Name: ラマン色素による高多重化組織イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぶ：epr-SRSイメージングによる高多重化タンパク質可視化法。厚い組織切片でのサイクルフリーな多重染色を実現し、細胞レベルでのタンパク質相互作用解析や腫瘍微小環境の表現型解析に応用できます。

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マウスの膵臓組織を提供してくれたルース・A・シンガーとリチャード・K・P・ベニンガーに感謝します。W.M.は、NIH R01(GM128214)、R01(GM132860)、R01(EB029523)、および米軍(W911NF-19-1-0214)からのサポートを認めています。

このプロトコルは、コロンビア大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された動物実験プロトコル(AC-AABD1552)に従って実施された。
1. ラマン色素結合抗体の作製
<ol><li>PBS緩衝液中に〜0.1 M NaHCO3としてコンジュゲーション緩衝液を調製し、pH=8.3、4°Cで保存する。</li>
	<li>N-ヒドロキシスクシンイミジ(NHS)エステル官能MARSプローブ(補足材料)溶液を無水DMSO中に3mMとして調製する。MARSプローブの合成は、先行報告13、17、18を参照することができる。 注:保存目的のために、染料NHSエステル溶液は光から保護され、-20°Cに保たれなければならない。</li>
	<li>抗体固体をコンジュゲーションバッファーに2mg/mLの濃度まで溶解する。他のバッファーに溶解した抗体の場合は、遠心フィルターで 1 ~ 2 mg/mL の濃度に結合バッファーに交換します。 注:高度に交差吸着された二次抗体は、種間の反応性を最小限に抑えるためにマルチプレックス染色に好ましい。使用した二次抗体を表 1 および 材料表に列挙する。</li>
	<li>コンジュゲーション反応を行う。<ol>
<li>二次抗体の場合、ガラスバイアル中の抗体溶液に15倍モル過剰の色素溶液を攪拌しながらゆっくりと加える。例えば、0.5 mL 2 mg/mL 抗体溶液に、3 μL 3 mM 色素溶液を加える。</li>
		<li>反応混合物を室温(RT)で1時間撹拌しながらインキュベートする。反応を光から守ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>浄化。<ol>
<li>ゲル濾過樹脂のスラリー(原料表)をPBS緩衝液中で調製し、以下の手順1.5.2~1.5.4を行う。</li>
		<li>50 mL チューブ内の 40 mL の PBS バッファーに 10 mL のゲルろ過樹脂粉末を加えます。</li>
		<li>溶液を90°Cの水浴中に1時間保持する。</li>
		<li>上清をデカントし、PBSを40mLに再添加した。スラリーを4°Cで保存する。</li>
		<li>サイズ排除カラム(直径1cm、重力流カラム)にスラリー溶液を10〜15cmの高さまで充填する。</li>
		<li>カラムをすすぎ、約 10 mL の PBS バッファーで洗浄し、樹脂をさらにパックします。</li>
		<li>コンジュゲーション反応混合物(〜0.5 mL)をカラムにピペットする。全ての反応混合物がロードされたら直ちに溶出緩衝液として1mLのPBS緩衝液を加える。溶出バッファー (PBS) をカラムに常に補充してください。</li>
		<li>コンジュゲート溶液の溶出液を採取するには、カラム上の色(MARS色素は薄緑色から青色)を見るか、280nmでの吸光度を測定します(A280)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>回収した溶液を遠心フィルターで1~2mg/mLに濃縮する。</li>
	<li>ナノプレートリーダーでコンジュゲート溶液の紫外可視(UV-Vis)スペクトルを測定することにより、濃度および平均標識度(DOL、色素対タンパク質比)を決定する。 注 :補足材料 は、計算のためのMARS染料NHSエステルの特性を提供する。二次抗体の通常のDOLは3前後です。</li>
</ol>2. 組織サンプル調製
