Name: 副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学ぶ、共焦点顕微鏡とパッチクランプを組み合わせて牛副腎クロマフィン細胞の融合細孔ダイナミクスを可視化し、キスアンドラン・ステイフュージョン・シュリンクフュージョンの3モードを区別する方法。この技術は神経伝達物質放出機構の理解に貢献します。

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我々は、この作業を支援してくれたNINDS壁内研究プログラム(ZIA NS003009-13およびZIA NS003105-08)に感謝する。

<ol><li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+and+endocytosis%3A+modes%2C+functions%2C+and+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li>
<li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li>
<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li>
<li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li>
<li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li>
<li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356(2014).</li>
<li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%2C+60+years+after+the+first+cartoon%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Letters%22%5BJournal%5D)">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li>
<li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li>
<li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503(2021).</li>
<li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow%2C+release-unproductive+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li>
<li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li>
<li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604(2016).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li>
<li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li>
<li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).</li>
<li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromaffin+cells%3A+the+peripheral+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li>
<li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+%28SSV%29+and+large+dense-core+vesicle+%28LDCV%29+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li>
<li>Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThahouly%2C+T+%22Exocytosis+and+Endocytosis.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology</a>. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li>
<li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li>
<li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li>
<li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAAX-box+protein%2C+prenylation+process+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).</li>
<li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

共焦点顕微鏡画像化法は、ウシ副腎クロマフィン細胞4,24における融合孔および伝達物質放出のダイナミクス、ならびに3つの融合モード、近接融合、ステイ融合、および収縮融合を検出するために記載されている4,24。細胞を脱分極させ、それによってエキソ細胞症およびエンドサイトーシスを呼び起こす電気生理学的方法が記載されている。体系的な共焦点画像処理は、核融合および核分裂事象の細孔挙動の異なるモードに関する情報を提供する。
全細胞構成と同じセルにおけるカルシウム電流および静電容量変化の同時モニタリングは、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスに関する追加情報を提供し、任意の時点での全セルレベルでの細孔開閉の比率を示唆する。これらの方法は、原則として、初代培養物中または〜200〜1,600nm15の小胞を含む細胞株中の他の興奮性細胞および非電気的に興奮性細胞に適用可能である。クロマフィン細胞に加えて、ここで記載した方法は、ラット...

膜融合は、シナプス伝達、血糖恒常性、免疫応答、およびウイルス侵入を含む多くの生物学的機能を媒介する1,2,3。原形質膜での小胞融合を伴うエキソサイトーシスは、神経伝達物質およびホルモンを放出し、ニューロンネットワーク活動などの多くの重要な機能を達成する。融合は、小胞内容物を放出するために細孔を開き、その後、細孔が融合小胞を取り出すために閉じ得る、これはキスアンドラン1,4と呼ばれる。不可逆的および可逆的な融合孔開口の両方は、単一小胞融合の融合細孔コンダクタンス記録と組み合わせた細胞付着容量記録で測定することができる。
これはしばしば、融合小胞の平坦化までの融合の拡張を伴う完全崩壊融合、および融合孔の開閉を伴うキスアンドランを反映していると解釈され、それぞれ5、6、7、8、9、10、11、12、13.クロマフィン細胞における最近の共焦点および誘導放出枯渇(STED)イメージング研究は、融合孔の開閉(キスアンドラン、クローズフュージョンとも呼ばれる)、ステーフュージョンと呼ばれる、長期間にわたって開いた細孔でΩ形状を維持する融合ポア開口部、および原形質膜と完全に融合するまでの融合小胞の収縮、原形質膜と融合小胞を融合させるための完全崩壊融合を置き換える4、 8,14,15,16,17。
ニューロンにおいて、融合細孔の開閉は、融合孔よりも大きい小胞に予め装填された量子ドットの放出を示す画像化および神経終末の放出面における融合細孔コンダクタンス測定5、18、19によって検出されている。副腎クロマフィン細胞は、外細胞症およびエンドサイトーシスの研究のためのモデルとして広く使用されている20,21。クロマフィン細胞は大きな緻密なコア小胞を含むが、シナプスは小さなシナプス小胞を含むが、クロマフィン細胞およびシナプスにおけるエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスタンパク質は、10、11、12、20、21、22、23と非常に類似している。
ここでは、ウシ副腎クロマフィン細胞における電気生理学と組み合わせた共焦点イメージング法を用いてこれら3つの融合モードを測定する方法について説明する(図1)。この方法は、エキソサイトーシスを検出するために小胞に蛍光偽神経伝達物質(FFN511)をロードすることを含む。Atto 655(A655)を浴液に添加して融合生成したΩ形プロファイルを充填し、原形質膜8、15、24でPtdIns(4,5)P2に結合するホスホリパーゼC δ(PH)のPHドメインで原形質膜を標識する。融合細孔ダイナミクスは、異なる蛍光強度の変化によって検出することができる。クロマフィン細胞について記載されているが、ここで説明するこの方法の原理は、クロマフィン細胞をはるかに超えた多くの分泌細胞に広く適用することができる。

