Name: マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぶマウス小腸上皮オルガノイドとILC1の共培養法。腸管免疫細胞と上皮細胞の双方向相互作用を解析し、炎症性消化器疾患のメカニズム解明に貢献する実験系を確立します。

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E.R.はウェルカム・トラスト(215027/Z/18/Z)の博士号取得を認めています。G.M.J.はウェルカム・トラスト(203757/Z/16/A)の博士課程フェローシップを認めています。ワシントンD.C.は、NIHR GSTBから博士号を取得していることを認めています。J.F.N.は、マリー・スクウォドフスカ・キュリー・フェローシップ、キングス・プライズ・フェローシップ、RCUK/UKRIラザフォード基金フェローシップ(MR/R024812/1)、ウェルカム・トラスト(204394/Z/16/Z)の科学におけるシード・アワードを受賞しました。また、ガイズ病院に拠点を置くBRCフローサイトメトリーコアチームにも感謝します。Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6レポーターマウスは、G. Eberl(パスツール研究所、パリ、フランス)からの寛大な贈り物でした。CD45.1 C57BL/6マウスは、T. Lawrence(キングス・カレッジ・ロンドン、ロンドン)とP. Barral(キングス・カレッジ・ロンドン、ロンドン)から親切に与えられた。

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<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-25-responsive%2C+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+%27inflammatory%27+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529, 226-230 (2016).</li>
<li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma%28t%29+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+lymph+nodes+collect+CD4%2BCD3-+LTbeta%2B+cells+that+can+differentiate+to+APC%2C+NK+cells%2C+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li>
<li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li>
<li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li>
<li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117(2018).</li>
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<li>Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+infectious+diseases+and+host-microbe+interactions+in+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids.</a> Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).</li>
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<li>Cardoso, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+type+2+innate+lymphoid+cells+via+neuromedin+U%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U.</a> Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).</li>
<li>Gury-BenAri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+and+regulatory+landscape+of+intestinal+innate+lymphoid+cells+are+shaped+by+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome.</a> Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).</li>
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</ol>

著者には利益相反はありません。

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドを確立し、腸解離プロトコル中のリンパ球の損失を最小限に抑えることによって希少ILC1を単離し、これら2つのコンパートメント間の共培養を確立するための方法を記述している。このプロトコルには多くのステップがあり、ILC1に固有のものもありますが、このアプローチは他の腸管免疫細胞タイプにも適用でき、共培養セットアップは個々の研究課題に合わせてモジュール式に適合させることができます。ここでは、いくつかの重要な手順 (逸脱しないように推奨) と、このプロトコルの技術的に困難な要素のトラブルシューティング ガイドラインについて説明します。
単一のLgr5+-eGFP腸幹細胞からのマウス小腸オルガノイドの使用は、ますます確立されつつある33,34;しかし、このプロトコルでは、CD45.1動物からLieberkuehnの無傷の、全体の地下室を単離することが示唆されている。無傷の陰窩は単一のLgr5+細胞よりも迅速に回復<...

