Name: 表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 学ぶ 表面プラズモン共鳴（SPR）を用いた抗ウイルス剤のエンジニアリング手法。タンパク質と糖鎖の結合親和性をリアルタイムで解析し、薬剤開発や抗体特性評価に有用な無標識技術を習得できます。

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著者は、ウィーン工科大学のバイオテクノロジーおよび微生物学部門およびウィーン医科大学の腎臓学および透析部門の医学部IIIのクリスチャン・ダーントル博士、特に技術的および科学的支援のためのマルクス・ワールマン博士を認めています。哺乳類細胞におけるタンパク質発現は、ウィーン天然資源生命科学大学(BOKU)のバイオテクノロジー学部によってサポートされました。著者は、ドイツのデュッセルドルフにあるXanTecバイオアナリティクスのNico Dankbar博士に、SPR結合アッセイの実施に関する有益な科学的議論について深い感謝の意を表したいと考えています。

著者は開示するものは何もありません。

CV-Nの結合親和性は、機能的結合部位の数と相関しています[ドメインBでは2H、ドメインスワップダイマーとして操作された場合はドメインAでは2L]。結合親和性が変化する変異体(CVN2L0-V2、ジスルフィド架橋ノックアウトを含むCV-Nのホモ二量体安定フォールド)を大腸菌で発現させ、精製し、SPR10を用いてHAタンパク質(H3N2)への結合について積極的に試験し、HAをHまたはL炭水化物結合部位と結合すると立体構造変化を示し、KD1 = 49 nMおよびKD2 = 8 μM38.CVN2の糖鎖標的ポケット付近のジスルフィド架橋の数が4から2に減少するにつれて、HAタンパク質への結合親和性は減少しました(図3B-Dおよび補足表1)。ジスルフィド結合変異体は、Cysを置換し、安定性をわずかに低下させながら極性残基対Glu-...

