Name: 胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ 胚性ヒヨコ角膜の創傷法と瘢痕なし治癒メカニズム。上皮と間質への一貫した傷形成と断面解析により、組織再生の分子・細胞要因を解明し、角膜損傷治療の発展に貢献します。

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この研究は、イリノイ・ウェズリアン大学からTSへの芸術的および学術的開発助成金によって支援され、NIH-R01EY022158(PL)によって部分的に資金提供されました。

このプロトコルで使用された卵の株はホワイトレグホーンであり、すべての動物の手順はイリノイウェズリアン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1.ひよこの卵の孵化
<ol><li>卵を産卵後最大1週間〜10°Cに保ち、発育を停止します。ひよこの胚の発生を開始する準備ができたら、室温の水で飽和させた糸くずの出ないワイプ( 材料表を参照)で卵殻全体を拭き取り、汚れや破片を取り除きます。</li>
	<li>卵の殻が消毒されていることを確認してください。70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないワイプで卵の表面全体を拭き取ります。エタノールをすばやく拭き取って卵を乾燥させ、卵殻から胚へのエタノール吸収を避けます。</li>
	<li>卵をトレイの上に水平に配置します。卵の上部にマークを付けて、胚の予想される位置を示します。卵を水平にインキュベートし、ロッキング機能を有効にして、38°Cの加湿インキュベーター内で孵化させる。</li>
</ol>2.膜解剖の準備のために卵を窓にする
<ol><li>胚発生の3日目(E3)にインキュベーターから卵を取り出す。70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないワイプで卵の上部を殺菌します。卵殻表面からエタノールを乾燥させる。 注:ウィンドウ手順中に発育が遅れないようにするために、6〜12個の卵を除去し、残りの卵をインキュベーターに残したまま、これらの卵に対して手順を迅速に実施した。</li>
	<li>卵を安全な卵ホルダーに水平に置きます( 材料表を参照)。解剖ハサミの鋭い端を使用して、卵の尖った端の近くに卵殻の上部に小さな穴を開けます。 注:この穴は卵黄と胚を内側の卵殻表面から落とすために必要な卵白の除去を容易にします。卵所有者のために、卵が出荷される紙パルプ卵フィラーフラットが使用されました。</li>
	<li>穴を通して(ステップ2.2)、18Gの斜めの皮下注射針を挿入します。針を卵の底部内面に押し込み、針の斜め側を卵の尖った端に向け(例えば、卵黄と胚の予想される位置から卵の真ん中近くから離して)、鶏の卵から2〜3mLの卵白を取り除き、捨てる。 注:このステップ中に針が胚またはそれに関連する血管系に刻まれると、卵白で血液が吸引されます。これは胚の死をもたらすでしょう。さらに、このステップ中に卵黄が卵白と一緒に誤って吸引された場合、胚は生存不能になる。いずれの場合も、胚を直ちに他の目的に使用できない場合は、卵子を捨てるべきです。</li>
	<li>70%エタノールで軽く湿らせた糸くずの出ないワイプで穴を囲む卵殻の表面をきれいにし、乾いた拭き取ります。卵白を除去するために作った穴を透明なテープで密封します。</li>
	<li>解剖ハサミの鋭い端で、マーキング部位の卵殻の上部に2番目の「窓」穴を開けます(ステップ1.3)。はさみが卵殻にあまりにも遠くまで伸びないようにして、胚または胚性血管系(しばしば卵の中に第2の穴の部位の真下に位置する)に接触して損傷するのを避けるようにする。</li>
	<li>湾曲した虹彩鉗子を使用して、「窓」の穴を直径約2〜3cmに広げ、殻の下の発達中の胚への「窓」として機能します。<ol>
<li>鉗子の一方の端を穴に挿入し、卵の殻と平行に、そして密接に並置するようにします。もう一方の鉗子の端を卵殻の外側に配置して、2つの鉗子の端を慎重につまんで、卵殻の小さな部分を壊して取り除くことができます。胚を直接覆う2〜3cmの窓が残るまで、卵殻の破片を壊して取り除き続けます。 注:ステップ2.6で作った穴の真下に胚が産まない卵。今後の膜解剖を完了するのが難しいため、使用しないでください。卵を水平に揺らしても、卵の約10%は胚の位置が悪いために使用できません。これらの胚は、他の目的に使用することができる。</li>
	</ol></li>
	<li>細菌汚染を制限するために、ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質(ペニシリン50U/mLおよびストレプトマイシン50μg/mL)を含むリンゲル溶液(NaCl8g、KCl0g、および蒸留H20 0 Lあたり0.23gのCaCl 2.2H 20)を窓の穴から(例えば卵の中に)加え、 材料表を参照)。</li>
	<li>窓の穴は透明な粘着テープでシールします。テープの角を穴の長軸に合わせ、穴の端から約1〜2cm離れたシェルにテープを押し付けて、卵のシールを行います。<ol>
