Name: 哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価法。HEK293T細胞溶解物を用いた免疫沈降とウェスタンブロットで、がんや神経疾患におけるタンパク質修飾メカニズムを解明します。

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注:哺乳動物細胞におけるユビキチル化アッセイプロトコルの概要を 図1に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> 図1. ユビキチル化アッセイ手順の概要。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
1. 細胞培養
<ol><li>100 mm TC 処理培養皿で HEK293T 細胞株を、増殖培地 (10% ウシ胎児血清 (FBS) およびペニシリン (100 単位)、ストレプトマイシン (100 μg) および L-グルタミン (0.292 mg/mL) を添加したダルベッコの改変イーグル培地 (DMEM) 高グルコース) 中で 80% ~ 90% のコンフルエントになるまで成長させます。5%CO2で加湿した細胞培養インキュベーター内で37°Cで培養物をインキュベートする。</li>
	<li>細胞を継代するには、血清学的ピペットを用いて培養皿から培地を吸引する。滅菌した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS 1x)1mLで細胞を1回洗浄する。</li>
	<li>1mLのトリプシン/EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液を加えて細胞を剥離する。ディッシュを37°Cで5分間インキュベートする。血清学的ピペットを用いて細胞を2mLの増殖培地に再懸濁する。</li>
	<li>細胞懸濁液を新鮮で清潔な15mLチューブに移し、500 x g で室温(RT)で5分間遠心分離する。上清を慎重に注いで取り除きます。細胞ペレットを3mLの成長培地に穏やかに再懸濁し、上下にピペッティングして均質な細胞懸濁液を得た。</li>
	<li>細胞懸濁液1 mLを、9 mLの増殖培地を含む100 mm TC処理培養皿に移す。 注:細胞が良好な状態にある場合、HEK293Tの各培養皿は、コンフルエントが80%〜90%であり、継代後2日目に80%コンフルエントを有する3つの培養皿を生成することができる。</li>
</ol>2. 細胞トランスフェクション
注:コンフルエントに達したものが80%未満の場合、細胞培養物をトランスフェクトすることは推奨されません。
<ol><li>トランスフェクションの前に、細胞に汚染がなく、一過性トランスフェクションの適切なコンフルエントにあるかどうかを認証します。</li>
	<li>トランスフェクションサンプルごとに、DNA-ポリエチレンイミン(pH 7.2でPEI 1 μg/μL)複合体を次のように調製します。<ol>
<li>各プラスミド3 μgを100 μLのopti-MEM I還元血清培地に無添加で希釈し、溶液を上下にピペッティングして穏やかに混合します。 注:ここでは、6xHis-myc-ユビキチンの有無にかかわらず、空のベクター(pcDNA3)またはFLAG-Fbxo7構築物およびUXT-V2-HAの各プラスミドを4 μgで細胞にトランスフェクトしました。全DNA含量は12μgであった。</li>
		<li>RTでPEIを解凍し、DNA1μgあたり3μLの割合のPEIに従って溶液に添加する。溶液を上下にピペッティングして均質化する。その後、RTで15分間インキュベートして、DNA-PEI複合体の形成を可能にします。 注:DNA量あたりのPEI体積の最適な割合は、選択した細胞株によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞培養物を入れた各ディッシュにDNA-PEI複合体の全量を加え、プレートを前後に揺らして穏やかに混ぜる。5%CO2で加湿した細胞培養インキュベーター内で37°Cで細胞をインキュベートする。</li>
	<li>5時間後に増殖培地を交換すると、長期間のPEI曝露がHEK293T細胞に有毒である可能性があるためである。5%CO2 の加湿細胞培養インキュベーター内で37°Cで細胞を36時間インキュベートする。</li>
</ol>3. 細胞溶解と免疫沈降
<ol><li>インキュベーション期間の後および細胞溶解の6時間前に、トランスフェクトされた細胞を10μMのプロテアソーム阻害剤MG−132で処理する。もう一度、5%CO2で加湿した細胞培養インキュベーター内で細胞を37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>血清学的ピペットを使用して各培養皿から培地を吸引し、1mLの1x PBSで1回洗浄する。1mLのトリプシンを加えて細胞を剥離し、ディッシュを37°Cで5分間インキュベートした。細胞を1mLの増殖培地に再懸濁する。</li>