テザリン関連抗ウイルス活性は、インターフェロンαによって誘導され、タンパク質ベースのテザーを含み、感染した細胞表面上に完全に形成されたビリオンの保持をもたらす1。ウイルス放出の阻害におけるテザリングリコシル化の必要性は依然として不明であり、in vitro研究のための組換え発現グリカン上のグリコシル化パターンの重要性を示唆しています1,2、これは(インフルエンザウイルスの場合)表面発現インフルエンザ赤血球凝集素HA 3,4の立体配座に依存します。.N結合型グリコシル化につながれたオリゴ糖の修飾は、HIVタイプ1型放出のテザリン媒介制限に十分であり、二量体化はウイルス放出の防止に不可欠な役割を果たし、それによって出芽ビリオンをつなぐための膜貫通ドメインまたはグリコシル-ホスファチジル-イノシトール(GPI)アンカーが関与することが注目されています5。.ヒトおよびマウステザリンが複数のエンベロープウイルス、レトロウイルス、およびフィロウイルスをブロックするための独自の機能が説明されています。BST-2/テザリンは、自然免疫1,6のインターフェロン誘導性抗ウイルスタンパク質であり、広域スペクトルの抗ウイルス活性で作用し、エンベロープ糖タンパク質5によって拮抗され、テザリンを転座させるか、テザリン6の構造を破壊します。例えば、A型インフルエンザウイルス上で表面発現されたエンベロープ糖タンパク質HAおよびノイラミニダーゼは、株特異的な様式7におけるテザリン拮抗作用についてよく知られており、宿主受容体結合部位の認識を容易にする8。糖鎖標的抗体は、HA上の急速にカスタマイズされた糖鎖シールドとの相互作用の化学量論で研究され、インフルエンザAのH3N2およびH1N1サブタイプ4への結合親和性をもたらします。
抗ウイルス剤とウイルスエンベロープスパイク(糖鎖リガンド)の結合機構を解明するために、モノマンノース、ジマンノース、トリマンノース部分を化学合成します。マンノシル化ペプチドは、グリコシル{β}-過酢酸塩から1,2-トランスグリコシルアジド変換9へのアジドグリコシル化によって生成され、生命を脅かすウイルスの表面に通常見られるN-アセチルグルコサミンおよび高マンノースオリゴ糖を模倣します。トリアゾールバイオアイソスターは、HAペプチド10のマンノシル化残基を形成する結合を模倣し、HAヘッドドメイン上の2番目のN結合型グリコシル化スポット(4つのN結合型糖鎖N54、N97、N181、N301を有するHAトップ)8,11,12の周りの抗ウイルスCV-N誘導体との部位特異的相互作用を促進するために利用されます。.グルタミン酸(Glu)とアルギニン(Arg)の間の相互作用と結果として生じるらせん双極子は、モデルペプチドとタンパク質の両方の良好な安定性を示しましたが、SPRを使用して視覚化されます。糖鎖部分への受容体結合を直接阻害することによってHA10上の単一の化学合成グリコシル化部位を認識することと比較した場合、その受容体に対する4部位変異Fc構造のより高い親和性がインビボでエフェクター機能を惹起することが示され、Fc変異体に結合したN結合型糖鎖の無関係な組成が機構的に決定されることが明らかになった13。
CV-Nは、HIV 14,15、インフルエンザ16、およびエボラウイルスに対する抗ウイルス活性を示し、エンベロープスパイクタンパク質12,17,18,19上の高マンノースオリゴ糖修飾へのナノモル結合によって媒介されます。CV-Nにおける1つの高親和性糖鎖結合部位(H)または共有結合した二量体CVN2における2つのHsへのインフルエンザHA結合は、それぞれ平衡解離定数(KD)= 5.7 nM(図1A)およびKD = 2.7 nMを有すると決定される。CV-NおよびCVN2はいずれも、別の1つまたは2つの低親和性炭水化物結合部位(L)12,17,20,21を有する。エボラGP1,2は、より低いナノモル範囲(KD = 26nM)の親和性を有するCVN2の2Hに結合する。エボラGP1,2およびHAに結合するCV-N WTは、KD = 34 nMからKD = 5.7 nMまでの親和性を示す(A/New York/55/04)12。ウイルスエンベロープ上の高マンノースグリカンを特異的に標的とするCV-Nなどのレクチンは、C型肝炎ウイルス、SARS-CoV、ヘルペスウイルス、マールブルグウイルス、および麻疹ウイルス22の複製をさらに阻害します。
低分子CV-N分子は、広範囲のウイルスに結合してウイルスの侵入を阻害するように機能するため、20年以上にわたって徹底的に研究されてきました16,18。構造解析および結合親和性アッセイは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質に対する結合活性を高めるために、マイクロモル範囲の二価結合によるドメインスワップCVN2ダイマー内の2つのLの架橋を示しています10,19。Man(8)D1D3アームおよびMan(9)に対するManα1-2Manαの選択的結合は、反対のタンパク質プロトマー20上に位置する異なる親和性の2つの結合部位を含み、それによってナノモル結合親和性に達する(図1B)。したがって、CVN2は、ウイルス中和抗体と同様に、HIV gp120上のエピトープに結合するその応用に関する疑似抗体と見なされます17。ここで、著者は、CVN2の受容体結合ドメイン(RBD)を介したSARS-CoV-2スパイクへの潜在的な結合を調査することに関心があります。固定化されたヒトアンジオテンシン変換酵素(ACE)-2とSARS-CoV-2 RBDとの結合曲線は、この生物学的に関連する結合相互作用についてKD = 4.7 nMをもたらします23。
