Name: 標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぼう、96ウェル形式の単一細胞CUT&RUN法を用いたクロマチン上のタンパク質局在解析。低細胞入力・高感度・短時間で希少サンプルや臨床検体の解析に応用可能な革新的エピジェネティクス技術です。

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この原稿の以前のバージョンを読んでコメントしてくれたHainer Labのメンバーに感謝します。このプロジェクトでは、ピッツバーグのUPMC小児病院にあるピッツバーグ大学健康科学シーケンシングコアで入手可能なNextSeq500を使用して、ディレクターのウィリアム・マクドナルドに特別な感謝を込めてシーケンシングを行いました。この研究は、提供されたコンピュータリソースを通じて、ピッツバーグ大学研究コンピューティングセンターによって部分的に支援されました。この研究は、国立衛生研究所助成金番号R35GM133732(S.J.H.宛)の支援を受けた。

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li>
<li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li>
<li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III%2C+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li>
<li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-tube+linear+DNA+amplification+%28LinDA%29+for+robust+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li>
<li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li>
<li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232(2013).</li>
<li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cChIP-seq%3A+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083(2015).</li>
<li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChlC+and+ChEC%3B+genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li>
<li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT%26RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li>
<li>Zheng, X. -Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
</ol>

著者らは、このプロジェクトに関連する競合する利益を宣言しない。

CUT&RUNは、クロマチン上のタンパク質の局在を決定するための効果的なプロトコルです。他のプロトコルと比較して、1)高い信号対雑音比、2)高速プロトコル、3)必要なシーケンシング読み取りカバレッジが低いため、コスト削減につながるなど、多くの利点があります。プロテインA-またはプロテインA/G-MNaseを使用することで、CUT&RUNを利用可能な任意の抗体で適用することができます。したがって、多くのタンパク質を迅速かつ容易にプロファイリングする可能性を秘めています。しかし、クロマチン上のタンパク質プロファイリングに対する単一細胞への適応は、特に単一細胞トランスクリプトミクス(すなわち、scRNA-seq)と比較すると、RNAに対するDNAのコピー数が少ないため(DNAのコピーが2〜4コピーであるのに対し、数千のRNAコピーが可能である)ため、困難であった。
上記で詳述したプロトコルでは、いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。まず、細胞の適切な選別は細胞(または組織)の種類に依存しており、正確な選別には注意が必要です。実験の前に、単一細胞選別が装置でどの程度効果的である...