<li>テープの垂れ下がったフラップが片側に残るまで、開口部の周りをシールし続けます。2枚のテープを一緒に押して穴の上にドーム型を作り、張り出したテープのフラップを殻に押し付けて卵を密封し終えます。 注:卵はE2またはE3のいずれかでウィンドウ化する必要があります。経験によると、E2の前にウィンドウイングすると、胚の生存率が低下します。さらに、E4によって、胚および胚外膜が卵殻10に付着し、E4以降で窓を張ろうとする試みは、しばしば胚損傷または胚外血管の引き裂きをもたらし、いずれかの事象が胚死の結果につながる。</li>
	</ol></li>
	<li>さらなる発達のために「窓付きの」卵をインキュベーターに戻します。卵を水平に保ち、インキュベーターのロッキング機能をオフにしてください。</li>
	<li>手順 2.2.-2.9 を繰り返します。各卵のために。</li>
</ol>3. 胚外膜のマイクロダイセクション
<ol><li>E5.5ウィンドウ付き卵をインキュベーターから取り出します。滅菌した解剖はさみで窓からテープを切断して胚を露出させます。</li>
	<li>解剖顕微鏡を使用して、窓から胚とその胚外膜を観察します。必要に応じて、はさみまたは湾曲した虹彩鉗子を使用して窓を広げ、胚が窓の下によく配置されるようにし、胚の血管系を傷つけないように注意する。<ol>
<li>ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンガーの溶液を2滴加えて、胚を水和させ、卵子を滅菌する。</li>
	</ol></li>
	<li>解剖顕微鏡を使用して、胚が適切な発生段階(ハンバーガーハミルトン段階27、〜E5.5)11,12にあることを確認し、羊膜(ACM)および脈絡膜(CAM)の位置を特定します。 注:この段階では、胚は、羊膜と融合した絨毛膜と、胚の腸領域から伸び、重ねられた絨毛膜と融合してCAM11,12を形成する高度に血管化されたアラントワによって部分的に覆われたACMに囲まれています。ACMは血管新生があまりないため、これらの膜を解剖して血管を損傷したり胚を傷つけたりすることなく胚を露出させることができます。</li>
	<li>この段階で胚外膜解剖を行う(E5.5)。 注:E5.5は、胚外膜解剖を行うのに理想的な時期です。CAM形成前に膜を早期に(例えばE4で)解剖すると、後の段階11で胚のアクセス性が低下する。さらに、E5.5では、胚は高度に血管化されたCAMによって部分的にしか覆われていないが、次の1〜2日間で、CAMはすぐに胚を包み込み、さらなるアクセスを妨げる11,12。このため、E6以降での膜解剖は、血管を裂くリスクが高まるため、困難である。<ol>
<li>滅菌した細い鉗子を使用してACMを優しくつかみ、胚から引き離します。次に、滅菌されたマイクロ解剖ハサミを使用して、前肢を覆う膜から頭部を覆う膜まで伸びる前肢の真上のACMの穴を切断する。 注:このステップは、絨毛膜および羊膜を弛緩させるため、次のステップで鉗子でつかんでさらに解剖することが容易になります。膜が卵殻窓を通してどのように解剖されるかの有用な概略については、 図1 を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>ACMとCAMの間の2つの隣接する位置(例えば、前肢の上に作られた切り込みとCAMの最も近い端との間の領域)で羊膜を優しくつかむために、2対の微細で滅菌された鉗子を使用する。<ol>
<li>羊膜をしっかりと把持している各ペアの鉗子を慎重に動かし、一方のペアを胚に対して背方向に動かし、もう一方を腹側に移動します。 注:この動きは、ACM(1対の鉗子によって胚に対して背側に引っ張られる)とCAM(他の一対の鉗子によって胚に対して腹側に引っ張られる)を分離しながら、羊膜をさらに引き裂くのに役立つ。</li>
		<li>CAMが胚を覆わなくなったときに膜が分離され、胚の腸からCAMに発せられるアラント動脈および静脈が容易に明らかであることを確認する。</li>
	</ol></li>
	<li>滅菌された細かい鉗子を使用して、胚を覆っている残りの羊膜を解剖して除去します。残りの羊膜が胚の尾半分を部分的に覆うことが最も一般的に観察される。<ol>
<li>滅菌した鉗子を使用して、胚の頭蓋中央領域付近の羊膜をつかみ、胚に対して尾方向に羊膜を慎重に引っ張り、以前の変位したCAMに向かってください。胚は完全に露出し、CAMのさらなる成長は主に発達中の胚から離れて起こる。 注:膜解剖後に露出した胚がどのように現れるかについての有用な概略図については、 図1 を参照してください。また、ステップ 3.3.-3.6 の役立つ概略図については、以前に公開されたレポート11 を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を数滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。</li>
	<li>ステップ 2.8 の説明に従って、透明なテープを使用して窓の穴を密封し直します。さらなる発達のために卵をインキュベーターに戻し、卵を水平に保ち、インキュベーターのロッキング機能を不活性化したままにする。</li>