<ol><li>パラホルムアルデヒド固定マウス脳組織。<ol>
<li>マウス(C57BL/6J、雌、生後25d)をイソフルランで麻酔する。つま先ピンチテストで適切な麻酔を評価します。</li>
		<li>子宮頸部変位によってマウスを殺す。PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を経心的に直ちにマウスに灌流する。</li>
		<li>マウスの脳を収集し、手順2.1.4-2.1.5を実行します。</li>
		<li>矢状縫合糸に沿って脳幹から上方に切断する。頭蓋骨の2つの半分を横に剥がし、ピンセットで脳をすくい取ります。</li>
		<li>採取した脳をPBS中の4%PFAで4°Cで24時間固定する。その後、PBS緩衝液で脳を4°Cで24時間洗浄し、余分なPFAを除去した。</li>
		<li>固体アガロースをビーカー内の最終濃度7%(w / v)の水に入れ、蓋を緩めます。ガラス製の攪拌棒で溶液を攪拌する。溶液が透明になるまでスラリーをマイクロ波で加熱する。</li>
		<li>アガロースを45〜55°Cまで冷却する。</li>
		<li>液体アガロースを小さなチャンバーに注ぎ、PBSから液体アガロースに脳を移し、ヘラで向きを変えて脳を埋め込む。組織 - アガロースブロックが硬化するのを待ちます。</li>
		<li>組織アグロスをビブラートームを用いて厚さ40μmの冠状スライスに切開する。</li>
		<li>組織を4ウェルプレートに移し、以下の染色を行った。ピンセットでアガロースを取り除きます。1mLのPBSで組織を3回洗浄する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凍結マウス膵臓組織を固定した。<ol>
<li>マウス膵臓をPBS中の4%PFAで4°Cで固定し、16〜20時間揺動させる。</li>
		<li>サンプルを1mLのPBS(4°C)で3回洗浄し、PFAを除去した。</li>
		<li>サンプル(約0.3~0.5cmのサイズ)を最適な切断温度(OCT)複合ブロックに埋め込みます。プラスチック製のクライオモールドにOCTを2滴入れます。組織を正しい向きに置き、組織のどれも露出したままにならないまで、組織の上にOCTを注ぎます。</li>
		<li>膵臓を8μm厚のスライスに切開し、組織結合スライドガラス上に固定化し、-80°Cで保存する。</li>
		<li>染色する前に、標本をRTに平衡化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FFPE サンプル。<ol>
<li>FFPEティッシュスライドを60°Cで10分間焼きます。</li>
		<li>脱パラフィンおよび再水和:以下の溶液にサンプルを順次入れ、RTの50mLチューブに3分間、軽度の振とうで毎回置きます。 キシレンを2回、 エタノールを2回、 脱イオン水中の95%(体積/体積)エタノールを2回、 脱イオン水中の70%(体積/体積)エタノールを2回、 脱イオン水中の50%(体積/体積)エタノールを1回、 脱イオン水を1回。</li>
		<li>ガラス瓶中で100°Cで20mMクエン酸ナトリウム(pH8.0)にサンプルを移す。組織が溶液に浸されていることを確認してください。</li>
		<li>瓶を60°Cの水浴に45分間入れる。</li>
		<li>RTで脱イオン水でサンプルを5分間洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 組織免疫-eprSRS染色
<ol><li>疎水性ペンを使用して、スライド上の組織切片の周りに境界を描きます。 注:スライド染色ジャーは、スライド上の組織のインキュベーションステップに従うために使用されます。浮遊組織(厚さ40μmのマウス脳切片)をウェルプレートで染色する。</li>
	<li>組織を0.3〜0.5%PBST(PBS中のTriton X-100)で10分間インキュベートする。</li>
	<li>組織をブロッキングバッファー(5%ロバ血清、0.5%Triton X-100 PBS中)で30分間インキュベートする。</li>
	<li>一次染色液を調製する:すべての一次抗体を所望の濃度で200〜500μLの染色バッファー(2%ロバ血清、PBS中の0.5%Triton X-100)に加える。一次染色液を13,000 x g で5分間遠心分離する。沈殿物が形成された場合にのみ上澄み液を使用してください。</li>