多くの核タンパク質は、クロマチンと相互作用してDNAテンプレート化された活性を促進または防止することによって機能する。これらのクロマチン相互作用タンパク質の機能を決定するためには、これらのタンパク質が結合しているゲノム位置を特定することが重要です。1985年の開発以来、クロマチン免疫沈降法(ChIP)は、タンパク質がクロマチン1,2に結合する場所を特定するためのゴールドスタンダードとなっています。従来のChIP技術は、以下の基本的なワークフローを有する:細胞を回収し、架橋し(通常はホルムアルデヒドで)、クロマチンを剪断し(通常は架橋を必要とする過酷な超音波処理法で)、目的のタンパク質を標的とする抗体を用いて免疫沈降させ、続いて二次抗体(アガロースまたは磁気ビーズに結合)、架橋を逆転させ、 タンパク質とRNAを消化してDNAを精製し、このChIP富化DNAを分析のテンプレートとして使用します(放射性標識プローブ1、2、qPCR3、マイクロアレイ5、6、またはシーケンシング4を使用)。マイクロアレイと超並列ディープシーケンシングの出現により、ChIPチップ5,6およびChIP-seq4が最近開発され、クロマチン上のタンパク質局在のゲノムワイドな同定が可能になりました。ChIPの架橋は、ChIP-exo7およびChIP-nexus8による解像度の大幅な進歩により、その出現以来強力で信頼性の高い技術でした。ChIP-seqの開発と並行して、ChIP(N-ChIP)のネイティブ(非架橋)プロトコルが確立されており、従来の架橋ChIP技術9で行われる超音波処理とは対照的に、クロマチンを断片化するためにヌクレアーゼ消化(しばしばミクロコッカスヌクレアーゼまたはMNaseを使用する)を利用する。しかし、ChIPとN-ChIPの両方の架橋技術に対する大きな欠点の1つは、実験操作後のDNA収率が低いため、高い細胞数が必要であることです。したがって、近年では、低セル入力のためのChIP技術の最適化に向けて多くの努力が払われています。これらの努力の結果、適用性と入力要件が異なる多くの強力なChIPベースの技術が開発されました10,11,12,13,14,15,16,17,18。しかし、単一細胞ChIP-seqベースの技術は、特に非ヒストンタンパク質については欠けていた。
2004年、クロマチン内因性切断(ChEC)およびクロマチン免疫切断(ChIC)19と呼ばれるクロマチンのタンパク質占有率を決定するための代替技術が開発されました。これらの単一遺伝子座技術は、目的のタンパク質(ChEC)またはプロテインA(ChIC)のいずれかへのMNaseの融合を利用して、目的のタンパク質に隣接するDNAを直接切断します。近年、ChECとChICの両方がクロマチン(それぞれChEC-seqとCUT&RUN)上のゲノムワイドタンパク質プロファイリングに最適化されています20,21。ChEC-seqは因子の局在を決定するための強力な技術ですが、各標的に対してMNase融合タンパク質を開発する必要がありますが、ChICとそのゲノムワイドバリエーションであるCUT&RUNは、目的のタンパク質に向けられた抗体(ChIPと同様に)と組換えプロテインA-MNaseに依存しており、プロテインAは抗体のIgG定常領域を認識できます。代替として、より広い範囲の抗体定常領域を認識できる融合プロテインA/プロテインG-MNase(pA/G-MNase)が開発されている22。CUT&RUNは、クロマチンゲノムワイドでのタンパク質局在を決定するためのChIP-seqの代替手段として急速に普及しています。
超低入力CUT&RUN(uliCUT&RUN)は、低セル入力とシングルセル入力の使用を可能にするCUT&RUNのバリエーションであり、201923で説明されました。ここでは、手動の96ウェルフォーマット単一セルアプリケーションのための方法論が説明される。uliCUT&RUNの開発以来、ヒストンプロファイリングのための2つの選択肢であるCUT&TagとiACT-seqが開発され、ヒストンタンパク質の堅牢で高度に並列なプロファイリングが提供されていることに注意することが重要です24,25。さらに、scCUT&Tagは、単一細胞内の複数の因子のプロファイリング(multiCUT&Tag)および非ヒストンタンパク質への適用のために最適化されている26。CUT&RUNは、細胞ソーターと標準機器にアクセスできる分子生物学ラボでuliCUT&RUNを実行できる低入力ChIP-seqの魅力的な代替手段を提供します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 透明マイクロチューブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90410</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ マグネットラック</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ対応冷遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5404000537</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 滅菌組織培養プレート</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 DNA Ligase buffer</td><td>新製品England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブVWR</td><td></td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1X TE</td><td>バッファーThermoFisher Scientific</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro;L PCR チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>2X quick ligase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>Ligase Buffer</td></tr><tr><td>5X KAPA HiFi buffer</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>5X high fidelity PCR buffer</td></tr><tr><td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>96-well magnetic rack</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027 or 12331D</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td>ポリスチレンマグネタイトビーズ;AMPure XPビーズのロット間にばらつきが生じる可能性があるため、AMPureビーズ溶液をキャリブレーションすることをお勧めします。メーカーを参照してください。S instructions</td></tr><tr><td>Antibody to Interest</td> Protein <td>vary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td>ConA-conjugated 常磁性マイクロスフェア</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62905AP</td><td></td></tr><tr><td>セルソーター</td><td>BD FACSAria II セルソーター</td><td></td><td>トレーニングが必要</td></tr><tr><td>細胞培養用の細胞特異的培地</td><td>クロ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロホルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C298-500</td><td>クロロホルムは、飲み込むと皮膚を刺激し、有害です。手袋、白衣、ゴーグルを使用して、化学薬品のヒュームフードで取り扱ってください</td></tr><tr><td>64ビットプロセッサを搭載したコンピュータとスーパーコンピューティングクラスタ</td><td></td><td></td>へのアクセス<td>結果として得られるシーケンシングデータセットの計算解析</td></tr><tr><td>DNAスピンカラム</td><td>エポックライフサイエンス</td><td>1920-250</td><td></td></tr><tr><td>dNTPセット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動装置</td><td>は異なります</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>22032601</td><td>100%vol / volエタノールは非常に可燃性です;手袋、白衣を使用して化学ヒュームフードで取り扱ってください。