<table><tbody><tr><td>アデノシン5'-三リン酸マグネシウム塩</td><td>Sigma</td><td>A9187-500MG</td><td>内部溶液調製用ATP</td></tr><tr><td>Atto 655</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 655-21</td><td>Atto 染料 ラベルバス溶液</td></tr><tr><td>一次ニューロン用塩基性ヌクレオフェクター</td><td>ロンザ</td><td>VSPI-1003</td><td>エレクトロポレーション トランスフェクション緩衝液 キット</td></tr><tr><td>ボロシリケート キャピラリーガラスピペット</td><td>ワーナー器具</td><td>64-0795</td><td>フィラメント付き標準壁 OD=2.0 mm ID=1.16 mm 長さ=7.5 cm</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A2153-50G</td><td>腺消化用試薬</td></tr><tr><td>塩化カルシウム 2 M</td><td>品質 生物学的</td><td>351-130-721</td><td>入浴剤調製用試薬</td></tr><tr><td>セルストレーナー、100 & マイクロ;m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>クロマフィン細胞懸濁液濾過材料</td></tr><tr><td>水酸化セシウム溶液</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td>内部溶液およびCs-グルタミン酸/Cs-EGTAストックバッファーを調製するための試薬</td></tr><tr><td>コラゲナーゼP</td><td>Sigma</td><td>11213873001</td><td>腺消化酵素</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Lamininコーティングされたドイツのカバースリップ</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G8270-1KG</td><td>ロックを準備するための試薬溶液と浴液</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>培</td><td>地調製用11885092試薬</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>324626-25GM</td><td>入浴液用Cs-EGTAストックバッファー調製試薬</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクター</td><td>アマクサバイオシステム</td><td>ヌクレオフェクターII</td><td>細胞内プラスミド</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10082147</td><td>培地調製用試薬</td></tr><tr><td>FFN511</td><td>Abcam</td><td>ab120331</td><td>小胞を標識するための蛍光偽神経伝達物質</td></tr><tr><td>グアノシン 5'-三リン酸ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td>GTP 内部溶液調製用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td>Locke' を調製するための試薬</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>パッチクランプ解析およびイメージングデータ表示用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X ソフトウェア</td><td>Leica</td><td>LAS X ソフトウェア</td><td>イメージングデータ収集および解析用共焦点ソフトウェア</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5</td><td>イメージングデータ収集</td></tr><tr><td>用共焦点顕微鏡L-グルタミン酸</td><td>シグマ</td><td>49449-100G</td><td>入浴液用Cs-グルタミン酸ストックバッファーを調製するための試薬</td></tr><tr><td>ロックインアンプ</td><td>Heka</td><td>ロックイン</td><td>静電容量記録用ソフトウェア</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム 1 M</td><td>品質 生物学的</td><td>351-033-721EA</td><td>内液および入浴液を調製するための試薬</td></tr><tr><td>メタライズド血球計算計 ハウザー ブライトライン</td><td>ハウサーサイエンティフィック</td><td>3120</td>カ<td>ウンティング</td></tr><tr><td>チャンバーMicroforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td>ギ<td>ガオームシールの形成と安定性を高めるポーランドのピペット</td></tr><tr><td>Millex-GPシリンジフィルターユニット、0.22 & マイクロ;m</td><td>ミリポア</td><td>SLGPR33RB</td><td>腺洗浄・消化用材料</td></tr><tr><td>mNG(mNeonGreen)</td><td>対立遺伝子 バイオテクノロジー</td><td>ABP-FP-MNEONSB</td><td>PH-M用テンプレートNeonGreen構造</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュフィルタースクリーン 100ミクロン</td><td>EIKOフィルタリング co</td><td>03-100/32</td><td>髄質懸濁液をろ過するための材料</td></tr><tr><td>パッチクランプ EPC-10</td><td>Heka</td><td>EPC-10</td><td>パッチクランプデータ用アンプコレクション</td></tr><tr><td>PH-EGFP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #51407</td><td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>パッチクランプ記録用ピペットを作る</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma</td><td>P5404-500G</td><td>ロック調製用試薬溶液と浴液</td></tr><tr><td>パルスソフトウェア</td><td>パッチクランプデータ収集用</td><td>Heka</td><td>パルス</td>ソフトウェア</tr><tr><td>録音室</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-1943/QR-40LP</td><td>カバースリップチャンバー、生細胞にパッチクランプピペットを塗布</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S7653-1KG</td><td>ロックを調製するための試薬溶液、浴液、内部溶液水</td></tr><tr><td>酸化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S5881-500G</td><td>ロックを調製するための試薬sの解決</td></tr><tr><td>ナトリウムのリン酸二塩基性</td><td>シグマ</td><td>S0876-500G</td><td>の錠前を準備するための試薬sの解決</td></tr>ナトリウム<tr><td>の隣酸塩のmonobasic</td><td>シグマ</td><td>S8282-500G</td><td>の錠を準備するための試薬s溶液</td></tr><tr><td>攪拌ホットプレート</td><td>バーンステッド/サーモリン</td><td>タイプ10100</td><td>ワックスによるピペットコーティング用ヒーター</td></tr><tr><td>シリンジ、30mL</td><td>ベクトン・ディキンソン302832</td><td></td><td>腺洗浄・消化用材料</td></tr><tr><td>塩化テトラエチルアンモニウム</td><td>シグマ</td><td>T2265-100G</td><td>入浴液調製用TEA</td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>シグマ</td><td>T9253-5G</td><td>腺消化用試薬</td></tr><tr><td>タイプF 液浸液</td><td>ライカ</td><td>195371-10-9</td><td>ライカ共焦点埋込油</td></tr></tbody></table>