	<li>組織を一次抗体溶液中で4°Cで1〜2日間インキュベートする。 メモ:スライド上の組織切片を染色するには、湿度を維持するためにウェットワイプ付きの染色ボックスにサンプルを入れてください。</li>
	<li>スライドをRTで0.3~0.5% PBSTで3回、それぞれ5分間洗浄します。浮遊組織には1mLのPBSTを使用してください。スライド上の組織の場合は、スライド染色ジャーでスライドを洗浄し、組織がすべて溶液に浸されていることを確認します。</li>
	<li>組織を200〜500μLのブロッキングバッファーで30分間インキュベートする。</li>
	<li>二次染色液を調製する:すべての二次抗体(および必要に応じてレクチン)を所望の濃度(通常10μg/mL)の200〜500μLの染色バッファーに加える。二次染色液を13,000 x g で5分間遠心分離する。沈殿物が形成された場合にのみ上澄み液を使用してください。</li>
	<li>組織を200〜500μLの二次抗体溶液中で4°Cで1〜2日間インキュベートする。</li>
	<li>スライドをRTで0.3~0.5% PBSTで2回、それぞれ5分間洗浄します。</li>
	<li>200~500 μLのDAPI溶液と30分間インキュベートする。</li>
	<li>スライドをRTでPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。</li>
	<li>浮遊組織切片の場合は、ガラス滴下ピペットでスライドガラスに移します。ティッシュブラシでティッシュを広げ、必要に応じてワイプで周囲をきれいにします。</li>
	<li>ガラスカバースリップで退色防止試薬の滴に組織をマウントし、マニキュアで固定します。</li>
</ol>4. SRS顕微鏡アセンブリ
注:タンデムSRS蛍光イメージングでは、市販の共焦点蛍光システムが使用されます。さらなる説明は、以前の報告書17に見出すことができる。このプロトコルは、狭帯域励起を使用したSRSイメージング側に焦点を当てます。
<ol><li>温度制御の入った部屋に防振光学テーブルを用意する。</li>
	<li>同期デュアルレーザーシステム(ポンプとストークス)を光学テーブル(図2A)に置き、チラーを接続します。 メモ:デュアルレーザシステムの基本レーザは、6psのパルス幅と80MHzの繰り返しレートで1064nmの出力パルス列を提供します。ストークスビームは基本レーザーからのものです。ストークスビームの強度は、変調深度90%を超える8MHzの内蔵電気光学振幅変調器(EOM)によって正弦波状に変調された。基本レーザの他の部分は周波数を2倍の532nmにし、さらにピコ秒光パラメトリック発振器(OPO)を同期的にシードして、5〜6psのパルス幅のモードロックパルス列を生成するために使用されます(OPOのアイドラービームは干渉フィルタでブロックされます)。OPOの出力波長は、ポンプビームとして機能する720〜950nmから調整可能です。</li>
	<li>ミラー(波長範囲:750-1100 nm)、ダイクロイックビームスプリッター(DBS、980 nmロングパスフィルター、長方形)、およびレンズ(無彩色、650-1050 nmのARコーティング)をそれぞれのマウントに取り付けます。ミラーとダイクロイックビームスプリッターには、非常に安定した運動学的ミラーマウントを使用してください。</li>
	<li>レーザー出力の高さと、ポンプとストークスビームのビームサイズを測定します。ミラーとレンズの高さを調整して、光がすべての光学素子の中心に当たるようにします。</li>
	<li>ミラーM1を光学テーブルの上に置き、レーザー出力に対して約45°にします(図2B)。キネマティックマウントのノブを使用して、チップとチルトを調整します。ライトがテーブルの長さに沿って同じ高さで移動し、テーブルに対して直線になるようにします。</li>
	<li>ダイクロイックビームスプリッタ(980nmロングパスフィルタ)とミラーを配置して位置合わせし、ポンプビームとストークスビームを分割します(図2A-B)。</li>
	<li>各ビーム経路にレンズペア(L1、L2、L3、L4)を配置して位置合わせし、ビームを平行化し、対物レンズの背面瞳孔と一致するようにビーム直径を拡大します(図2A-B)。</li>