腸上皮と腸常駐免疫系との間のコミュニケーションは、腸の恒常性の維持の中心である1。これらの相互作用の中断は、炎症性腸疾患(IBD)および胃腸癌を含む局所疾患および全身性疾患の両方と関連している2。ホメオスタシスの重要な調節因子の注目すべき例は、腸の免疫ランドスケープにおける主要なプレーヤーとして出現した先天性リンパ球細胞(ILC)の研究から来ている3。ILCは、腸の恒常性を調節し、主にサイトカイン媒介シグナル伝達を介して炎症を調節する異種自然免疫細胞のグループである4。
マウスILCは、転写因子、受容体、およびサイトカイン発現プロファイルに基づいてサブタイプに大別される5。細胞傷害性ナチュラルキラー(NK)細胞およびヘルパー様1型ILC(ILC1s)を含む1型ILCは、それぞれT細胞(T-bet)6で発現される転写因子(エオメソダーミン)EomesおよびT-boxタンパク質の発現によって定義され、Tヘルパー1型(TH1)免疫に関連するサイトカインを分泌する:インターフェロン-γ(IFNγ)および腫瘍壊死因子(TNF)は、インターロイキン(IL)-12に応答して、 IL-15およびIL-187.恒常性維持の間、組織常駐型ILC1はトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)を分泌し、上皮増殖およびマトリックスリモデリングを促進する8。2型ILC(ILC2s)は、主にTヘルパー2型(TH2)関連サイトカイン(IL-4、IL-5、およびIL-13)の分泌を介して蠕虫感染に応答し、レチノイン酸関連オーファン受容体(ROR)α(ROR-α)9およびGATA結合タンパク質3(GATA-3)の発現によって特徴付けられる10、11、12.マウスにおいて、腸管「炎症性」ILC2sは、キラー細胞レクチン様受容体(サブファミリーGメンバー1、KLRG)13の発現によってさらに特徴付けられ、そこでは上皮房細胞由来IL−25に応答する14、15。最後に、リンパ組織誘導細胞およびヘルパー様3型ILC(ILC3s)を含む3型ILCは、転写因子ROR-γt16に依存しており、局所IL-1βおよびIL-23シグナルに応答して顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、IL-17、またはIL-22のいずれかを分泌する群にクラスター化される17。リンパ組織誘導細胞はパイエル板に集積し、発生中のこれらの二次リンパ器官の発達に重要である18が、ILC3は成体マウス小腸粘膜固有層において最も豊富なILCサブタイプである。ILC3sを用いた最古のマウス腸管オルガノイド共培養系の1つは、再生ILC-上皮相互作用の強力な例であるGタンパク質共役受容体5(Lgr5)+腸幹細胞増殖19を含む転写3(STAT-3)のシグナルトランスデューサおよびアクチベーターに対するサイトカインIL-22の影響を引き離すために利用された。ILCは、器官20,21間にインプリント不均一性を示し、分極サイトカイン22に応答してサブセット間で可塑性を示す。これらの組織特異的な痕跡と可塑性の違いを駆動するもの、およびIBD23などの慢性疾患においてそれらが果たす役割は、オルガノイド共培養を使用して対処できるエキサイティングなトピックのままです。
腸管オルガノイドは、腸上皮を研究するための成功し、信頼できるモデルとして浮上している24、25。これらは、腸上皮Lgr5+幹細胞、またはWntファミリーメンバー3A(Wnt3a)の内因性供給源としてパネス細胞を含む単離された陰窩全体を培養することによって生成される。これらの3D構造は、合成ヒドロゲル26または基底粘膜固有層を模倣する生体材料、例えば熱架橋基礎細胞外マトリックス(TBEM)のいずれかで維持され、さらに周囲のニッチを模倣する成長因子、特に上皮成長因子(EGF)、骨形成タンパク質(BMP)阻害剤ノギン、およびLgr5リガンドおよびWntアゴニストR-Spondin127で補充される。.これらの条件下では、オルガノイドは上皮アピコ基底極性を維持し、オルガノイドの中心で吸収性および分泌性細胞に最終的に分化する出芽幹細胞陰窩を用いて腸上皮の陰窩絨毛構造を反復し、次いでアノイキス28によって内部偽腔に放出される。腸オルガノイドだけでも、上皮の発達とダイナミクスの還元主義モデルとして非常に有利であったが29,30、これらの行動が免疫区画によってどのように調節され、影響を受け、あるいは破壊されるかを理解するための途方もない将来の可能性を秘めている。
以下のプロトコールでは、マウス小腸オルガノイドと固有層由来ILC1sとの間の共培養の方法が記載されており、これは最近、この集団が炎症の腸シグネチャを予期せず減少させ、代わりにこのシステムにおけるTGF−β を介 した上皮増殖の増加に寄与する方法を特定するために使用された8。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD45 (BV510)</td><td>BioLegend</td><td>103137</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス NK1.1 (PE)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-5941-83</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50X)、無血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD127モノクローナル抗体 (APC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD19 モノクローナル抗体 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3e モノクローナル抗体 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 モノクローナル抗体 (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>COLLAGENASE D, 500MG</td><td>Merck</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells</td><td>細胞株は、条件付けされたRSpondin1上清を回収するために使用され、細胞株および材料移転契約は、リーランドスタンフォードジュニア大学の評議員会(Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)</td>によって提供されました。<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>メルク</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) ダルベッコ修正イーグル中栄養混合物 F-12 (アドバンスド DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNASE I, グレード II</td><td>メルク</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグル培地 (1X)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>エチレジアミン四酢酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2482-100</td><td></td></tr><tr><td>FC block</td><td>2B Scientific</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>3050-038</td><td></td></tr><tr><td>Hank' Balanced Salt Solution (10X)</td><td>Gibco</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1X)</td><td>Gibco</td><td>12549069</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T- mNoggin-FC細胞</td><td>細胞株は、Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlandsとの材料移転契約を通じて取得した細胞株である、コンディショニングされたNoggin上清の回収に使用され、Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology(2012年)による発表に基づいています。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1 モノクローナル抗体 (PerCP eFluor-710)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5893-82</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子還元基底膜マトリックス、フェノールレッドフリー、LDEVフリー</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン (500mM)</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NKp46 モノクローナル抗体 (PE Cyanine7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1 X) 7.2 pH</td><td>Thermo FisherScientific</td><td>12549079</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト EGF、アニマルフリータンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-15 GMP タンパク質、CF</td><td>R&D Systems</td><td>247-GMP</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-2 (キャリアフリー)</td><td>BioLegend</td><td>589106</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-7 (キャリアフリー)</td><td>R&D Systems</td><td>407-ML-005/CF</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩(ROCK阻害剤)</td><td>Bio-techne</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Plastic<s/strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>10 mLピペット</td><td>StarLab</td><td>E4860-0010</td><td></td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td>ファルコン</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>25 mLピペット</td><td>StarLab</td><td>E4860-0025</td><td></td></tr><tr><td>p10 ピペットチップ</td><td>StarLab</td><td>S1121-3810-C</td><td></td></tr><tr><td>p1000 ピペットチップ</td><td>StarLab</td><td>I1026-7810</td><td></td></tr><tr><td>p200 ピペットチップ</td><td>StarLab</td><td>E1011-0921</td><td></td></tr><tr><td>標準的な組織培養処理済み 24 ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 and temperature controled incubator</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R/S</td><td></td></tr><tr><td>Flow Assisted Cellular Sorter</td><td>BD equipment</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>加熱シェーカー</td><td>スチュアート機器</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>アイスボックス</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr> <tr><td>倒立型光学顕微鏡</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EVOS XL コアイメージングシステム (AMEX1000)</td><td></td></tr><tr><td>p10 ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3124000016</td><td></td></tr><tr><td>p1000 ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3124000063</td><td></td></tr><tr><td>p200 ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3124000032</td><td></td></tr><tr><td>ピペットガン</td><td>エッペンドルフ</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>ウェットアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