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

動的融合細孔開閉は、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスを媒介し、それらの動態を決定する。ここでは、共焦点顕微鏡をパッチクランプ記録と組み合わせて使用して、初代培養ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出する方法を詳細に実証する。3つの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う密閉核(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口と開いた細孔の維持を含むステイ融合、3)核融合によって生成されたΩ形プロファイルの収縮を伴う蠕動融着が含まれる原形膜で完全に融合する。
これらの融合モードを検出するために、原形質膜を標識し、原形質膜の細胞質ゾル対向小葉においてホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸(PtdIns(4,5)P2)に結合するホスホリパーゼC δ(PH-mNG)のPHドメインと結合するmNeonGreenを過剰発現させた。小胞に蛍光偽神経伝達物質FFN511をロードして、小胞内容物放出を検出した。Atto 655を融合孔閉鎖を検出するために浴液に含ませた。これら3つの蛍光プローブを生クロマフィン細胞で1フレームあたり約20〜90ミリ秒で同時に画像化し、融合孔開口、内容物放出、融合細孔閉鎖、および融合小胞サイズ変化を検出した。分析方法は、これらの蛍光測定から3つの融合モードを区別するために説明されています。ここで説明する方法は、原則として、クロマフィン細胞以外の多くの分泌細胞に適用することができる。

図1および図2に示される実験手順に従って、ウシ副腎由来のクロマフィン細胞をPH−mNGでトランスフェクトし、原形質膜を標識した。A655を浴液に添加して、融合孔閉鎖を検出した。蛍光偽神経伝達物質FFN511を放出の検出のために小胞に装填した。次に、FFN511、PH-mNG、およびA655のXY面共焦点タイムラプスイメージングを、細胞底部(細胞膜上方のZ焦点面〜100〜200nm)で20〜90msごとに行った。-80~+10mVの1秒脱分極の全細胞パッチクランプ記録および適用を、外細胞症およびエンドサイトーシスを呼び起こすために行った(図3A-C)。この脱分極は、内向きのカルシウム電流、エキソサイトーシスを示す容量ジャンプ、およびエンドサイトーシスを示すジャンプ後の容量減衰を誘導した(図3D、E)。<...