	<li>手順 3.1.-3.8 を繰り返します。各卵のために。 注:上記のE5.5での胚外膜解剖は、E7を介して胚へのアクセスを可能にするが、これは創傷を行うことができるときである8,9。E8によって、CAM組織の継続的な成長は胚の頭蓋領域を覆い始め、したがって角膜へのさらなるアクセスを排除する。古いE8-E9角膜で創傷を行いたい場合は、胚に対して成長中のCAMを腹側に再配置することが可能である(ステップ3.10。E7で巻きたい場合は、ステップ3.10。行う必要はなく、1つはステップ4、角膜創傷に進むことができる。</li>
	<li>E5.5で胚外膜を解剖したE7卵子をインキュベーターから取り出します(ステップ3.1.-3.8)。CAMに融合した利用可能な羊膜組織を滅菌鉗子でつかみ、胚に対して腹側方向に胚の頭蓋領域から羊膜を静かに引き離す。 注:胚から離れて移動している羊膜はCAMに融合されているため、成長し血管化されたCAMは羊膜をつかむ鉗子に追従し、頭蓋領域から離れます。このステップを毎日繰り返して、胚が創傷のための所望の年齢になるまで、CAMを胚から遠ざけ続ける。</li>
</ol>4. 角膜損傷
<ol><li>所望の胚期に創傷するためのインキュベーターE7-E9から卵子を得る。滅菌した解剖はさみで窓からテープを切断して胚を露出させます。ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を数滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。</li>
	<li>マイクロ解剖ナイフを使用して、脈絡膜の亀裂に平行で、脈絡膜の亀裂に沿った右目の角膜の範囲にまたがる切開(胚が卵にどのように産むかのために、左目はアクセスできないが、創傷していない対照として役立つことができる)を行う(図1)。最初のカットは角膜上皮を横断します。<ol>
<li>マイクロ解剖ナイフを使用して、最初の切開と同じ場所で角膜を2倍以上裂傷(例えば、合計3回の切断、切断2および切断3が切断1と同じ位置で角膜内の同じ位置とともに生じる)11。第2の裂傷は基底膜を横断し、第3の裂傷は前間質を貫通する。 注:胚が解剖されたCAMの下に落ち着いた場合は、滅菌された湾曲した虹彩鉗子を使用して、CAMの下から頭を慎重に動かすことができます。湾曲した虹彩鉗子を頭の下に置き、頭の左側に接触させます。閉じた湾曲した虹彩鉗子の上に頭全体を抱きかかえ、CAMの周りと上に頭をそっと上げます。生存率を助けるために、湾曲した虹彩鉗子で同様の技術を使用して、CAMの適切な成長を促進するために、手術後に胚をCAMの下に戻す。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を3〜4滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。</li>
	<li>透明なテープで窓の穴を再シールし、卵を水平のままインキュベーターに戻します。胚が発達し、角膜創傷が所望の期間(例えば、0.5〜11日)治癒するのを許し、次いで断頭によって胚を人道的に安楽死させる。</li>
	<li>湾曲した虹彩鉗子を使用して、リンガーの生理食塩水の入ったペトリ皿に浮かぶ安楽死胚から目を収穫するには、目と顔の組織が出会う後側の目を優しくつかみ、目全体を慎重に持ち上げて顔の組織から解放します。<ol>
<li>細かい鉗子を使用して、目の後ろの小さな穴(3〜5cm)を突いて、軽度の攪拌で一晩4°Cで4%パラホルムアルデヒドに目全体を固定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+blindness%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Corneal blindness: a global perspective.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).</li>
<li>Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+cornea+as+a+model+of+wound+healing+and+neuronal+re-innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation.</a> Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).</li>
<li>Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sutures+and+dendritic+polymer+adhesives+for+corneal+laceration+repair+in+an+in+vivo+chicken+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model.</a> Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).</li>