	<li>細胞懸濁液を新鮮で清潔な15mLチューブに移し、RTで5分間500 x g で遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に注いで取り除きます。細胞ペレットを200 μLの氷冷NP-40溶解バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.2、225 mM KCl、および1% NP-40)に穏やかに再懸濁し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(10 mM NaFおよび1 mMNa3VO4)を添加し、溶液を清潔な1.5 mLマイクロチューブに移します。</li>
	<li>細胞溶解物を氷上で30分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞溶解物を16,900 x g で4°Cで20分間遠心分離する。</li>
	<li>一方、アガロース抗HAビーズを氷冷NP-40溶解バッファーで平衡化する。各サンプルに15 μLのアガロース-抗HAビーズを使用してください。ビーズを200 μLのNP-40溶解バッファーで洗浄し、3,000 x g の微量遠心管で4°Cで1分間パルスします。 ピペットで、上清を非常に慎重に吸引して捨てます。このプロセスを 3 回繰り返します。その後、ビーズを氷上で平衡化してから使用してください。</li>
	<li>細胞溶解物を遠心分離した後、上清を回収する。ブラッドフォード法16を用いて全溶解物中のタンパク質含量を定量する。</li>
	<li>免疫沈降に供する各サンプルが等量のタンパク質を示すことを確認します。UXT-V2-HAがアガロース抗HAビーズに結合することを可能にする4°Cの回転インキュベーター内で穏やかに回転させながら、平衡化されたアガロース - 抗HAビーズと細胞溶解物の必要量を4時間インキュベートする。</li>
	<li>アガロース-抗HAビーズを3,000 x g の微量遠心管で4°Cで1分間パルスして回収します。 慎重に吸引し、上清を捨てる。ビーズを氷冷NP-40細胞溶解バッファーで3回、氷冷FLAG/HAバッファー(10 mM Hepes pH 7.9、15 mM MgCl2、225 mM KCl、および0.1% NP-40)で2回洗浄します。</li>
	<li>最終洗浄後、ピペットを使用してすべての上清を慎重に除去し、FLAG/HAバッファーで希釈したHAペプチド(300μg/mL)でポリユビキチル化タンパク質を溶出します。アガロース抗HAビーズをHAペプチドと共にロッキングシェーカープラットフォーム中で4°Cで1時間インキュベートする。</li>
	<li>ビーズを3,000 x g で4°Cで2分間スピンダウンし、ポリユビキチン化タンパク質を含む上清を慎重にピペットでピペットで送ります。必要に応じて、溶出液を-20°Cの新鮮で清潔なマイクロチューブに保存します。</li>
	<li>溶出液および細胞溶解物を10%SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)17 で解決し、イムノブロッティングした。</li>
	<li>本研究では、湿式移送WBを実施した。この種の転写のために、濾紙 - ゲル - 膜 - 濾紙からなる転写サンドイッチにゲルを置き、パッドでクッションし、支持グリッドで一緒に押す。このシステムは、移送バッファで満たされたタンク内およびステンレス鋼/白金線電極の間に垂直に配置します。転写は、湿式移送バッファー(グリシン192 mM、トリス塩基25 mM、0.025% SDS、20%メタノール)中で150 Vで90分間行われます。 注:細胞抽出物を定量したので(ステップ3.7)、各サンプルに対して同じ量のタンパク質でSDS-PAGEを実行します。また、溶出液を沈殿させるために、各試料を等量に実行した。</li>
	<li>選択された抗体 11を用いてイムノブロット膜をプローブする。野生型E3リガーゼ、基質、およびmyc-ubを含むサンプル中の抗myc抗体を使用して、IPプロセスで引き出されたポリユビキチル化基質からの溶出液にスミアシグナルが検出されることを確認します。細胞溶解物(インプット)において、選択された基質、Fbxo7タンパク質、ユビキチル化タンパク質、およびハウスキーピングタンパク質(例えば、GAPDHおよびβ-actin)からのシグナルが検出され、各レーンにおいて同じ量のタンパク質を保証することを確認する。 注:使用した各抗体の希釈液は、製造元の指示に従って調製した。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、利益相反は存在しないと宣言しています。