ゴーグル</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸&nbsp;(EDTAの)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2482100</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F2442</td><td></td></tr>グリ<tr><td>セロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP229-1</td><td></td></tr>グリ<tr><td>コーゲン</td><td>VWR</td><td>97063-256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP310-500</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>テロロスS.セレビシエDNAスパイクイン</td><td>自家製</td><td></td><td>架橋され、MNase消化され、アガロースゲルで抽出されたゲノムDNAをタンパク質/RNAから精製し、10 ng/mLに希釈して調製しました。酵母ゲノムDNAを推奨していますが、必要に応じて他の生物も使用できます。</td></tr><tr><td>塩酸&nbsp;(HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>塩酸は非常に腐食性が高い。手袋、白衣、ゴーグルを使用して化学ドラフトで取り扱</td></tr>える <tr><td>アイスバケツは</td><td>さまざま</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina シーケンシングプラットフォーム (例: NextSeq500)</td>温度と雰囲気をコントロールできる <td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart HiFi DNAポリメラーゼ、5X KAPA HiFiバッファー付き</td><td>ロシュ</td><td>7958889001</td><td>ホットスタート高忠実度ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>層流フード</td><td>ベーカリーカンパニー</td><td>SG404</td><td></td></tr>塩化<tr><td>マンガン(MnCl2)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットセット</td><td>レイニン</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>ミニフュージ</td><td>ベンチマーク</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NEBアダプター</td>ニュー<td>イングランドバイオラボ</td><td>E6612AVIAL</td><td>アダプターNEB</td></tr><tr><td>ユニバーサルプライマー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E6611AVIAL</td><td>ユニバーサルプライ</td></tr><tr><td>マーNEBイルミナキットニュー</td><td>イングランドバイオラボ</td><td>E7335S / L、E7500S / L、E7710S / L、E7730S / Lインデックス</td><td>プライマー</td></tr><tr><td>ネガティブコントロール抗体</td><td>抗体-オンライン</td><td>ABIN101961</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free water</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>2231000666</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock tubes</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15593049</td><td>フェノールは、飲み込んだり、皮膚に接触したりすると有害です。手袋、白衣、ゴーグル</td></tr><tr><td>を使用して、化学ヒュームフードで取り扱ってください液状緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>#4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール(PEG)4000</td><td>VWR</td><td>A16151</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム(KCl)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P3911</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化カリウム(KOH)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P250-1</td><td>注意 KOHは、溶液中で固体で腐食性であるため、目/皮膚を刺激します。手袋、白衣、ゴーグルを使用して化学薬品のヒュームフードで取り扱える</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>プロテインA/G-MNase</td><td>エピサイファー</td><td>15-1016</td><td>pA/G-MNase</td></tr><tr><td>プロテインA-MNase、pK19pA-MNから精製</td><td>Addgene</td><td>86973</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>New England Biolabs</td><td>T3010</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム&nbsp;(NaOAc)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td>サー<td>モフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP166-500</td><td>SDS は吸入すると有毒です。水酸化ナトリウム (NaOH) を取り扱う際は、手袋、目の保護具、N95 グレードの呼吸器を使用して、換気の良い場所では慎重に取り扱っ</td></tr>てください<tr><td>フィ</td><td>ッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>S318-1</td><td>NaOHは、溶液中で固体および腐食性として目/皮膚刺激性です。手袋、白衣、ゴーグルを使用して化学薬品のヒュームフードで取り扱える</td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>標準倒立光学顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>11526213</td><td></td></tr><tr><td>標準的なラボ用アガロースゲル材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>異なる 血清学的ピペットやピペットチップなどの標準的なラボ材料</td><td>T4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAリガーゼ</td><td>新製品England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>卓上ボルテクサー</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215414</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>、ウォーターバス</td></tr>トリ<tr><td>スベース</td><td>を使用できます フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>9002-93-1</td><td>トリトンX-100は危険です;トリプシンを取り扱うときは、白衣、手袋、ゴーグルを使用してください</td></tr> トリ<tr><td>プシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>MT25052</td><td></td></tr><tr><td>チューブローテーター</td><td>VWR</td><td>10136084</td><td></td></tr><tr><td>USER酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M5505S</td><td></td></tr></tbody></table>

