質の抽出と分析
主な結果
- このプロトコルは、単一細胞における効果的なタンパク質局在の決定を可能にします。
- 低品質の胚性幹細胞における因子の局在の成功的な同定。
- 既存の技術と比較して時間効率の良い手順。
結論
- この研究は、単一細胞レベルでのクロマチン上のタンパク質占有を分析する新しいアプローチを紹介しています。
- この技術は、特に臨床応用において、将来の生物学的研究に大きな可能性を秘めています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single-cell uliCUT&RUN enables precise mapping of chromatin-bound factors in ultra-low input samples, addressing a critical bottleneck in early discovery and target validation. This approach supports predictive confidence in regulatory element identification and facilitates mechanistic de-risking for rare or precious biological samples, including those from patient-derived material. Its rapid, scalable workflow positions it as a strategic asset for portfolio triage and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of protein-DNA interactions at the single-cell level for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying factor localization in rare or heterogeneous cell populations.
- Facilitates predictive confidence in regulatory element assignment and pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromatin profiles for downstream screening of transcription factors and chromatin modifiers.
- Delivers quantitative, reproducible readouts suitable for assay standardization and platform scalability.
- Enables reliable evaluation of antibody specificity and sample quality prior to large-scale screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin factor localization with disease-relevant biomarkers in rare or patient-derived samples.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting low-input and single-cell workflows.
- Reduces biological risk in translational studies by enabling robust, quantitative chromatin profiling.
Pipeline & Workflow Integration
uliCUT&RUN integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven chromatin mapping from early discovery through lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping protein-DNA interactions in single cells.
- Screening: Provides quantitative, reproducible chromatin occupancy data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-resolution, antibody-specific enrichment profiles for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and risk-adjusted advancement in rare or precious samples.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for chromatin profiling across diverse biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible workflows for low-input and single-cell samples.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust data from limited material.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell handling, chromatin biology, and antibody validation.
- Demands access to 96-well magnetic racks, multichannel pipettes, and fragment analysis instrumentation.
- Necessitates rigorous antibody specificity testing and cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptable to various cell types but dependent on sample quality and antibody performance.
- Limited by antibody robustness and potential for over-digestion if temperature control is not maintained.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:17
Pre-Blocking of Samples to Prevent Early Digestion by MNase
1:46
Addition of Primary Antibody
3:09
Addition of pA-MNase or pA/G-MNase
4:04
Directed DNA Digestion
5:04
Sample Fractionation and DNA Extraction
7:09
Results: Protein Localization on Chromatin Using Single Cell uliCUT&RUN
8:54
Conclusion