オルガノイドと免疫細胞との複雑な共培養は、粘膜恒常性の微妙なバランスを支える双方向相互作用を調査するための汎用性の高いツールを提供します。これらの3D多細胞システムは、多因子疾患に対処し、組織常駐先天性リンパ球細胞(ILC)などの希少細胞型を研究する際に生じる技術的困難を解決するための還元主義モデルを提供します。この記事では、小腸オルガノイドと小腸粘膜固有層由来ヘルパー様1型ILC(ILC1s)を組み合わせたマウス系について説明し、他のILCまたは免疫集団に容易に拡張することができる。ILCは、粘膜に特に富む組織常駐集団であり、恒常性を促進し、損傷または感染に迅速に反応する。ILCとのオルガノイド共培養は、腸内の新しい上皮免疫シグナル伝達モジュールにすでに光を当て始めており、異なるILCサブセットが腸上皮バリアの完全性と再生にどのように影響するかを明らかにしています。このプロトコルは、粘膜恒常性と炎症のメカニズムに関する新しい洞察を提供する可能性を秘めた上皮細胞と免疫細胞との間の相互相互作用のさらなる研究を可能にする。

正常に完了すると、新しく分離された陰窩は2〜4日以内に出芽した陰窩構造を形成するはずです(図1A)。健康で堅牢なオルガノイド培養物は活発に成長している必要があり、プロトコルに詳述されているように継代および拡張することができます。
このプロトコールは、RORγtGFP マウストランスジェニックレポーターラインからの小腸ILC1の単離を記載しており、これはFACSによる生ILC1の単離を可能にする(図2)。ここで概説するプロトコルを使用して、予想されるILC1カウント範囲は、350〜3,500個の単離された細胞である。
オルガノイドを播種した後、共培養物を免疫細胞化学によって可視化することができる(図3A〜B)。ILCおよび上皮細胞は、 <strong class=...