対照的に、選択された免疫グロブリンクラスは、特異的で一貫した構造タンパク質パターンを認識し、膜固定HA領域24における親和性成熟のための基質を付与する。CV-Nは、ほぼすべてのインフルエンザAおよびBウイルス16において非常に強力な活性を示し、広範に中和する抗ウイルス剤である。私たちの知識は、高中和抗体による糖鎖標的化のためのエピトープ構造を含む可能性のあるHA1およびHA2のステム上の標的エピトープの位置について、およびレクチン結合と比較して不完全です25。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg"> 図1:CV-NからウイルスエンベロープスパイクへのSPR結合アッセイの概略図。 (A)リガンドへのCV-N結合のためのSPRアッセイ:HA全長タンパク質(90kDa)。インフルエンザHA A /ニューヨーク/55/04(H3N2)へのリアルタイムの二重参照結合を示す運動データセット(5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、0 nM)。(B)CVN2L0変異体V2は、500nM〜16μMの濃度範囲内で固定化リガンドDMに結合する。 配列:L残基は黄色で強調表示されています。H残基は灰色で強調表示されます。E58およびR73は野生型タンパク質のシステインの置換であり、V2を4つのジスルフィド結合ではなく3つのジスルフィド結合を有する安定なタンパク質フォールドにする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
膜遠位HA上部上の糖鎖シールドはCV-N 12への高親和性結合を誘導するのに対し、CVN2はHA上部のジスルフィド架橋に隣接するHAへの結合が、その低親和性部位でさらに観察されている10,12。様々な極性相互作用および相互作用部位がCV-Nによる糖鎖結合において同定される。これらの相互作用は、結合部位にノックアウト変異体を生成して、in silico予測グリコシル化12に対する結合親和性を相関させることによって検証される。したがって、このプロジェクトは、結合親和性と特異性において以前にテストされた化学的にマンノシル化されたHAペプチドを、少数の異なるN結合型グリコシル化部位とO結合型グリコシル化によって自然に修飾されたSARS関連の2019-nCoVスパイクおよびSARS-CoV-2からの短いペプチド配列と比較することを目的としています。今回、Pintoたちの研究グループは、クライオ電子顕微鏡法と結合アッセイを用いて、受容体付着と競合することなく、サルベコウイルス亜属内の保存された糖鎖を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質のエピトープを認識する可能性のあるモノクローナル抗体S309を報告している26。この研究のプロトコルは、CV-NおよびCVN2がSPR技術を使用してグリコシル化タンパク質および合成マンノシル化ペプチドにどのように結合するかを研究するために、CV-N変異体の設計、発現、および特性評価がどのように重要であるかを説明しています10,12。
タンデム結合二量体CVN2L027および結合部位変異体(V2-V5)は組換え的に発現され、変異体はジスルフィド結合置換体(C58EおよびC73R)を有する(図2A)。また、一点変異E41Aを有する変異体が調製されるのは、この位置が分子間交差接触残基として見られたからである。この変異体は、レクチンと高マンノースオリゴ糖の間のSPR結合測定のための別の興味深い分子であり、結合ドメインを解読し、二量体型との比較を可能にします。CVN2のドメインスワップ結晶構造は、49〜54残基に及ぶ柔軟なリンカーを示しています。2つのドメインは、剛体としてヒンジの周りを移動し続けることができ、分子内ドメイン相互作用を介してモノマー(ドメインA-残基1-39;90-101-とドメインB-残基40-89)または分子間ドメインスワッピングによって二量体[ドメインA(第1のモノマー)とドメインB(第2のコピー)、およびドメインB(第1のモノマー)とドメインA(第2のコピー)]のいずれかを発達させる。2つのプロトマーのAドメインとBドメインの間には、Glu4128を除いて密接な相互作用はありません。CV-Nの遺伝子は、40量体合成オリゴ29を用いた反復PCR法を用いて開発することができ、次いで、Keeffe, J.R.27によって記載されているように、電気コンピテント細胞への形質転換(エレクトロポレーション)のためにpET11aのNdeIおよびBamHI部位にサブクローニングされる。それぞれの結晶構造(PDB ID 3S3Y)を達成するために使用されるタンパク質は、N末端6-ヒスチジン精製タグとそれに続く第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含む。部位特異的突然変異誘発は、アミノ酸交換のために、点突然変異を起こし、コドンを切り替え、単一または複数の塩基またはコドンを挿入または欠失するために利用される。これらの形質転換は、タンパク質の機能と構造に関する貴重な洞察を提供します。組換え発現および精製されたCV-N、CVN2、およびCVN3は、生物物理学的によく研究されており20、21、27、製造が安価であるため、SPRセンサーチップに固定化されたグリカンへの結合アッセイの特性評価に使用されます。従来の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、糖鎖リガンドの固定化技術に関する再現性が低く、SPRで示されているさまざまな結合部位変異体のリアルタイム結合をエンドポイントアッセイに変換します。
結合親和性バリアントCVN2L0-V2(ジスルフィド架橋置換10を有するホモ二量体CV-Nのインタクトフォールド)を大腸菌(大腸菌)のHisタグで発現させ、アフィニティークロマトグラフィーを適用してNi-NTAカラムで精製し、SPRを用いてHA(H3N2)、モノマンノシル化HAペプチドおよびジマンノシル化HAペプチドへの結合について試験した。 化学的にマンノシル化ペプチド、またはHAおよびSタンパク質、すべてが親水性チップ表面に結合したリガンドおよびアミン反応性エステルまたはビオチン-ストレプトアビジンタンパク質工学を介して。逐次実行の同じ手順をこれらのリガンドに適用し、CV-Nの様々な希釈液およびCV-N(およびCVN2)の変異体を注入して、以下に説明するように分子間相互作用分析のための速度論的情報を得る30。RBD固定化SPRセンサーチップは、CV-NからSペプチドへの結合研究に使用され、ヒトACE2とのSARS-CoV-2結合との親和性と比較されます。