	<li>M7ミラーとM8ミラーを使用して、組み合わせたレーザービームを顕微鏡に合わせます(図2C)。最初に一方のビームを顕微鏡に位置合わせし、他方のビームにミラーペアを使用して、2つのビームの空間的オーバーラップを確保します。</li>
	<li>検出部品を設定します。<ol>
<li>赤外線コーティングされたオイルコンデンサー(1.4-NA)を装着し、試料を通過した後に順方向ポンプとストークスビームを収集します(図2C)。</li>
		<li>大面積SiフォトダイオードをBNCコネクタ付きのシールドボックスに取り付けます(図2E)。実装されたフォトダイオードに64V DC電源を追加して、飽和スレッショルドと応答帯域幅を増やします。</li>
		<li>2インチミラーで前方の光を反射します。光フィルタを使用して変調するストークスビームをブロックした後、光をフォトダイオードに再集束させます(図2D)。</li>
		<li>フォトダイオードの出力電流を、信号復調のために50で終端された高速ロックインアンプに送信します。8MHzのトリガをリファレンス信号としてロックインアンプに送信します。</li>
		<li>ロックインアンプの同相X成分を顕微鏡のアナログインターフェースボックスに送ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>顕微鏡で純粋なD2O液体のSRS信号を測定することにより、内蔵の電動遅延ステージとの時間のオーバーラップを最適化します。</li>
</ol>5. 画像の取得と解析
<ol><li>シーケンシャルポンプ波長チューニングによるマルチチャンネルepr-SRSイメージングを実行します。<ol>
<li>レーザーコントロールパネルで、レーザー出力を Pポンプ = 10-40 mW、 Pストークス = 40-80 mWに設定します。</li>
		<li>ピクセルの滞留時間を2~4μsに設定し、顕微鏡ソフトウェアで平均10~20フレームの複数フレームを使用します。 注:多光子励起によるラマン色素の「漂白効果」を引き起こす可能性のある高レーザー出力(Pポンプ>40mW、 Pストークス<>80mW)の組み合わせ使用は避けてください。</li>
		<li>ロックインアンプの時定数をピクセルドウェル時間の半分に設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リニアスペクトルアンミキシング。 注:epr-SRSは、全濃度範囲にわたって厳密な線形信号対濃度依存性に従います。したがって、線形スペクトルのアンミキシングは、チャンネル間の潜在的なクロストークを除去するのに効果的です。N MARSプローブによるNチャネルepr-SRS測定の場合、測定された信号(S)はS = MCと表すことができ、ここでCはMARSプローブ濃度であり、MはMARSプローブのラマン断面によって決定されるNx N行列である。 <ol>
<li>異なるMARSプローブで標識した単色免疫eprSRSサンプル上のマトリックス M を測定します。</li>
		<li>式 C = M−1·Sは、多重試料信号測定S を用いてMARSプローブの濃度行列を決定し た。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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ここでは、新しく保存されたマウス組織、FFPEヒト組織、および凍結マウス組織を含む一般的な組織タイプに広く適用可能な免疫eprSRSプロトコルを提示する。免疫-eprSRSは、表1に列挙されているように、細胞および組織におけるエピトープのパネルについて検証されている。このワンショットプラットフォームは、サイクリック戦略がうまく機能しないアプリケーションに特に適しています。例えば、環状蛍光は、3D免疫標識の複数回のラウンドが実用的で長いため、厚い組織に対して要求されています17。また、非線形3D組織学的変化による登録誤差が生じる可能性が非常に高い11,17。Immuno-eprSRSは、このようなシナリオにおける環状蛍光の実際的な障壁を克服し、大量のタンパク質相互作用ネットワークを明らかにする機会をもたらします17。
現在の多重性は、主に二...