<li>Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+for+corneal+wound+healing+research%3A+the+white+leghorn+chicken+%28Gallus+gallus+domesticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus).</a> Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).</li>
<li>Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+TGF-%CE%B2+isoforms+and+signaling+intermediates+in+corneal+fibrotic+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).</li>
<li>Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounded+embryonic+corneas+exhibit+nonfibrotic+regeneration+and+complete+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).</li>
<li>Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+normal+collagen+architecture+in+embryonic+wounded+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13815(2020).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).</li>
<li>Spurlin, J., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+increase+accessibility+to+late-stage+chick+embryos+for+in+ovo+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations.</a> Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+pressure+dependent+and+independent+growth+phases+of+the+embryonic+chick+eye+and+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).</li>
<li>Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing+in+tenascin+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing in tenascin knockout mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).</li>
<li>Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+enhancement+of+corneal+epithelial+wound+healing+of+rabbits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo.</a> Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).</li>
<li>Sumioka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+cornea+wound+healing+in+a+tenascin+C-deficient+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model.</a> Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).</li>
<li>Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+tenascin+and+cellular+fibronectin+in+the+rabbit+cornea+after+anterior+keratectomy.+Immunohistochemical+study+of+wound+healing+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).</li>
<li>Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens-derived+Semaphorin3A+regulates+sensory+innervation+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea.</a> Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).</li>