ユビキチル化は、いくつかのタンパク質のレベルを調節し、多くのシグナル伝達経路および生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たし、健康な細胞内環境を保証する重要な翻訳後修飾である。ユビキチン-プロテアソーム系(UPS)は、最近の製薬研究の主な焦点の1つであり、腫瘍抑制因子を安定化させる可能性、または発癌性産物22の分解を誘導する可能性を提供する。例えば、多発性骨髄腫(MM)におけるモノクローナル免疫グロブリン分泌に関与する形質細胞新生物の異常な増殖は、小胞体(ER)におけるミスフォールドおよび/または折り畳まれていないタンパク質蓄積に起因する病態生理学的経路を促進する23。このERストレスが起こると、ユビキチン - プロテアソーム系の活性化を含むいくつかのプロセスを活性化する。多発性骨髄腫治療のためのタンパク質蓄積および結果としての細胞死を誘導するためのプロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、およびイキサゾミブ)の使用は、高リスク患者における疾患進行を減少させることによって抗腫瘍薬として有望な結果を示した<sup class="xr...

翻訳後修飾(PTM)は、細胞の恒常性に不可欠なタンパク質調節に関する重要なメカニズムです。タンパク質ユビキチル化は、真核生物においていくつかの細胞転帰をもたらす異なるシグナルの集合体を作り出す動的で複雑な修飾である。ユビキチル化は、76個のアミノ酸を含むユビキチンタンパク質の基質への結合からなる可逆的なプロセスであり、3つの異なる反応1によって構成される酵素カスケードで起こる。第1のステップは、ユビキチンC末端とE1酵素の活性部位に存在するシステイン残基との間に高エネルギーチオエステル結合ユビキチンを形成するATP加水分解に依存するユビキチン活性化によって特徴付けられる。続いて、ユビキチンはE2酵素に転移し、ユビキチンとのチオエステル様複合体を形成する。その後、ユビキチンは、E2によって、またはより頻繁には、基質2,3を認識して相互作用するE3酵素によって基質に共有結合される。時折、E4酵素(ユビキチン鎖伸長因子)がマルチユビキチン鎖集合を促進するために必要である3。
ユビキチンは7つのリジン残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、およびK63)を有し、いくつかのエフェクタータンパク質によって認識されるであろう異なる三次元構造を生成するために別個の結合を生成するポリユビキチン鎖の形成を可能にする4,5。したがって、基質に導入されるポリユビキチン鎖の種類は、その細胞運命を決定するために不可欠である6、7、8。さらに、基板は、N-デグロンと呼ばれるN末端残基を介してユビキチン化することもできる。特定のE3ユビキチンリガーゼはN-degron認識に関与し、近くのリジン残基9のポリユビキチル化を可能にする。
今日では、40種類以上のSCF特異的基質が特徴付けられています。その中で、細胞の分化および発生ならびに細胞の生存および死を含むいくつかの生物学的経路の主要な調節因子が見出され得る10、11、12、13。したがって、各E3ユビキチンリガーゼの特異的基質の同定は、様々な生物学的事象の包括的なマップを設計するために不可欠である。真の基質の同定は生化学的に困難ですが、生化学ベースの方法の使用は、鎖特異性およびモノユビキチル化とポリユビキチル化の区別を評価するのに非常に適しています14。この研究は、基質UXT-V2(ユビキタス発現プレフォールディン様シャペロンアイソフォーム2)を過剰発現する哺乳動物細胞株HEK293TとE3ユビキチンリガーゼ複合体SCF(Fbxo7)を用いたユビキチル化アッセイのための完全なプロトコールを記載する。UXT-V2はNF-κBシグナル伝達に不可欠な補助因子であり、このタンパク質が細胞内でノックダウンされると、TNF-α誘導NF-κB活性化を阻害する11。したがって、ポリユビキチル化UXT-V2を検出するために、プロテアソーム複合体15の26Sサブユニットのタンパク質分解活性を遮断する能力を有することから、プロテアソーム阻害剤MG132が使用される。さらに、細胞抽出液を小規模IPに提出して基質を精製し、アガロース樹脂に固定化された特異的抗体を利用して、選択した抗体を用いたWBによるその後の検出を行う。このプロトコルは、細胞環境における基質ユビキチル化を検証するのに非常に有用であり、異なるタイプの哺乳動物細胞および他のE3ユビキチンリガーゼ複合体にも適合させることができる。しかし、両方のプロトコールが真の基質の同定に関して互いに補完し合うため、in vitroユビキチル化アッセイを通じて試験された基質を検証することも必要です。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLマイクロチューブ</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC処理培養皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mLチューブ</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-anti-HA beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anti Mouse antibody</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>ヤギ抗マウスIgG</td></tr><tr><td>抗ウサギ抗体</td><td>セラケア</td><td>5220-0337</td><td>ヤギ抗ウサギIgG</td></tr><tr><td>抗アクチン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>使用希釈率:1:2000</td></tr><tr><td>抗Fbxo7抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>使用希釈率:1:1000</td></tr><tr><td>抗HA抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>使用希釈率:1:1000</td></tr><tr><td>抗Myc抗体</td><td>細胞シグナル</td><td>2272</td><td>希釈:1:1000</td></tr><tr><td>ブラッドフォード試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>ウシ血清アルブミン</td></tr><tr><td>細胞インキュベーター</td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g 5分間</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタル pH メーター</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'のモディファイドイーグル」s ミディアム</td><td>コーニング</td><td>10-017-CRV</td><td>高グルコース</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td>F4135</td><td>濾液 前使用</td></tr><tr><td>HA ペプチド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>ヘプ</td><td>ス ギブコ</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>クライン回転子</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースブロッティングメンブレン</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>OPTIKA顕微鏡</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>哺乳類発現用</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp;マルセロ・ダム博士から寄付されました。</td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag(N端子)。制限酵素:EcoRIおよびXhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta;Fボックス</td><td>&nbsp;マルセロ・ダム博士から寄付されました。</td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag(N端子)。制限酵素:EcoRIおよびXhoI。&デルタ;335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA&</td><td>nbsp;マルセロ・ダム博士から寄付されました。</td><td></td> rioタグ<td>HA(C端子)。制限酵素:EcoRIおよびXhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-ユビキチン</td><td>&nbsp;マルセロ・ダム博士から寄付されました。</td><td></td> rio <td>Tag 6x-His-Myc(N端子)。制限酵素: EcoRI and KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>1x PBS を得るには、10x PBS を超純水に希釈します</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン (PEI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテルSIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングシェーカー</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE システム</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>溶液ホモジナイザー</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>ウェスタンブロッティングルミノール試薬</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳動物細胞溶解物におけるe3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