複雑な組織系は、空間的位置および相互作用ネットワークがそれらの機能および機能不全と深く絡み合っている別個の細胞亜集団から構成される1,2。組織構造を明らかにし、その複雑さを調べるためには、単一細胞分解能でのタンパク質の空間的位置の知識が不可欠です。したがって、高度に多重化されたタンパク質イメージング技術はますます高く評価されており、組織生物学を研究するための礎石になる可能性があります3,4,5。現在の一般的な多重化タンパク質イメージング方法は、2つの主要なカテゴリに分類することができる。1つは、組織染色およびイメージングの複数回のラウンドに依存する連続免疫蛍光イメージングであり、もう1つは、重金属タグ付き抗体6、7、8、9、10、11、12と結合されたイメージングマスサイトメトリーである。
ここでは、多重化抗体ベースのタンパク質イメージングのための代替戦略が導入される。広い励起スペクトルと発光スペクトル(半値全幅(FWHM)〜500cm-1)のために同時に4〜5チャンネルしか視覚化できない一般的な蛍光イメージングモダリティとは異なり、ラマン顕微鏡ははるかに狭いスペクトル線幅(FWHM〜10cm-1)を示し、スケーラブルな多重性を提供します。最近、狭いスペクトルを利用することによって、電子事前共鳴刺激ラマン散乱(epr−SRS)顕微鏡法と名付けられたラマン顕微鏡の新規なスキームが開発され、多重化画像化のための強力な戦略を提供する13。epr-SRSは、ラマン色素の電子的に結合された振動モードをプローブすることにより、ラマン断面に対して10 13倍の劇的な増強効果を達成し、従来のラマン顕微鏡(図1A)13、14、15の感度ボトルネックを克服します。その結果、epr-SRSの検出限界はサブμMに押され、細胞内の特定のタンパク質や細胞小器官などの興味深い分子マーカーのラマン検出が可能となった13,16。特に、ラマン色素結合抗体を利用して、細胞および組織中の特定のタンパク質のepr-SRSイメージング(免疫-eprSRSと呼ばれる)が、標準的な免疫蛍光に対して同等の感度で実証されました(図1B)13、17。ポンプの波長をわずか2nmだけ同調させることで、epr-SRS信号は完全にオフになり(図1B)、高い振動コントラストを示します。
プローブ側では、抗体コンジュゲーション13、18、19、20のためにマンハッタンラマン散乱(MARS)色素と呼ばれる虹のようなラマンプローブのセットが開発されている。このユニークなラマンパレットは、π共役三重結合を持つ新規色素(補足資料)で構成され、それぞれが生体直交ラマンスペクトル範囲で単一の狭いepr-SRSピークを表示します(図1C)。コア発色団の構造を改変し、三重結合の両原子を同位体編集することにより(補足資料)、スペクトル的に分離されたラマンプローブが開発されている。スケーラブルな多重性を活用して、MARS色素パレットと組み合わせたepr-SRS顕微鏡は、細胞および組織におけるワンショット多重タンパク質イメージングのための光学戦略を提供します。
Immuno-eprSRSは、独自の強みを持つ現在のマルチプレックスタンパク質イメージング法に代わる戦略を提供します。周期的な染色、イメージング、シグナル除去による蛍光アプローチと比較して、このラマンベースのプラットフォームは、シングルラウンド染色とイメージングを保証します。したがって、巡回手順の実際的な複雑さを回避し、プロトコルを大幅に簡素化し、多重化タンパク質イメージングの新しい領域を開きます。例えば、ラマン色素に合わせた組織透明化プロトコルを利用して、免疫eprSRSは3次元に拡張され、厚いインタクト組織における高度に多重化されたタンパク質マッピングが可能になりました17。10以上のタンパク質標的を、厚さミリメートルのマウス脳組織に沿って可視化した17。より最近では、免疫eprSRSを最適化された生体分子保持膨張顕微鏡(ExM)プロトコル21と結合させることで、複数の標的のワンショットナノスケールイメージングも実証されている22。イメージング質量分析法4,9と比較して、epr-SRSは非破壊的であり、本質的に光学的切断能力を有する。さらに、epr-SRSは、組織スキャンにおいてより時間効率が良い。通常、ピクセルサイズが0.5μmの0.25mm2の組織領域は、単一のepr-SRSチャネルの画像化に数分しかかかりません。例えば、図4の4つのSRSチャネルと4つの蛍光チャネルの合計イメージング時間は約10分である。