<li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+corneal+innervation%3A+interactions+between+nerves+and+specialized+apical+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).</li>
<li>Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+sulfated+glycosaminoglycans+and+their+effects+on+trigeminal+nerve+growth+cone+behavior+in+vitro%3A+roles+for+ECM+in+cornea+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).</li>
<li>Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+and+posttranslational+modification+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+isotype+during+chick+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).</li>
<li>Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+microscopy+for+quantitative+analysis+of+collagen+fibrillar+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure.</a> Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Waldvogel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bird%27s+eye+view%5BTitle%5D)+AND+%22American+Scientist%22%5BJournal%5D)">The bird's eye view.</a> American Scientist. 78, 342-353 (1990).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).</li>
<li>Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+wound+healing+response%3A+cytokine-mediated+interaction+of+the+epithelium%2C+stroma%2C+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).</li>
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ひよこは胎児の、傷跡のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルシステムです。哺乳類とは異なり、ひよこは、 ovo8または ex ovo戦略24を用いて、開発全体を通して容易にアクセス可能である。胚性のひよこ角膜はげっ歯類の角膜よりもはるかに大きく、頭蓋容積のほぼ50%が眼25に捧げられており、創傷などの物理的操作に非常に従順である。さらに、鶏の卵は一年中、しばしば地元の農場から容易に入手でき、費用対効果が高く、開発をサポートするために謙虚なインキュベーターのみを必要とします。
このプロトコルは、胚性ひよこ角膜創傷を可能にする一連の手順を報告している。胚性ひよこ角膜に作られた創傷は完全に再生し、検出可能な瘢痕化なしで天然の角膜構造の完全な反復を可能にする。この技術により、胚性ヒナギは、瘢痕のない角膜創傷治癒を調整する分子的および細胞的因子を解明するための重要な動物モデルとなった。
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角膜は、視力を助長する光を透過および屈折させる透明で、最も外側の眼の組織である。成人角膜において、角膜間質への損傷または感染は、角化細胞増殖、線維症、サイトカイン誘発アポトーシスにつながる炎症の増加、修復筋線維芽細胞の生成、および細胞外マトリックス(ECM)の全体的なリモデリングを特徴とする迅速かつ堅牢な創傷治癒応答をもたらす1,2.損傷後、このような角膜組織修復は、角膜の透明性を低下させ、光の通過を閉塞し、したがって視力を歪め、最も重篤な症例では角膜失明につながる不透明な瘢痕組織をもたらす3。したがって、創傷治癒の複雑さに対処し、創傷閉鎖および組織再生に関与する細胞因子および分子因子を同定するために、信頼できる動物モデルを開発することが明らかに必要である。