<table><tbody><tr><td>&Auml;kta primeplus</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon tubes</td><td>Merck</td><td>C7715</td><td></td></tr><tr><td>Ampillicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5354</td><td></td></tr><tr><td>Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R 遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06320</td><td></td></tr><tr><td>Cell spreader</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS86655</td><td>silver stainless steel, bar L 33&nbsp;mm</td></tr><tr><td>カスタムDNA オリゴス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>オリゴ</td><td></td></tr><tr><td>カスタムゲンシンセシス</td><td>GenScript</td><td>#1390661&nbsp;</td><td>クローニングベクター:pET27b(+)&nbsp;</td></tr><tr><td>サイティバ&nbsp;HBS-EP+ バッファー 10、4x50mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>50-105-5354</td><td></td></tr><tr><td>Dionex UlitMate 3000</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td><td></td></tr><tr><td>Dpn I 制限酵素 (10 U/&mu;L)&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>メルク</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>メルク</td><td>39391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>メルク</td><td>E9884</td><td></td></tr>エ<tr><td>ッペンドルフセーフロックチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120086</td><td></td></tr>エッ<tr><td>ペンドルフセーフロックチューブ</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td></td>30120094<td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ&nbsp;ミニスピン&nbsp;およびMiniSpin Plusパーソナルマイクロ遠心機</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606235</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミンHCl</td><td>メルク</td><td>E6133</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50mL コニカル遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 14 mL 丸底ポリスチレン試験管、スナップキャップ付き、滅菌済み、25個入り</td><td>コーニング</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>メルク</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>グリシン HCl</td><td>メルク</td><td>55097</td><td></td></tr><tr><td>HA H3 タンパク質</td><td>アブカム</td><td>ab69751</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>メルク</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ヒスセレクト Ni2+</td><td>メルク</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>メルク</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>メルク</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン A</td><td>Σ-Aldrich</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Kromasil 300-5-C4</td><td>Nouryon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>Merck</td><td>52062</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>Merck</td><td>19344</td><td></td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Merck</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Merck</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Merck</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>メルク</td><td>M7506</td> NaH<<td></td></tr><tr><td>sub>2P04</td><td>Merck</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop UV-Vis2000c 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>メルク</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>メルク</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>NZ アミン (カゼイン加水分解物)</td><td>メルク</td><td>C0626</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>メルク</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9180-11</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>メルク</td><td>70171</td><td></td></tr><tr><td>pET11a</td><td>メルク ミリポア (ノバゲン)</td><td>69436&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>メルク</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップ キット (1000)</td><td>Qiagen</td><td>27106X4</td><td></td></tr><tr><td>Reichert ソフトウェア パッケージ Autolink1-1-9</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPR SR7500DC デュアル チャネル システム</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクラバー2-2012-09-04 データ分析</td><td>用 Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>11667289001</td><td></td></tr><tr><td>サイト指向型突然変異導入キットには、pUC18コントロールプラスミド</td>、<td>Stratagene</td><td>#200518</td><td></td></tr>、<tr><td>塩化ナトリウム</td>、<td>メルク</td><td>S9888、</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウムが含まれています。三水和物</td><td>メルク</td><td>236500</td><td></td></tr><tr><td>SPRセンサーチップ C19RBDHC30M</td><td>XanTecバイオアナリティックスカスタマイト</td><td>SCR C19RBDHC30M</td><td></td></tr><tr><td>SPRセンサーチップ CMD500D</td><td>XanTecバイオアナリティックス</td><td>SCR CMD500D</td><td></td></tr><tr><td>ステリン標準90mmシャーレ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>メルク</td><td>T5912</td><td>10x、ソリューション</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>メルク</td><td>T8787</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プトンメル</td><td>ク</td><td>93657Tween20</td><td></td></tr>メル<tr><td></td><td>ク</td><td>P1379</td><td></td></tr>ボル<tr><td>テックス-魔神2ミキサー</td><td>メルク</td><td>Z258423</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td>メル<td>ク</td><td>XGAL-RO</td><td></td></tr><tr><td>XL1-ブルースーパーコンピテントセルStratagene</td><td></td><td>#200236</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>物メルク</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