<table><tbody><tr><td>16% パラホルムアルデヒド、EM グレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>&-tubulin</td><td>Abcam</td><td>ab18251</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>&-tubulin</td><td>BioLegend</td><td>625902</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>&β;-III-tubulin</td><td>BioLegend</td><td>657402</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>&beta;-III-tubulin</td><td>Abcam</td><td>ab41489</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>&β;-tubulin</td><td>Abcam</td><td>ab131205</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>アガロース、低ゲリング温度</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414</td><td>脳埋め込み用</td></tr><tr><td>ウサギで産生される抗a-tubulin抗体 (&α;-tubulin)</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>1次抗体</td></tr><tr><td>マウスで産生される抗カルビンジン抗体 (Calbindin)</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>抗GABA B受容体 R2&nbsp; モルモットで産生される抗体 (GABA B receptor R2)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>AB2255</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ヤギで産生される抗GFAP抗体 (GFAP)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-18598</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>抗グルカゴン&nbsp; マウスで産生される抗体 (Glucagon)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-514592</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>モルモット産生抗インスリン抗体(インスリン)</td><td>DAKO</td><td>IR00261-2</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ラット産生抗MBP抗体(MBP)</td><td>アブカム</td><td>ab7349</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ウサギ産生抗NeuN抗体(NeuN)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-78639</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ヤギで産生される抗膵臓ポリペプチド(PP)抗体-膵臓ポリペプチド(PP)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>SAB2500747</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ウサギで産生される抗Pdx1抗体 (Pdx1)</td><td>Milipore</td><td>06-1379</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ラットで産生される抗ソマトスタチン抗体 (ソマトスタチン)</td><td>アブカム</td><td>ab30788</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ニワトリで産生される抗ビメンチン抗体 (Vimentin)</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td><td></td><td>KRエレクトロニクス KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>BNC 50 Ω ターミネーター</td><td>ミニ回路</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNCケーブル</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>同軸ケーブル、BNC オス/オス</td></tr><tr><td>広帯域誘電体ミラー</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>機コンデンサー</td><td>オリンパス</td><td></td><td>オイル浸漬、1.4 N.A.</td></tr><tr><td>サイトケラチン 18</td><td>Abcam</td><td>ab7797</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>サイトケラチン 18</td><td>Abcam</td><td>ab24561</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>DC電源</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td>バイアス電圧は64V</td></tr><tr><td>ダイクロイックマウント</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td>キネマティックマウント 最大1.3インチ(33mm) 高さ 長方形光学系、左利きロ</td></tr><tr><td>バ アンチチキン IgY (H+L)</td><td>ジャクソンImmunoResearch</td><td>703-005-155</td><td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-005-147</td><td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-005-148</td><td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-005-151</td><td>MARS標識用二次抗体</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-005-152</td><td>MARS標識用二次抗体</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-005-153</td><td>MARS標識用二次抗体</td></tr><tr><td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-005-147</td><td>二次抗体MARS標識用抗体</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Abcam</td><td>ab71916</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>443611</td><td></td></tr><tr><td>高速ルックインアンプ</td><td>チューリッヒ・インスツルメンツ</td><td>HF2LI</td><td>DC - 50 MHz</td></tr><tr><td>FFPE 腎臓サンプル</td><td>USBiomax</td><td>HuFPT072</td><td></td></tr><tr><td>Fibrillarin</td><td>Abcam</td><td>ab5821</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-514592</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>H2B</td><td>Abcam</td><td>ab1790</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>高O.D.バンドパスフィルター</td><td>クロマテクノロジー</td><td>ET890/220m</td><td>ストークスビームをフィルタリングし、ポンプビームを透過させる</td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・NC1384846</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>・サーモフィッシャー</td><td></td><td>701265 一次抗体</td></tr><tr><td>統合型SRSレーザーシステム</td><td>応用物理学 &エレクトロニクス株式会社</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALDは、1,064nmのパルス幅6ps、繰り返し周波数80MHzの出力パルス列を提供し、これがストークスビームとして機能します。532nmの周波数倍増ビームは、ピコ秒光パラメトリック発振器(OPO)を同期してシードし、パルス幅が5~6psのモードロックパルス列を生成するために使用されます(OPOのアイドラービームは干渉フィルターでブロックされます)。OPOの出力波長は720°dashから調整可能です。950nm、これはポンプビームとして機能します。1,064nmのストークスビームの強度は、8MHzの内蔵EOMによって正弦波に変調され、変調深度は90%を超えます。ポンプビームは、ピコエメラルド内部のダイクロイックミラーを使用して、ストークスビームと空間的に重なっています。ポンプパルス列とストークスパルス列の時間的オーバーラップは、内蔵の遅延ステージで達成され、顕微鏡での純粋なD2OのSRS信号によって最適化されます。</td></tr><tr><td>倒立レーザー走査型顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>キネマティック ミラー マウント</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 ロープロファイル ヘックス アジャスター</td></tr><tr><td>レクチン Triticum vulgaris (小麦) Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>L0636-5 mg</td><td></td></tr><tr><td>ロングパス ダイクロイック ビーム スプリッター</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm レーザー BrightLine&nbsp;シングルエッジレーザーフラットダイクロイックビームスプリッター</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>BioLegend</td><td>801810</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>顕微鏡イメージングソフトウェア</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Plate</td><td>Tecan</td><td></td><td>プレートリーダーでの吸光度ベースの小容量分析用。</td></tr><tr><td>正常なロバ血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 4-Well Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-300</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>Olympus</td><td>XLPlan N</td><td>x25, 1.05-NA, MP, working distance&thinsp;=&thinsp;2&thinsp;mm</td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペリスコープアセンブリ</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>には、上部と下部のユニットが含まれています。1インチのポスト、およびクランプフォーク。</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200 PRO</td><td>使いやすいマルチモードプレートリーダーです。230&ndashのスペクトル範囲にわたる吸光度測定機能。1000nm。</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Invitrogen</td><td>51-6900</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>Sephadex G-25 Medium</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0033-01</td><td>脱塩およびバッファー交換用ゲルろ過樹脂</td></tr><tr><td>BNCコネクタ付きシールドボックス</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>アルミニウムボックス カバー付き、BNC メス/メス</td></tr><tr><td>Siフォトダイオード</td><td>Thorlabs</td><td>FDS1010</td><td>350&ndash;1100 nm、10 mm x 10 mm アクティブエリア</td></tr><tr><td>Synapsin 2</td><td>ThermoFisher</td><td>OSS00073G</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035813</td><td>新鮮な組織切片またはホルマリン固定組織切片をスライド表面にしっかりと引き付け、化学的に結合する接着スライド (tiisue bindling glass slides)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>ビブレータ</td><td>ライカ</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>ビメンチン</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>214736</td><td></td></tr></tbody></table>