今日まで、角膜創傷治癒を調べるほとんどの研究は、出生後4または成体動物モデル1、2、5、6、7を利用してきた。これらの研究は、角膜創傷治癒応答および瘢痕形成の根底にあるメカニズムの理解において著しい進歩をもたらしたが、これらの治癒モデルにおける損傷した角膜組織は完全に再生できず、したがって、損傷後の角膜形態および構造を完全に反復させる分子因子および細胞機構を同定するための有用性を制限する。対照的に、胎児のひよこ角膜にナイフで生じた胎児の傷は、瘢痕のない方法で完全に治癒する固有の能力を有する8。具体的には、胚性ヒナギ角膜は、細胞外マトリックス構造の完全な反復および神経支配パターン8、9を有する非線維性再生を示す。
本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで巻き取ることに関与する一連のステップを記載する。第一に、卵子は、胚へのアクセスを容易にするために、初期胚期にウィンドウ化される。第2に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作は、角膜の3つの細胞層が形成され、創傷が望まれるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にするために行われる。第三に、角膜上皮を通って前足間質に貫通する線状中枢角膜切開は、顕微手術ナイフを用いて行われる。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。

<table><tbody><tr><td>18 G 皮下注射針</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>30 度角度付きマイクロダイセクティングナイフ</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 標識二次抗体</td><td>分子プローブ塩化</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルシウム二水和物(CaCl2-H20)</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr>チキン<tr><td>エッグトレイ</td><td>GQF</td><td>O246</td><td></td></tr>解<tr><td>剖鉗子、細い先端、鋸歯状</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr>解<tr><td>剖はさみ、鋭い先端</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>アイリス1x2歯組織鉗子、全湾曲</td><td>VWR</td><td>100494-908</td><td></td></tr><tr><td>キワイプシ</td><td>グマ</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖はさみ</td><td>VWR</td><td>470315-228</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗フィブロネクチン(IgG1)</td><td>発生研究ハイブリドーマバンク</td><td>B3 / D6</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ラミニン(IgG1)</td><td>発生研究ハイブリドーマバンク</td><td>3H11</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ニューロン特異的&β;-チューブリン(Tuj1, IgG2a)</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗テネイシン(IgG1)</td><td>発生研究 ハイブリドーマバンク</td><td>M1-B4</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td></td><td>Σ P4333</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Σ</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358</td><td></td></tr>スポーツ<tr><td>マン1502卵インキュベータ</td><td>ーGQF1502</td><td></td><td></td></tr>手<tr><td>包装(1.88インチ幅)</td><td>スコッチ</td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