ユビキチル化は、真核細胞で起こる翻訳後修飾であり、細胞の生存、増殖、分化を含むいくつかの生物学的経路の調節に重要である。これは、E1(ユビキチン活性化酵素)、E2(ユビキチン結合酵素)、およびE3(ユビキチンリガーゼ酵素)からなる少なくとも3つの異なる酵素のカスケード反応を介して基質にユビキチンが共有結合することからなる可逆的プロセスである。E3複合体は、基質認識およびユビキチル化において重要な役割を果たしている。ここでは、選択された基質をコードするプラスミド、E3ユビキチンリガーゼ、およびタグ付きユビキチンの一過性同時トランスフェクションを使用して、哺乳動物細胞における基質ユビキチル化を評価するプロトコルが記載されている。溶解前に、トランスフェクトされた細胞をプロテアソーム阻害剤MG132(カルボベンゾキシ - ロイ - ロイ - ロイシナル)で処理して、基質プロテアソーム分解を回避する。さらに、細胞抽出物を小規模免疫沈降(IP)に提出し、ユビキチンタグに特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティング(WB)によるその後の検出のためにポリユビキチル化基質を精製する。したがって、哺乳類細胞におけるユビキチル化アッセイのための一貫性のある複雑でないプロトコルは、特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化に対処する際に科学者を支援するために記載されている。

UXT(ユビキタスに発現された転写産物)は、心臓、脳、骨格筋、胎盤、膵臓、腎臓、肝臓などのマウスおよびヒトの組織において遍在的に発現されたタンパク質折り畳み複合体を形成するプレフォールディン様タンパク質である18。UXT-V1およびUXT-V2と名付けられたUXTの2つのスプライシングアイソフォームが、別個の機能および細胞内位置を果たすことが記載されている。UXT-V1は主に細胞質およびミトコンドリア内部に局在しており、TNF-α誘導性アポトーシスおよび抗ウイルス性シグナル伝達体形成に関与している19,20。ほとんどの研究は、主に核に局在し、細胞増殖調節、分化、および炎症経路に関与する複数の転写因子の補因子として作用するUXT-V2に焦点を当てている。UXT-V2は、NF-κBエンハンセトソーム21において必須のコアクチベーターとして働くNF-κBシグナル伝達経路に関与している。UXT-V2はE3ユビキチンリガーゼSCF(Fb...