標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

クロマチン上のタンパク質の結合位置を決定することは、その機能および潜在的な調節標的を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降(ChIP)は、30年以上にわたりタンパク質の局在を決定するためのゴールドスタンダードであり、超音波処理または酵素消化クロマチンから目的のタンパク質を引き出すための抗体の使用によって定義されています。より最近では、抗体テザリング技術は、その感度の増加のためにクロマチン上のタンパク質局在を評価するために普及している。Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) は、クロマチン免疫切断 (ChIC) のゲノムワイド誘導体であり、ミクロコッカスヌクレアーゼ (pA-MNase) に連結された組換えプロテイン A を利用して、目的のタンパク質を標的とする抗体の IgG 定常領域を同定し、目的のタンパク質に隣接する DNA の部位特異的切断を可能にします。CUT&RUNは、ヒストン修飾、転写因子、およびヌクレオソームリモデリング因子などの他のクロマチン結合タンパク質をプロファイリングするために使用することができる。重要なことに、CUT&RUNは、真色または異色に関連するタンパク質およびヒストン修飾のいずれかの局在化を評価するために使用することができる。これらの理由から、CUT&RUNは広範囲のタンパク質の結合プロファイルを決定するための強力な方法です。最近、CUT&RUNは低集団の細胞および単一細胞における転写因子プロファイリングに最適化されており、最適化されたプロトコルは超低入力CUT&RUN(uliCUT&RUN)と呼ばれています。ここでは、uliCUT&RUNを使用した単一細胞因子プロファイリングのための詳細なプロトコルを、手動の96ウェル形式で提示する。

ここでは、96ウェルの手動フォーマットuliCUT&amp;RUNを使用してクロマチン上の単一細胞タンパク質プロファイリングのための詳細なプロトコルを提示する。結果は、プロファイリングされるタンパク質(タンパク質の存在量および抗体品質による)、細胞型、およびその他の寄与因子によって異なるが、この技術の予想される結果については、ここで説明する。細胞品質(細胞の外観および生細胞の割合)および単一細胞選別は、NE緩衝液への生細胞選別の前または時に評価されるべきである。ES細胞コロニーおよび細胞選別の一例を図2A、Bに示す。具体的には、低品質の細胞は使用すべきではなく、品質が問題となる場合は、特定の細胞種のガイドラインに従うように注意する必要があります。さらに、細胞選別装置による正確な細胞選別は、実験に先立って評価されるべきである。例えば、試験細胞をHoechst 33342染色を用いて選別および染色し、各ウェルに0または1細胞が見出されることを保証するために計数することができる。単一のセルが見つからない場合は、ソート条件を最適化する必要があります。ラ...