ひよこの胚性角膜創傷は完全かつ迅速に再生する顕著な能力を示すが、成人の創傷角膜は線維性瘢痕化による透明性の喪失を経験する。損傷した胚性角膜の組織完全性は、検出可能な瘢痕形成なしに本質的に回復される。そのアクセス性と操作の容易さを考えると、ひよこ胚は瘢痕のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルです。このプロトコルは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与するさまざまなステップを示しています。第一に、卵子は初期胚期に窓を開けられ、眼にアクセスする。第二に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作が行われ、角膜の3つの細胞層が形成されるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にする。第三に、外側上皮層および前間質を貫通する線状角膜創傷は、顕微手術ナイフを用いて作製される。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。このモデルを用いたこれまでの研究では、創傷胚性角膜が角化細胞分化の活性化を示し、ECMタンパク質の天然の三次元マクロ構造への協調的なリモデリングを受け、角膜感覚神経によって適切に再神経支配されることが明らかになった。将来的には、再生プロセスに対する内因性または外因性因子の潜在的な影響は、組織移植、エレクトロポレーション、レトロウイルス感染、またはビーズ移植などの発生生物学技術を使用して、治癒角膜において分析することができる。現在の戦略は、胚性ひよこを、瘢痕のない角膜創傷治癒を調整する分子的および細胞的要因を解明するための重要な実験パラダイムとして特定している。

E5.5でACMとCAMを早期に解剖して発育中の胚の頭蓋領域を露出させた後、E7中央角膜にまたがる一連の裂傷が 卵子で 行われました(図1)。角膜再生を研究するのに理想的な創傷は、それぞれが角膜の同じ場所で作られた3つの裂傷の後に起こる。第1の裂傷は角膜上皮を横断し、第2および第3の裂傷はそれぞれ下層の基底膜および前中質を貫通する。理想的な創傷を達成するには、鋭利な微小解剖ナイフ( 材料表を参照)を使用し、裂傷が作られるときに正しい量の圧力を加えることが重要です(図2、理想的な創傷を参照)。圧力が少なすぎると、前間質を十分に貫通せずに角膜上皮を引き裂く浅い創傷が生じる(図2、浅い創傷を参照)。しかし、あまりにも多くの圧力をかけると、全範囲創傷が間質全体を貫通し、房水を外部環境に曝すことになる(図2、全範囲創傷を参照)。
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本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与する様々なステップを実証する。再生または完全に回復した角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

成人の角膜間質の損傷は、不透明な瘢痕組織形成のために視力を損なう急速な創傷治癒反応をもたらす。このプロトコルは、成人とは異なり、瘢痕なしで治癒することができる胚性ひよこ角膜に創傷を生成する。損傷した胚性角膜が、検出可能な瘢痕化なしに天然の角膜構造の完全な反復を受ける固有の能力を考えると、胚性ひよこは、瘢痕のない角膜創傷治癒のための分子および細胞因子を解明するための重要な動物モデルに役立つ。この技術の最も困難な側面は、最も外側の上皮とより深い角膜間質の両方を貫通する一貫した創傷を生成することである。学習しているときに、角膜間質への創傷浸透の深さを評価できるように、創傷角膜を断面で見ることが役立つかもしれません。まず、卵をトレイに水平に配置し、卵の上部にマークを付けて、胚の予想される位置を示します。これらの卵を摂氏38度の加湿インキュベーターで孵化させ、ロッキング機能を作動させます。胚発生の3日目に卵をインキュベーターから取り出し、安全な卵ホルダーに水平に置きます。解剖ハサミの鋭い端を使用して、卵の尖った端の近くに卵殻の上部に小さな穴を開けます。18ゲージの斜めの皮下注射針を穴に挿入します。針を卵の内面の底に押し込み、針の斜め側を卵の尖った端に向け、鶏の卵から2〜3ミリリットルのアルブミンを取り出して捨てます。糸くずの出ないワイプで穴を囲む卵殻の表面をきれいにし、70%エタノールで軽く湿らせて乾かします。アルブミンを除去するために作った穴を透明なテープで密封します。解剖ハサミの鋭い端で、卵殻の上部に2番目の窓の穴を開けます。はさみが卵殻に伸びすぎないようにして、2番目の穴の側面のすぐ下に位置する胚または胚性血管系に接触して損傷しないようにします。湾曲した鉗子を使用して、窓の穴を直径約2〜3センチメートルに広げ、殻の下の発達中の胚を明らかにしてアクセスさせます。次に、鉗子の一方の端を穴に挿入し、卵の殻と平行に、密接に並置します。もう一方の鉗子の端を卵殻の外側に配置して、2つの鉗子の端を慎重につまんで、卵殻の小さな部分を壊して取り除くことができます。胚を直接覆う2〜3センチメートルの窓が残るまで、卵殻の破片を壊して取り除き続けます。細菌汚染を制限するために、ペニシリン1ミリリットルあたり50単位およびストレプトマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含む100〜200マイクロリットルのリンガー溶液を窓の穴から加える。窓の穴は透明な粘着テープでシールします。この卵のシールを行うには、テープの角を穴の長軸に合わせ、穴の端から1〜2センチメートル離れたシェルにテープを押し付けます。テープの垂れ下がったフラップが片側に残るまで、開口部の周りをシールし続けます。2枚のテープを一緒に押して穴の上にドーム型を作り、張り出したテープのフラップを殻に押し付けて卵を密封し終えます。