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

このプロトコルは、腸の免疫細胞と上皮の間の相互作用を研究し、これらの相互作用が腸の恒常性と炎症をどのように調節するかを解剖するための重要なツールを提供します。この技術の主な利点は、インビトロモデルの減少によって促進される絶妙な量の実験制御であり、これは上皮および免疫生物学における疑問に対処するために使用することができる。このシステムは、CD44陽性上皮陰窩の拡大におけるILC1の役割を決定するためにすでに使用されており、炎症媒介性胃腸疾患の理解をさらに進歩させる可能性を秘めている。まず、熱架橋基底細胞外マトリックスを氷の上に置き、標準組織培養処理した24ウェルプレートを37°Cのインキュベーターに入れて解凍し、予め温めます。その後、オルガノイドを含むプレートをインキュベーターから取り出し、継代するウェルから培地を捨てる。次に、500マイクロリットルの氷冷高度DMEM F12をウェルに加え、P-1000チップを使用して、すべてのウェルからオルガノイドを15ミリリットルのチューブに収穫する。ウェルの底を250~300マイクロリットルの氷冷アドバンスドDMEM F12ですすいで、ウェルにオルガノイドが残っていないことを確認し、収穫したオルガノイドを含む15ミリリットルのチューブにプールします。1〜2日齢の収穫したオルガノイドペレットを1ミリリットルの氷冷高度DMEM F12に再懸濁する。先天性リンパ球細胞複製試料につき1本のPBS2で1本の1.5ミリリットルチューブをプレコートし、次いでプレコートPBS2チップを用いて、約100〜200個のオルガノイドをチューブ内に分配する。PBS2コーティングP-1000チップを使用して、オルガノイドを含むPBS2コーティング1.5ミリリットルチューブに、選別ステップから計算された500以上のILC1sの容量を加える。ILC1とオルガノイドを300Gで摂氏4度で5分間スピンダウンし、チューブの先端にペレットを作成するのではなく、チューブ内部の端に沿って細胞を引っ張るので、小径の卓上遠心分離機を避けるようにしてください。その後、ペレットを乱すことなくゆっくりと穏やかに上清を取り除き、サンプルを氷の上に置きます。チューブを冷たい表面に保持しながら、オルガノイドおよびILCを30マイクロリットルの熱架橋基礎細胞外マトリックス中に少なくとも10〜15回再懸濁して、均一な分布を確保する。熱架橋基底細胞外マトリックス中のILCオルガノイドを1ウェルあたり30マイクロリットルを予め加温した24ウェルまたは48ウェルプレートに塗布し、単一のドームを形成する。その後、プレートをインキュベーターに直接入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%で10〜20分間置きます。次いで、1ウェルあたり550マイクロリットルの完全ILC1培地を任意の所望の実験サイトカイン

co-culture-murine-small-intestine-epithelial-organoids-with-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオプロトコルでは、一次腸上皮のオルガノイドにおけるレンチウイルス形質導入と、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学によるこれらの培養物の処理と下流分析について、段階的に説明します。...

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

幹細胞由来の培養物は、感染症をモデル化する大きな可能性を秘めています。ここでは、成体幹細胞に由来するマウスおよびヒト胃オルガノイドの培養について説明する。オルガノイドには、胃病原体であるヘリコバクター・ピロリをマイクロインジェクションします。...

感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

ここでは、収穫維持、および病原体関連分子パターン（のPAMPs）とリステリア菌でマウス小腸オルガノイドを治療するためのプロトコルが記載されているだけでなく、遺伝子発現やタンパク質のための適切な正規化技術を重視。...

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

本プロトコルでは、腸内窩から直接マウスの一次上皮結腸単層を生成する方法を説明する。透過性フィルター上にコンフルエント単層を生成する実験的アプローチ、傷創傷治癒および生化学的研究のためのコンフルエント単層、免疫蛍光分析のためのまばらでコンフルエントな単層を提供する。...

腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

ここでは、腸管固有の相互作用のモデリングを可能にする2つのプロトコルを提示する。オルガノイド由来の腸単層および空気液体界面(ALI)培養は、光とバソララルの両方からアクセス可能な十分に分化された上皮の生成を促進する一方で、極性逆腸器官は彼らの極性側を露出させ、高スループットアッセイに適している。...

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

本プロトコルは、クローディン-7ノックアウトモデルにおける結腸幹細胞の活性および機能を研究するためのマウス結腸オルガノイド系の確立を記載する。...

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

マウス小腸陰窩を単離し、陰窩から腸3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルについて説明します。さらに、上皮下細胞ニッチの非存在下で単一の腸幹細胞からオルガノイドを生成する方法について述べる。...

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

本研究は、組織幹細胞由来の腸オルガノイドを用いた細菌感染の in vitro 調査方法を提示します。このプロトコルは、2次元でオルガノイドを培養・分化する方法、浸潤性大...

宿主と細菌の相互作用を研究するための侵入膜抽出物または基底膜抽出物を用いた二次元オルガノイド培養

私たちは、個々の細胞挙動を解析するためのモザイクオルガノイドと、ヒトおよびマウスの腸内オルガノイドにおける細胞型転移を監視するためのFATEレポーターオルガノイドという2つのレポーター戦略に適用された共焦点イメージングおよび追跡パイプラインについて説明します。...

ヒトおよびマウス腸オルガノイドにおけるクローンの動態と運命転移を監視するためのライブセルイメージングおよび単細胞追跡

本論文では、成長の異なる方法を説明します...

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

学ぶマウス小腸上皮オルガノイドとILC1の共培養法。腸管免疫細胞と上皮細胞の双方向相互作用を解析し、炎症性消化器疾患のメカニズム解明に貢献する実験系を確立します。

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

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