ラマン色素による高多重化組織イメージング

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

組織内の膨大な範囲の特定のバイオマーカーを視覚化することは、複雑な生物学的システムの複雑な組織を探索する上で重要な役割を果たします。したがって、高度に多重化されたイメージング技術はますます高く評価されています。ここでは、虹のようなラマン色素の電子事前共鳴刺激ラマン散乱(epr-SRS)イメージングによる標準的な免疫蛍光に匹敵する感度を持つ特定のタンパク質の高度に多重化された振動イメージングの新たなプラットフォームについて説明します。この方法は、従来の免疫蛍光におけるスペクトル的に解決可能なチャネルの限界を回避し、細胞内分解能を有する組織中の複数のマーカーを調査するためのワンショット光学的アプローチを提供する。一般に、パラホルムアルデヒド固定組織、凍結組織、およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト組織を含む標準的な組織調製物と適合性があります。このプラットフォームは、特に厚い無傷の組織について、生物学的標本のタンパク質相互作用のより包括的な全体像を提供すると想定しています。このプロトコルは、抗体調製から組織サンプル染色、SRS顕微鏡アセンブリ、epr-SRS組織イメージングまでのワークフローを提供します。

図3は、固定細胞(図3A)、パラホルムアルデヒド(PFA)固定マウス組織(図3B)、およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト試料(図3C)を含む異なる試料におけるepr-SRSの例の画像を示す。SRS顕微鏡の空間分解能は回折制限があり、典型的な横方向分解能は〜300nmであり、軸方向分解能は励起に近赤外光を使用して1〜2μmである。その結果、HeLa細胞における微小管などの微細な細胞下構造が、α-チューブリンの免疫-eprSRSイメージングにより忠実に明らかになった(図3A)。さらに、epr-SRSは一般にFFPE組織と適合性があり(図3C)、これは臨床診断および病理学研究のための生検標本の一般的な形態である。2光子蛍光顕微鏡と同様に、非線形プロセスとして、epr-SRSは...

虹のようなラマン色素の電子事前共鳴刺激ラマン散乱(epr-SRS)イメージングは、高度に多重化されたエピトープベースのタンパク質イメージングのための新しいプラットフォームです。ここでは、抗体調製、組織サンプル染色、SRS顕微鏡アセンブリ、およびepr-SRS組織イメージングを含む実用的なガイドを紹介します。

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...