CUT&RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUNはクロマチン上のタンパク質の局在を決定するための強力な技術であり、ここではこの技術の単一細胞バージョンを手動の96ウェル形式で説明します。ChIP-seqのようなほとんどのタンパク質局在化技術は、高い細胞入力を必要とし、完了までに約3日かかります。CUT&RUNは、高信号と低バックグラウンドのため、ローセルおよびシングルセルアプリケーション向けに最適化されており、1日で完了できます。この技術は、ほぼすべての生物学的サンプルに適用でき、貴重な患者サンプルなどの希少で存在量の少ないサンプルにおける因子の局在を決定するのに特に強力であると想定しています。単一細胞実験を行う前に、抗体と技術を多数の非貴重細胞でテストしてください。この実験の主な限界は、堅牢な抗体への依存性です。手順を実演しているのは、私の研究室の経験豊富な研究専門家であるサンタナ・ラルドです。単一細胞を選別し、ビーズに核を結合させた後、96ウェルプレートを96ウェル磁気ラックの上に置き、ビーズが最低5分間結合するのを許します。その後、上澄み液を取り出して廃棄する。100マイクロリットルのブロッキングバッファーを核結合ビーズに加え、穏やかなピペッティングで混合し、室温で5分間インキュベートする。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、上清を最低 5 分間除去します。その後、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して廃棄する。磁気ラックからプレートを取り出し、穏やかなピペッティングで反応ごとにビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。プレートを 96 ウェル磁気ラックに戻し、上清が除去されるのを待ってから、上清を取り出して廃棄します。穏やかなピペッティングで反応ごとに25マイクロリットルの洗浄バッファーにビーズを再懸濁する。反応ごとに25マイクロリットルの洗浄バッファーを小分けして一次抗体マスター混合物を作り、次いで反応ごとに0.5マイクロリットルの抗体を加える。25.5マイクロリットルの抗体洗浄バッファーミックスを加え、続いて、目的のタンパク質を標的とする抗体で処理されている各サンプルに穏やかにピペッティングを行った。室温で1時間インキュベートする。その後、サンプルを再び96ウェル磁気ラックに戻します。上清が透明になったら、ビーズを邪魔することなく取り除いて捨ててください。磁気ラックからプレートを取り出した後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、ピペッティングで再懸濁します。プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、前述のように上清を捨てた後、各サンプルを25マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。プロテイン A MNase マスター混合物は、25 マイクロリットルの洗浄バッファーと、反応ごとに最適化された量のプロテイン A MNase を加えて作成します。25マイクロリットルのプロテインA MNaseマスター混合物を、対照試料を含む各試料に加える。試料を室温で30分間インキュベートする。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置きます。上澄み液を最低5分間クリアしてから、ビーズを乱すことなく上清を取り出して捨てます。磁気ラックからプレートを取り出した後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、穏やかなピペッティングで再懸濁します。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、前述のように上清を捨てます。その後、磁気ラックからサンプルを取り出し、穏やかなピペッティングによってビーズを50マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁する。氷水混合物中でサンプルを摂氏0度まで5分間平衡化してから、氷水浴からサンプルを取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して1マイクロリットルの100ミリモルの塩化カルシウムを加える。大容量のマルチチャンネルピペットを使用して穏やかなピペッティングで3〜5回よく混ぜ合わせ、サンプルを摂氏0度に戻します。プレートが氷水浴に戻ったらすぐに10分のタイマーを開始します。2倍の濃度のRSTOP+を含む溶液50マイクロリットルをピペッティングして反応を停止し、塩化カルシウムと同じ順序で緩衝液を各ウェルに添加した。サンプルを摂氏37度で20分間インキュベートする。プレートを16, 000倍Gで4°Cで5分間回転させます。プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置きます。上清を最低5分間クリアします。その後、上清を新鮮な96ウェルプレートに移し、ビーズを捨てる。DNA抽出のために、10%SDSの1マイクロリットルと1ミリリットルのプロテイナーゼKあたり0.83マイクロリットルの20ミリグラムを各サンプルに加え、穏やかなピペッティングによってサンプルを混合する。サンプルを摂氏70度で10分間インキュベートする。プレートを室温に戻します。46.6マイクロリットルの5モルの塩化ナトリウムと90マイクロリットルの50%PEG4000を加え、穏やかなピペッティングで混合する。各サンプルに33マイクロリットルのポリスチレンマグネタイトビーズを加え、室温で10分間インキュベートする。プレートを磁気ラックの上に置き、上澄み液を約5分間透明にします。その後、ビーズを乱すことなく上澄み液を慎重に捨てる。ビーズを乱すことなく、150マイクロリットルの80%エタノールで2回すすいでください。プレートを1000倍Gで30秒間短時間回転させる。プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、ビーズを乱すことなく残留エタノールをすべて除去します。サンプルを約2〜5分間空気乾燥させます。ビーズをpH8の10ミリモルTRIS塩酸塩37.5マイクロリットルに再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。プレートを磁気ラックに戻し、ビーズが 5 分間結合するのを許します。36.5マイクロリットルの上清を新鮮なサーモサイクラー対応の96ウェルプレートに移し、ビーズを捨てる。細胞品質評価を実施した後、細胞の外観およびパーセンテージを調べ、低品質の胚性幹細胞を使用すべきではないことを実証した。単一細胞ソーティングをヘキスト33342染色を用いて行い、試験細胞を計数して、各ウェルに0個または1個の細胞が見出されることを確認した。アガロースゲル分析により、低分子量ラダーと個々の単一細胞uliCUT&RUNライブラリーが明らかになった。最適でないライブラリー分析および最適ライブラリー分析は、低分子量はしご、非効率なムナーゼ消化による最適でないライブラリー、および適切な消化を伴う成功したライブラリーを示す。フラグメントアナライザー分布は、単一細胞の予想されるサイズが150〜500塩基対の範囲であることを示している。しかし、大きなタンパク質では、DNAは約270塩基対を有するであろう。高細胞数または陰性対照を描写した単一遺伝子座ゲノムブラウザと単一細胞CTCF uliCUT&RUNを用いたタンパク質占有率は、単一細胞が高細胞uliCUT&RUNと同様に、主に強いピークを表すことを明らかにした。単一細胞CTCFまたはネガティブコントロールのヒートマップは、細胞内の確立されたCTCF結合部位に直接かかる読み取り濃縮の明確なパターンを明らかにした。1次元ヒートマップは、単一細胞ライブラリーの確立されたCTCF結合部位よりも、周囲の領域および抗体のない対照と比較して高い読み取り密度を示し、確立された結合部位における抗体特異的濃縮を実証する。氷水浴上でビーズ結合核を平衡化し、塩化カルシウム添加時にサンプルを過熱させないことは、クロマチンの過剰消化を防ぐために重要です。