このプロトコルは、ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出するための共焦点イメージング技術を記述する。これらの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う近接融着(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口および開放された細孔の維持を伴うステイ融合、および3)融合小胞収縮を伴う収縮融合が含まれる。

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

膜融合は多くの生物学的機能を媒介する。このプロトコルは、核融合孔の開口ダイナミクスと送信機の放出ダイナミクスを検出し、3つの融合モード(クローズフュージョン、ステイフュージョン、シュリンクフュージョン)を区別する方法を説明しています。共焦点顕微鏡とパッチクランプ記録の組み合わせにより、融合孔の開閉の可視化と、その動力学の決定が容易になります。クロマフィン細胞について説明したが、ここで説明する方法の原理は、クロマフィン細胞をはるかに超えた多くの分泌細胞に広く適用することができる。この方法の正常な実施は、健康な初代クロマフィン細胞培養物の生成、十分なプラスミドトランスフェクション効率、および高い電気生理学的記録成功率など、いくつかの一般的なステップに依存する。表面に切り傷や出血のない3つの無傷の腺を選択し、はさみで脂肪組織を除去します。血液が出なくなるまでロックの溶液で灌流して腺を洗う。消化のために、腺が腫れ始めるまで、0.22マイクロメートルのフィルターを取り付けた30ミリメートルのシリンジを使用して、副腎静脈を通して酵素溶液を注入する。その後、腺を摂氏37度に10分間放置します。もう一度注射し、腺を摂氏37度でさらに10分間放置する。消化後、副腎静脈から反対側の端まで腺を縦方向に切断し、腺を広げる。白い髄質を、ロックの溶液を含む10センチメートルのペトリ皿に細かくつまんで分離します。はさみで髄質を切ってミンチにします。80〜100マイクロメートルのナイロンメッシュで髄質懸濁液をビーカーにろ過します。濾液を50ミリリットルの円錐管に移し、48 x gの室温で3分間、3回の減速で遠心分離する。遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより細胞ペレットをロック溶液で再懸濁する。細胞懸濁液を80〜100マイクロメートルのストレーナーで濾過し、48 x gの室温で3分間減速3分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを30ミリリットルの培養液で再懸濁した。血球計数計数器計数チャンバーを用いて細胞数を決定する。2, 800, 000セルを15ミリリットルのチューブに移す。3回の減速で2分間、48 x gで遠心分離することによって細胞をペレット化する。製造業者から提供された100マイクロリットルの切除バッファーを細胞ペレットに加える。次いで、2マイクログラムのPH-mNGプラスミドを加える。溶液を上下に配管して懸濁液を穏やかに混合し、混合物を遅滞なくエレクトロポレーションキュベットに移す。すぐにキュベットをエレクトロポレーターに移し、画面リストで005プログラムを選択し、Enterキーを押してエレクトロポレーションを実行します。エレクトロポレーション後、直ちに1.8ミリリットルの培地をキュベットに加え、滅菌チップを備えたマイクロピペットで穏やかに混合する。エレクトロポレーションされたセルの懸濁液300マイクロリットルを各ディッシュのカバースリップ上に加え、合計5〜6個のディッシュを1回のエレクトロポレーション反応のためにメッキする。皿を摂氏37度の加湿インキュベーターに9%の二酸化炭素で30分間慎重に移し、30分後に2ミリリットルの予温培地を各皿に静かに加える。ホウケイ酸ガラス毛細血管からパッチピペットをピペットプーラーで引っ張り、先端を液体ワックスでコーティングし、マイクロフォージで研磨して準備します。パッチクランプ記録アンプの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。ソフトウェアの適切なカルシウム電流と静電容量の記録パラメータを設定します。刺激が10秒から始まる合計で60秒の持続時間の記録プロトコルを設定します。電圧クランプ記録の保持電位を80ミリボルトに設定します。カルシウム流入と静電容量ジャンプを誘導する刺激として、マイナス80ミリボルトから10ミリボルトまでの1秒間の分極解除を設定します。共焦点顕微鏡システムの電源を入れ、ソフトウェアで適切なパラメータを設定します。458ナノメートル、514ナノメートル、633ナノメートルなどのレーザーをオンにし、各蛍光プローブに応じて各レーザーの発光収集範囲を設定します。良好な細胞状態および適切な発現を有するディッシュを選択し、2マイクロリットルの蛍光偽神経伝達物質FFN511をディッシュ内の培地に加える。