高度に多重化された振動イメージングは、細胞内分解能で組織内の複数のタンパク質マーカーを調査するためのワンショット光学的アプローチを提供します。このプラットフォームは、生物学的システムのタンパク質相互作用の包括的な画像を提供します。この技術の主な利点は、サイクルフリーの多重性です。この技術は、厚い組織切片など、サイクリング戦略がうまく機能しない用途に特に適しています。この方法は、組織アトラスの構築、腫瘍微小環境の表現型決定、脳回路のプロファイリングなど、複雑なシステムの構造を理解するために、その場で個々の細胞特性評価を可能にします。開始するには、コンジュゲーション緩衝液として使用するPHA 0.3のPBS緩衝液中に約0.1モルの炭酸水素ナトリウムを調製し、それを摂氏4度で保存する。次いで、無水ジメチルスルホキシド中の3ミリモルのn−ヒドロキシスクシンイミドエステル官能MARSプローブ溶液を調製する。抗体固形物をコンジュゲーションバッファーに溶解させて、1ミリリットルあたり2ミリグラムの濃度にする。他の緩衝液に溶解した抗体の場合は、遠心フィルターで濃縮してから、コンジュゲーションバッファーに1ミリリットルあたり1〜2ミリグラムの濃度で加えます。二次抗体のコンジュゲーション反応を行うには、ガラスバイアル瓶の抗体溶液に15倍モル過剰の色素溶液を攪拌しながらゆっくりと加え、攪拌しながら反応混合物を室温で1時間インキュベートする。精製を行うには、50ミリリットルのチューブ内の40ミリリットルのPBS緩衝液に10ミリリットルのゲル濾過用樹脂粉末を加えてスラリーを調製する。溶液を摂氏90度の水浴に1時間保管する。次に、上清をデカントし、PBSを最大40ミリリットルまで加え、スラリーを摂氏4度で保存する。サイズ排除カラムにスラリー溶液を10〜15センチメートルの高さまで充填し、次いで約10ミリリットルのPBSでカラムをすすぎ洗いし、さらに樹脂を充填する。続いて、コンジュゲーション反応混合物をカラムにピペットで通す。反応混合物を装填した後、直ちに溶出緩衝液として1ミリリットルのPBSを加える。その後、カラム上の色を見るか、280ナノメートルでの吸光度を測定することによって、コンジュゲート溶液の溶離液を回収する。遠心フィルターを使用して、回収した溶液を1ミリリットルあたり1〜2ミリグラムに濃縮する。疎水性ペンを使用して、スライド上の組織切片の周囲に境界を描きます。次いで、組織を0.3〜0.5%PBSTで10分間、ブロッキングバッファーで30分間インキュベートする。一次染色溶液を調製するために、すべての一次抗体を所望の濃度で200〜500マイクロリットルの染色緩衝液に添加する。一次染色液を13,000倍Gで5分間遠心分離し、沈殿物が現れた場合は上清を使用する。次いで、一次抗体溶液中

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典:エスピノーザ、R.、他.組織診断のためのマウス脳のリアルタイム2色刺激ラマン散乱イメージング. J. Vis. Exp.

マウス脳組織の2色刺激ラマン散乱イメージング

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。...

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、強力で非破壊的でラベルフリーのイメージング技術です。新しい用途の1つは刺激ラマン組織学であり、タンパク質および脂質ラマン遷移における2色SRSイメージングを使用して、擬似ヘマトキシリンおよびエオジン画像を生成する。ここでは、組織診断のためのリアルタイムの2色SRSイメージングのためのプロトコルを実証します。...

組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

本稿では、スペクトル集束モジュールとデュアル出力パルスレーザーを統合し、金ナノ粒子と癌細胞の高速ハイパースペクトルイメージングを可能にする方法について説明します。この研究は、標準的なレーザー走査型顕微鏡でマルチモーダル非線形光学技術の詳細を実証することを目的としています。...

マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング

我々は、広帯域刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡で化学画像を取得するためのプロトコルを提示する。差動マルチチャンネルロックイン検出で動作するSRS顕微鏡に基づいて、このプロトコルは、サンプル調製、SRS装置の調整、および化学的に不均一なサンプルの異なる成分を解きほぐすためのケモメトリックスを記述しています。...

広帯域刺激ラマン散乱顕微鏡に基づく多重化学イメージング

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

ラベルフリーの光学イメージングモダリティを組み合わせたマルチモーダルプラットフォームを利用して、細胞のダイナミクスと代謝を視覚化および定量化するためのプロトコルを開発しました。多光子蛍光、第2高調波発生、および誘導ラマン散乱顕微鏡によるイメージングを通じて、細胞および分子環境の全体像を生成することができます。...

細胞代謝研究のためのマルチモーダル光学イメージングプラットフォーム

このプロトコルは、生きたヒト乳がん細胞のラベルフリー、非侵襲的な表現型解析のためのラマン分光法と断層撮影位相顕微鏡を組み合わせたマルチモーダルアプローチを提示します。これには、迅速で定量的な形態化学分析のためのユーザーフレンドリーでヒューマンバイアスのない分析パイプラインが含まれており、がん研究や細胞生物学への応用で詳細な分子および構造の洞察を提供します。...

生きたラベルフリー乳がん細胞の表現型解析を進めるためのマルチモーダルイメージングフレームワーク

スペクトル共焦点顕微鏡を使用したハイプレックスイメージングにより、非特異的組織蛍光を最小化

学ぶ：epr-SRSイメージングによる高多重化タンパク質可視化法。厚い組織切片でのサイクルフリーな多重染色を実現し、細胞レベルでのタンパク質相互作用解析や腫瘍微小環境の表現型解析に応用できます。

ラマン色素による高多重化組織イメージング

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