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

このプロトコルは、E3リガーゼによる特定の基質のユビキチル化を評価することを可能にする。我々は、リガーゼ-基質相互作用の特性評価が、細胞におけるそれらの機能を理解するために重要であることを知っています。この技術は、高価な試薬や洗練された機器を必要としません。プラスミドと目的の遺伝子のコーディング、細胞溶解物による免疫沈降アッセイの開発、および基質ユビキチル化を検出するためのウェスタンブロットが必要です。癌や神経学的障害のようないくつかのヒト疾患は、E3リガーゼの調節不全と関連している。したがって、特定のE3リガーゼによる基質ユビキチル化の同定は、これらの疾患の治療または診断に役立つ可能性がある。手順のデモンストレーションは、バレンタイン・スパニョールによるものです。開始するには、10%ウシ胎児血清および100単位ペニシリン、100マイクログラムのストレプトマイシン、および1ミリリットルあたり0.292ミリグラムのL-グルタミンを添加したダルベッコの改変イーグルス培地中で、HEK293T細胞株を80〜90%コンフルエントに成長させる。次いで、この培養物を5%二酸化炭素で加湿した細胞培養インキュベーター内で摂氏37度でインキュベートする。血清学的ピペットを用いて培養皿から培地を吸引して細胞を継代し、滅菌した1X PBSの1ミリリットルで1回洗浄する。次に、1ミリリットルのトリプシンエチレンジアミン四酢酸溶液を加えて細胞を剥離し、摂氏37度で5分間インキュベートした後、血清学的ピペットを用いてこれらの細胞を2ミリリットルの成長培地に再懸濁する。細胞懸濁液を新鮮で清潔な15ミリリットルチューブに移し、室温で5分間500倍Gで遠心分離する。次いで、上清を穏やかに除去し、細胞ペレットを上下にピペッティングすることによって3ミリリットルの成長培地に再懸濁し、均質な細胞懸濁液を得た。次いで、この細胞懸濁液1ミリリットルを、9ミリリットルの増殖培地を含む100ミリメートルTC処理培養皿に移す。トランスフェクションの前に、細胞に汚染がなく、一過性トランスフェクションの適切なコンフルエントにあるかどうかを認証します。各トランスフェクションサンプルについて、各プラスミドの3マイクログラムを100マイクロリットルのOpti-MEM 1還元血清培地に補充せずに希釈し、溶液を上下にピペッティングして穏やかに混合することにより、DNA-ポリエチレンイミン複合体を調製する。次に、DNA-ポリエチレンイミンを室温で解凍し、DNA1マイクログラムあたり3マイクロリットルのDNA-ポリエチレンイミンの割合で溶液に添加する。溶液を上下にピペッティングして均質化する。次いで、それを室温で15分間インキュベートして、DNA-ポリエチレンイミン複合体の形成を可能にする。DNA−ポリエチレンイミン複合体の全

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JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

このビデオでは、シーケンシャル酵素カスケードを用いた基質タンパク質のSUMO化のin...

SUMO化アッセイ:イムノブロッティングにより基質タンパク質のSUM化状態を検出するIn vitro技術

ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3...

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。...

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

この原稿の目的は、RING型E3ユビキチンリガーゼの包括的な生化学的および機能的研究の概要を提示することです。このマルチステップパイプラインは、詳細なプロトコルを用いて、試験されたタンパク質の酵素活性を検証し、活性を機能にリンクする方法を示す。...

インビトロとプランタにおけるRING型E3ユビキチンリガーゼの機能特性評価

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

本研究は、E3ユビキチンリガーゼ触媒活性の分析のための詳細な インビトロ ユビキトリメンテーションアッセイプロトコルを提供する。組換えタンパク質は 、大腸菌...

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

本プロトコルは、哺乳類細胞溶解液または純粋なユビキチン酵素複合体を用いて肺炎 連鎖...

体外受精 細菌のユビキチン化の再構築とVCP/p97媒介の除去

学ぶE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価法。HEK293T細胞溶解物を用いた免疫沈降とウェスタンブロットで、がんや神経疾患におけるタンパク質修飾メカニズムを解明します。

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

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