表面プラズモン共鳴(SPR)は、ドメインスワップされたシアノビリン-N(CV-N)二量体へのヘマグルチニン(HA)結合を測定し、マンノシル化ペプチドとCV-Nの高親和性結合部位との間の相互作用を監視するために使用されます。ウイルスエンベロープスパイクgp120、HA、およびエボラ糖タンパク質(GP)1,2は、二量体CVN2上の高親和性および低親和性結合部位の両方に結合することが報告されています。ジマンノシル化HAペプチドはまた、CVN2の改変分子への2つの低親和性結合部位で結合しており、CVN2はそれぞれのリガンドに対して高親和性部位を有し、糖鎖結合ポケット内の安定化ジスルフィド結合を置き換えるために変異しているため、多価結合が確認されます。HA結合は、275 nMの解離定数(KD)で疑似抗体CVN2の1つの高親和性結合部位に示され、オリゴマー化によってヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)をさらに中和します。ドメインスワップCVN2のジスルフィド架橋の数は、シスチンをグルタミン酸とアルギニンの極性残基対に置き換えることで4から2に減少し、HAに対する結合親和性が低下します。最も強い相互作用の中で、エボラGP1,2は、膜貫通ドメインのないエンベロープグリカンを使用して、低ナノモル範囲の2つの高親和性結合部位を持つCVN2によって結合されます。本研究では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)スパイク(S)糖タンパク質への多重特異性モノマーCV-Nの結合は、他のウイルススパイクへのナノモルKDと比較して、および中μモル範囲のその受容体結合ドメインを介して、KD = 18.6 μMで測定されます。

