標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

CUT&RUNはクロマチン上のタンパク質の局在を決定するための強力な技術であり、ここではこの技術の単一細胞バージョンを手動の96ウェル形式で説明します。ChIP-seqのようなほとんどのタンパク質局在化技術は、高い細胞入力を必要とし、完了までに約3日かかります。CUT&RUNは、高信号と低バックグラウンドのため、ローセルおよびシングルセルアプリケーション向けに最適化されており、1日で完了できます。

この技術は、ほぼすべての生物学的サンプルに適用でき、貴重な患者サンプルなどの希少で存在量の少ないサンプルにおける因子の局在を決定するのに特に強力であると想定しています。単一細胞実験を行う前に、抗体と技術を多数の非貴重細胞でテストしてください。この実験の主な限界は、堅牢な抗体への依存性です。

手順を実演しているのは、私の研究室の経験豊富な研究専門家であるサンタナ・ラルドです。単一細胞を選別し、ビーズに核を結合させた後、96ウェルプレートを96ウェル磁気ラックの上に置き、ビーズが最低5分間結合するのを許します。その後、上澄み液を取り出して廃棄する。

100マイクロリットルのブロッキングバッファーを核結合ビーズに加え、穏やかなピペッティングで混合し、室温で5分間インキュベートする。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、上清を最低 5 分間除去します。その後、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して廃棄する。

磁気ラックからプレートを取り出し、穏やかなピペッティングで反応ごとにビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。プレートを 96 ウェル磁気ラックに戻し、上清が除去されるのを待ってから、上清を取り出して廃棄します。穏やかなピペッティングで反応ごとに25マイクロリットルの洗浄バッファーにビーズを再懸濁する。

反応ごとに25マイクロリットルの洗浄バッファーを小分けして一次抗体マスター混合物を作り、次いで反応ごとに0.5マイクロリットルの抗体を加える。25.5マイクロリットルの抗体洗浄バッファーミックスを加え、続いて、目的のタンパク質を標的とする抗体で処理されている各サンプルに穏やかにピペッティングを行った。室温で1時間インキュベートする。

その後、サンプルを再び96ウェル磁気ラックに戻します。上清が透明になったら、ビーズを邪魔することなく取り除いて捨ててください。磁気ラックからプレートを取り出した後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、ピペッティングで再懸濁します。

プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、前述のように上清を捨てた後、各サンプルを25マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。プロテイン A MNase マスター混合物は、25 マイクロリットルの洗浄バッファーと、反応ごとに最適化された量のプロテイン A MNase を加えて作成します。25マイクロリットルのプロテインA MNaseマスター混合物を、対照試料を含む各試料に加える。

試料を室温で30分間インキュベートする。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置きます。上澄み液を最低5分間クリアしてから、ビーズを乱すことなく上清を取り出して捨てます。

磁気ラックからプレートを取り出した後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、穏やかなピペッティングで再懸濁します。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、前述のように上清を捨てます。その後、磁気ラックからサンプルを取り出し、穏やかなピペッティングによってビーズを50マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁する。

氷水混合物中でサンプルを摂氏0度まで5分間平衡化してから、氷水浴からサンプルを取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して1マイクロリットルの100ミリモルの塩化カルシウムを加える。大容量のマルチチャンネルピペットを使用して穏やかなピペッティングで3〜5回よく混ぜ合わせ、サンプルを摂氏0度に戻します。

プレートが氷水浴に戻ったらすぐに10分のタイマーを開始します。2倍の濃度のRSTOP+を含む溶液50マイクロリットルをピペッティングして反応を停止し、塩化カルシウムと同じ順序で緩衝液を各ウェルに添加した。サンプルを摂氏37度で20分間インキュベートする。

プレートを16, 000倍Gで4°Cで5分間回転させます。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置きます。上清を最低5分間クリアします。

その後、上清を新鮮な96ウェルプレートに移し、ビーズを捨てる。DNA抽出のために、10%SDSの1マイクロリットルと1ミリリットルのプロテイナーゼKあたり0.83マイクロリットルの20ミリグラムを各サンプルに加え、穏やかなピペッティングによってサンプルを混合する。サンプルを摂氏70度で10分間インキュベートする。

プレートを室温に戻します。46.6マイクロリットルの5モルの塩化ナトリウムと90マイクロリットルの50%PEG4000を加え、穏やかなピペッティングで混合する。各サンプルに33マイクロリットルのポリスチレンマグネタイトビーズを加え、室温で10分間インキュベートする。

プレートを磁気ラックの上に置き、上澄み液を約5分間透明にします。その後、ビーズを乱すことなく上澄み液を慎重に捨てる。ビーズを乱すことなく、150マイクロリットルの80%エタノールで2回すすいでください。

プレートを1000倍Gで30秒間短時間回転させる。プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、ビーズを乱すことなく残留エタノールをすべて除去します。サンプルを約2〜5分間空気乾燥させます。

ビーズをpH8の10ミリモルTRIS塩酸塩37.5マイクロリットルに再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。プレートを磁気ラックに戻し、ビーズが 5 分間結合するのを許します。36.5マイクロリットルの上清を新鮮なサーモサイクラー対応の96ウェルプレートに移し、ビーズを捨てる。

細胞品質評価を実施した後、細胞の外観およびパーセンテージを調べ、低品質の胚性幹細胞を使用すべきではないことを実証した。単一細胞ソーティングをヘキスト33342染色を用いて行い、試験細胞を計数して、各ウェルに0個または1個の細胞が見出されることを確認した。アガロースゲル分析により、低分子量ラダーと個々の単一細胞uliCUT&RUNライブラリーが明らかになった。

最適でないライブラリー分析および最適ライブラリー分析は、低分子量はしご、非効率なムナーゼ消化による最適でないライブラリー、および適切な消化を伴う成功したライブラリーを示す。フラグメントアナライザー分布は、単一細胞の予想されるサイズが150〜500塩基対の範囲であることを示している。しかし、大きなタンパク質では、DNAは約270塩基対を有するであろう。

高細胞数または陰性対照を描写した単一遺伝子座ゲノムブラウザと単一細胞CTCF uliCUT&RUNを用いたタンパク質占有率は、単一細胞が高細胞uliCUT&RUNと同様に、主に強いピークを表すことを明らかにした。単一細胞CTCFまたはネガティブコントロールのヒートマップは、細胞内の確立されたCTCF結合部位に直接かかる読み取り濃縮の明確なパターンを明らかにした。1次元ヒートマップは、単一細胞ライブラリーの確立されたCTCF結合部位よりも、周囲の領域および抗体のない対照と比較して高い読み取り密度を示し、確立された結合部位における抗体特異的濃縮を実証する。

氷水浴上でビーズ結合核を平衡化し、塩化カルシウム添加時にサンプルを過熱させないことは、クロマチンの過剰消化を防ぐために重要です。