皿をインキュベーターに20分間戻します。FFN511を装填した後、記録チャンバーを準備し、50マイクロリットルの浴液に2マイクロリットルの蛍光色素A655を加える。カバースリップを皿からピンセットで記録室に移し、すぐにA655入り浴液を加えます。100Xオイル浸漬対物レンズにオイルを1滴置きます。チャンバーを顕微鏡に取り付け、調整ノブを使用してオイルがカバースリップの底にちょうど接触するようにします。細胞に焦点を合わせ、明視野および共焦点イメージングを使用して、mNG発現を有する適切な細胞を見つける。選択したセルを拡大し、視野の中央に配置して、空白領域を最小限に抑えます。FFN511、PH-mNG、およびA665の固定Z平面でXY平面共焦点イメージングのパラメータを最小の時間間隔で設定します。微調整ノブでセルの下部にフォーカスを調整します。ソフトウェアで励起レーザー出力を調整して、最適な信号対雑音比を取得し、著しい蛍光漂白を回避するための設定を見つけます。9マイクロリットルの内部溶液をパッチピペットに加え、ピペットをパッチクランプアンプステージのホルダーに取り付けます。シリンジで少量の陽圧をかけ、ピペットチップを動かしてマイクロマニピュレーターで浴液に触れます。電圧パルステストで、ピペット抵抗が約2~4メガオームであることをアンプが示していることを確認します。LJ/Autoを押して液体接合部をキャンセルします。マイクロマニピュレーターでピペットを選択したセルに向かって移動させます。セル装着モードを形成するには、ピペットチップを動かしてセルに触れます。シリンジで穏やかな負圧をかけながら、保持電位をゼロからマイナス80ミリボルトに変更します。抵抗が1ギガオームを超えたら、構成が安定するまで約30秒間待ちます。C-fast/Autoを押して、高速容量を補償します。卸売モードを形成するには、膜が破裂するまでシリンジで負圧の短いながらも強力なパルスを適用します。C-slow/Autoを押して、遅い容量を補償します。イメージングの焦点を少し調整して、セルの底に焦点を合わせます。共焦点タイムラプスイメージングとパッチクランプ記録を同時に開始するには、2つの異なるソフトウェアアプリケーションで[スタート]ボタンをクリックします。記録後、データが保存されていることを確認します。保持電位をゼロミリボルトに戻します。ピペットをバス溶液から取り出して廃棄します。製造元または付属のソフトウェアで生のイメージングファイルを開きます。プロセスに移動し、ProcessToolsをクリックし、ツールを使用して各タイムラプス画像のローリング平均ファイルを生成します。これらのファイルを保存します。定量化で、[ツール]に移動し、[スタックプロファイル]ボタンをクリックして、刺激の前後の時間ポイントを確認し、各チャンネルの蛍光変化を特定します。[楕円を描画] ボタンをクリックして、フュージョン イベントの対象領域を丸で囲みます。画像を右クリックし、[ROIを保存]をクリックして保存します。「プロジェクトを開く」をクリックして、生ファイルを見つけます。画像を右クリックし、[ROIのロード]をクリックしてROIファイルを生のイメージングファイルにロードし、蛍光強度を測定します。[ツール]に移動し、ソフトウェアの[ROIのソート]をクリックし、各ROIの3つのチャネルすべてのトレースをプロットします。[レポート] をクリックして、デジタル データや各 ROI のイメージング トレースなどの ROI データをファイル フォルダーに保存します。全細胞パッチクランプ記録および80〜10ミリボルトの1秒間の脱分極の適用を行い、エキソおよびエンドサイトーシスを呼び起こした。印加された脱分極は、内向きのカルシウム電流を誘導し、静電容量ジャンプはエキソサイトーシスを示し、ジャンプ後の静電容量減衰はエンドサイトーシスを示す。細胞底部でのタイムラプスイメージングでは、1秒間の脱分極プロトコルによって誘導された融合事象は、FFN511放出を反映したFFN減少として示され、FPHおよびA655スポット蛍光増加を伴い、原形質膜および浴液から融合小胞へのPH-mNGおよびA655拡散を反映する。この図は、F655調光と同定された密接な融合を示し、FPHは遅延して持続または崩壊した。この図は、PH-mNGおよびA655スポットの両方の存在によって検出されたステイフュージョンを表す。この図は、PH-mNGスポットとA655スポットの平行なサイズ縮小を伴う平行FPHおよびF655崩壊として検出される収縮融着を表し、記録を成功させるには、パッチクランプでセル全体の構成を生成し、各チャネルに対して適切な蛍光強度でセル下部にイメージングする必要があります。ここで説明する電気生理学と超解像顕微鏡の組み合わせは、融合細孔ダイナミクスと神経回路を測定するための貴重なツールです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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