二量体ドメインスワップCVN2L0分子は、3つの別々のSPR実験でHAトップ領域への結合についてテストされ、結合親和性はKD値で提示されます。ドメインBは、ジスルフィド結合をイオン性残基に置換することによって影響を受けるH結合部位を含むと仮定され、ドメインAはL10,18を形成する。CVN2L0およびバリアントV2(3つのジスルフィドブリッジ)およびV5(2つのジスルフィドブリッジ)の単回注入は、オートサンプラーと実行中のテーブルエディタを使用して速度論測定を設定する前に、最初にHA結合センサーチップへの結合をテストして結合能力を推定します(図3Aおよび補足図2)。一連のCVN2L0、V2、およびV5に対して、システム内のナノモルおよびμモル範囲のさまざまな濃度の反復注入が経時的に自動化されます(図3B-D<str...

本プロトコルは、HA、S糖タンパク質、関連するハイブリッド型グリカン、および高マンノースオリゴ糖へのCV-N結合を調べるためのSPR結合アッセイのための新しいツールについて説明しています。SPRは、これらのグリカンに二量体または単量体CV-Nのいずれかを結合するためのKD を決定するために使用される。

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

表面プラズモン共鳴分光法は、中程度のスループットの方法でタンパク質リガンドを測定するために確立されています。同じ分子の結合部位変異体に対する異なる親和性、すなわちウイルスに対する鉄結合性の高いマナーオリゴ糖に対する親和性が提示される。SPRは、表面固定化受容体の高分子結合をリアルタイムで研究するためのラベルフリー技術です。マルチサイト相互作用は、サイズとは無関係に競合結合による速度論的分析で認識されます SPRを使用する研究の特定の領域は、阻害剤または抗体の特性評価を検索するための医薬品開発です。運動定数と親和性は、センサーの応答から直接計算されます。はじめに、100マイクロリットルの溶液をLB-寒天プレートに移し、滅菌セルスプレッダーを使用して穏やかに広げます。プライマー濃度を一定に保ちながら、5ナノグラムから50ナノグラムの範囲の複数の濃度の二本鎖DNAテンプレートを使用して、一連のサンプル反応を開始します。次に、鉱油オーバーレイの下にDpnI制限酵素を追加し、摂氏37度ですぐに1時間インキュベートして、親スーパーコイル二本鎖DNAを消化します。XL1-Blueスーパーコンピテントセルを解凍するには、セルを事前に冷却された小さな丸い底のチューブに分注します。次に、各コントロールおよびサンプル反応から1マイクロリットルのDpnI処理された一本鎖DNAを、相補鎖を合成するスーパーコンピテントセルの分離アリコートに移します。形質転換反応を注意深く旋回させて混合した後、氷上で反応を30分間インキュベートします。変態反応に熱パルスを摂氏42度で45秒間印加し、次に反応を氷上に2分間置きます。次に、0.5ミリリットルのNZY + Brothを加え、225〜250 RPMで1時間振とうしながら、摂氏37度で変換反応をインキュベートします。その後、前に示したように、LBアンピシリン寒天培地上に各形質転換反応の正しい量をプレートします。種培養の場合、少量のアンピシリン含有LB培地に、形質転換プレートからの単一コロニーを接種します。一晩培養して、10ミリモルの塩化マグネシウム、10ミリモルの硫酸マグネシウム、および20ミリモルのグルコースを含む添加剤を発現培養物に接種し、種培養物を100ずつに希釈する。次に、37°Cで激しく振とうしながら細胞を0.4〜0.6の吸収性600ナノメートルまで増殖させた後、細胞を20°Cに冷却し、1ミリモルのIPTGで誘導して一晩増殖させます。次に、摂氏4度で15分間4, 000 gで遠心分離して細胞を回収し、上清を捨てます。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水緩衝液に再懸濁した後、最近4,000gで摂氏4度で15分間避難した。その後、上清をピペットで捨てます。次に、残りのペレットを10ミリリットルの溶解バッファーに再懸濁し、懸濁液を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、摂氏4度で15分間4, 000 gで遠心分離することにより、可溶性画分と不溶性画分を分離します。さらに、HIS-Select Ni2+アフィニティーゲルを14ミリリットルのチューブに入れて、タグ付き組換えシアノビリン-Nを結合し、それぞれ20ミリモルのイミダゾールと250ミリモルのイミダゾールを含む緩衝液に再懸濁します。これらのステップの間に少なくとも30分間バッチでインキュベートします。250ミリモルのイミダゾールを含む溶出バッファーを添加してタンパク質を溶出します。タンパク質溶液を10キロのダルトンカットオフフィルターで遠心分離チューブに移し、4、500 g、摂氏4度で10分間遠心分離して濃縮します。SPRランニングバッファーを1〜10の希釈係数に加え、4、500 g、摂氏4度で10分間、初期容量まで4回遠心分離します。その後、23, 474ダルトンのサイズを示す主要タンパク質CVN2L0について計算された消滅係数に基づいて、NanoDrop UV-可視分光光度計を使用して280ナノメートルでのタンパク質濃度を決定します。