single-cell-factor-localization-on-chromatin-using-ultra-low-input

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability...

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

単一分子レベルでのDNAの部位特異的切断を測定するための高度に平行な方法が記載されている。このプロトコルは、制限エンドヌクレアーゼNdeIを用いた手法を示す。この方法は、部位特異的なDNA切断をもたらす任意のプロセスを研究するために容易に改変することができる。...

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

標的下での切断とタグ付け(CUT&amp;Tag)は、効率的なクロマチンエピゲノムプロファイリング戦略です。このプロトコルは、植物におけるヒストン修飾のプロファイリングのための洗練されたCUT&amp;Tag戦略を提示する。...

標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング

長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

ゲノムワイド染色体コンフォメーションキャプチャー法Micro-C-XLを使用して、ヌクレオソーム分解能で三次元ゲノム構成をマッピングするためのプロトコルがここに示されます。...

Micro-C-XLによる哺乳類3Dゲノム相互作用のマッピング

ここでは、マウス四肢筋サテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)単離のための効率的なプロトコルを、標的下での切断とヌクレアーゼを用いた放出による筋線維の転写制御の研究に適合させます(CUT&amp;RUN)。...

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&amp;RUN解析のための効率的なプロトコール

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture...

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

このプロトコルは、バイオインフォマティクスの初心者に、CUT&amp;RUNシーケンシングデータの初期解析とバリデーションを完了するための入門的なCUT&amp;RUN解析パイプラインをガイドします。ここで説明する分析ステップを完了し、ダウンストリームのピークアノテーションと組み合わせることで、ユーザーはクロマチン制御に関するメカニズムの洞察を引き出すことができます。...

CUT&#38;RUNシーケンシングデータの入門解析と検証

ヌクレアーゼを用いた最適化された標的下切断および放出法と、次世代シーケンシング(CUT&amp;RUN-seq)プロトコルが、神経内分泌小細胞肺がん細胞株に対して記述されています。この技術は、SCLCの病理生物学におけるエピジェネティックおよび転写脱調の研究を可能にするため、さまざまなヒストン修飾および転写因子(例:E2F7)結合部位のゲノムワイドマッピングを可能にします。...

CUT&amp;RUNを用いた神経内分泌小細胞肺がん細胞株におけるヒストン修飾および転写因子結合部位のゲノムワイドマッピング

学ぼう、96ウェル形式の単一細胞CUT&RUN法を用いたクロマチン上のタンパク質局在解析。低細胞入力・高感度・短時間で希少サンプルや臨床検体の解析に応用可能な革新的エピジェネティクス技術です。

標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

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