デュアルチャンネルSPRシステムの場合、ランニングバッファーとしてHBSCP plusを使用し、再生バッファーとしてpH 1.5〜1.6の10ミリモルグリシン塩酸を使用し、機器のデガッサー、オートサンプラー、ポンプをオンにします。次に、システム全体を二重蒸留水で1時間洗浄します。次に、検出器に液浸油を滴下し、金薄膜をコーティングしたガラスセンサーチップを取り付けます。そして上側では、カルボキシメチルデキストランヒドロゲルで官能化して、3ポートフローセルの下の検出器に直接配置します。次に、ハンドリングをプルダウンして設定を修正します。タンパク質性リガンドをセンサーチップに固定化するには、メニューバーのフォームをクリックしてランテーブルを開き、統合されたSPPオートリンクソフトウェアでテーブルエディターを実行します。次に、使用可能な実行テーブルのリストから基本的な固定を選択してクリックし、コンピューター画面で実験手順の手順に従います。次に、フォームセクションのサンプルセットエディターをクリックして、オートサンプラーに配置された2つのラックの試薬リストに記入し、さらに分析します。メニューバーのツールとしてオートサンプラーダイレクトコントロールをクリックしてラックを前後に移動し、動作温度として摂氏4度を選択します。ツールとポンプの直接制御をクリックして、ポンプを始動して二重蒸留水を注入します。そして、SPR機器の直接制御をクリックしてデータを記録します。そして毎回、新しく表示されたウィンドウで開始します。カップリング試薬を300マイクロリットルのバイアルに入れた後、オートサンプラーラックに入れ、Runをクリックしてランテーブルを開始します。単純なタンパク質 - タンパク質相互作用のために、毎分25, 000マイクロリットルでポンプを補充した後、30秒間ベースライン調整を行う。その後、二重蒸留水で1.5分間ベースライン調整してから、活性チップ表面を1モルのエタノールアミン塩酸塩、pH 8.5で急冷します。次に、HBS-EP +フォームをクリックして、液体サンプラーから二重蒸留水からボトルへの脱気装置にチューブを切り替え、下にスクロールして、この操作モードをクリックして後処理に変更します。次に、[追加]をクリックして、各フローセルのデータプラットフォームで時間の経過とともに生成されたバインドカーブを選択し、オーバーレイをスクラバーファイルとしてエクスポートします。次に、ファイルをクリックしてファイル保存オプションを開き、左右の曲線を揃え、リガンドチャネルの信号から2番目の基準チャネルの信号を差し引くことにより、応答曲線を取得します。CVN2L0と分散V2およびV5の単回注入は、オートサンプラーとランニングテーブルエディターを使用して結合能力を推定するために、血球凝集素結合センサーチップへの結合について最初にテストされました。反復注入は、システム内のナノモルおよびマイクロモル範囲の様々な濃度で経時的に自動化され、チップ表面の飽和も平衡結合も達成されなかったことを実証した。濃度対応答は、260マイクロモルの解離速度定数を有するより弱い親和性を有するRBD S1サブユニット上のおそらく保存された炭水化物の特異的標的化を仮定して、RBDに結合するCVN野生型についてプロットされた。DMへのCVN2L0-V4結合の同じアフィニティープロットは、小さなグリコシル化ペプチドへの高親和性結合を妨害し、応答最大値よりも高い応答をもたらすジスルフィド結合の置換により、分析できなくなります。SARS-CoV-2上のRBDへのCVN野生型結合は、それぞれ18.6マイクロモルおよび260マイクロモルの解離rage定数を有するSタンパク質およびRBDへの結合を示す。分析物濃度に対するSPR応答は、CVN野生型およびE41A結合に対する高応答ユニットおよび典型的なSPRセンサーグラムをもたらすが。しかし、変異体は希釈すると不安定です。SPRバイオセンシングは、精製タンパク質とその変異体のリガンドへの高親和性および低親和性結合に取り組んでいます。我々の場合、センサーチップ表面上の光学的読み出しとデュアルチャネルフローシステムを利用する糖タンパク質。酵素免疫吸着アッセイは、タンパク質エピトープを認識する代替免疫学的方法であるだけでなく、複雑なマトリックスからのペプチドおよび低分子の濃度に関するデータも提供します。SPR結合アッセイによる組換え発現タンパク質の試験には、確認変化のバイオセンシングが組み込まれており、計算タンパク質側によるタンパク質安定性の検証と予測に有用です。

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私たちは、脱細胞肺癌細胞外マトリックスと機能的な肺組織を生成するために使用することができる新規バイオミメティックバイオリアクターを開発している。バイオリアクターにおけるマトリックスと培養に細胞を播種することにより、我々は短期間のためのin...

肺のエンジニアリングのための手順

学ぶ 表面プラズモン共鳴（SPR）を用いた抗ウイルス剤のエンジニアリング手法。タンパク質と糖鎖の結合親和性をリアルタイムで解析し、薬剤開発や抗体特性評価に有用な無標識技術を習得できます。

表面プラズモン共鳴による抗ウイルス剤のエンジニアリング

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