さらなる発達のために窓付きの卵をインキュベーターに戻します。これらの卵を水平に保ち、インキュベーターのロッキング機能をオフにしてください。解剖顕微鏡を使用して、胚が適切な発生段階にあることを確認し、羊膜膜および脈絡膜の位置を特定する。次に、滅菌されたマイクロ解剖ハサミを使用して、膜から延びる前肢の真上の羊膜膜の穴を切り、前肢を頭部の上にある膜に覆う。2対の微細な滅菌鉗子を使用し、羊膜絨毛膜ACMと絨毛膜との間の2つの隣接する位置で羊膜を優しくつかむ。羊膜をしっかりと把持している各ペアの鉗子を慎重に動かし、一方のペアを胚に背方向に動かし、もう1つのペアを腹側に移動します。滅菌された細かい鉗子を使用して、胚を覆っている残りの羊膜を解剖して除去します。滅菌した鉗子を使用して、胚の頭蓋領域の中央付近の羊膜をつかみ、胚に対して羊膜をコドル方向に慎重に引っ張り、以前の変位した絨毛膜に向かってください。原稿に記載されているように透明なテープを使用して窓の穴を再シールし、卵をインキュベーターに戻してさらに開発します。余分な胚膜は、右目がアクセス可能であることを保証するために再配置する必要があるかもしれません。卵中の胚の位置のために右目が創傷のためにアクセスできない場合、それは非創傷対照として役立つことができる。マイクロ解剖ナイフを使用して、脈絡膜組織に平行でインラインである右目の角膜の範囲にまたがる切開を行います。マイクロ解剖ナイフを再度使用し、最初の切開と同じ場所で角膜を裂傷し、角膜内の同じ位置に伴って生じる2つと3つを切断するように2回以上切断する。生存率を助けるために、湾曲した虹彩鉗子を使用して、手術後に胚を絨毛膜の下に戻し、絨毛膜の適切な成長を促進する。次に、抗生物質を含むリンガー溶液を3〜4滴加えて胚を水和させ、卵子を殺菌する。透明なテープで窓の穴を再シールし、卵を水平のままインキュベーターに戻します。胚が発達し、角膜創傷が所望の期間治癒するのを許す。孵卵後、胚を安楽死させ、湾曲した虹彩鉗子を使用して、目と顔の組織が出会う後側の目を優しくつかみ、慎重に目全体を持ち上げて顔組織から解放することによって、リンゲルの生理食塩水溶液のペトリ皿で目を収穫します。細かい鉗子を使って目の後ろに3〜5センチの小さな穴をあけ、軽度の興奮で一晩中4°Cの4%パラホルムアルデヒドで目全体を固定します。理想的な創傷を達成するためには、鋭利なマイクロ解剖ナイフを使用し、裂傷中に正しい量の圧力を加えることが重要です。圧力が少なすぎると、前間質に十分に浸透せずに角膜上皮を引き裂く浅い創傷が生じる。あまりにも多くの圧力を加えると、全範囲の創傷が間質全体を貫通し、房水を外部環境に曝す。適切な裂傷切開を行うことで、創傷後最初に0〜3日拡大する理想的な創傷が生じる。その後、再上皮化および新しい組織形成が起こり、最終的に創傷後11日間、瘢痕のない様式で創傷を閉鎖する。治癒創傷内の細胞外マトリックスタンパク質、フィブロネクチンおよびテナスシンの時空間局在は、角膜再上皮化に対応する時点で上昇することが見出され、創傷閉鎖、上皮細胞遊走および生存へのそれらの関与を示唆する。ホールマウント免疫組織化学は、創傷した中枢角膜を直接並置した神経が治癒角膜組織から一時的に阻害されることを明らかにした。以前の阻害にもかかわらず、角膜神経は最終的に、創傷後11日目に完全に治癒した角膜組織を同様の密度レベルに、そして同様のパターンで、18日目に一致した非創傷対照のステージに神経支配する。第2世代の高調波画像法によって証明されるように、中央角膜創傷の様々な深さにわたってコラーゲン線維の束が直交して配置され、非創傷中央角膜組織の天然マクロ構造と一致する。組織移植やビーズ移植などの古典的な発生生物学アプローチ、およびレトロウイルス感染やDNAエレクトロポレーションなどの遺伝子操作のための現代のアプローチと組み合わせると、この動物モデルは、瘢痕のない角膜創傷治癒を促進するために必要な分子因子および細胞メカニズムを明らかにすることを約束します。胎児の瘢痕のない創傷治癒を調節するマトリックスタンパク質の主要な分子因子を決定することは、より少ない瘢痕化および正常な組織構造のより良い反復でより回復的な治癒プロセスを促進する治療法への道を開くであろう。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、細胞の挙動を研究する中でエレクトロスピニング膜内micropocketsを製造するための技術を報告している。具体的には、マイクロ光の組み合わせを記述し、微小特徴を備えたPLGA（ポリ（ラクチド - コ - グリコリド））角膜の生体材料デバイスの製造のためのエレクトロスピニング。...

角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

ここで説明されているのは、上皮組織の本来の微小環境における損傷応答のメカニズムを調査するために使用できる、臨床的に関連性のあるex vivo模擬白内障手術モデルの確立です。...

臨床的に関連の確立<em&gt;エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための&gt;モック白内障手術モデル

この記事では、R26R-Confettiマウスを使用した多色系統追跡実験を設計し実行するための原理について説明します。私たちは、他の関心のある組織に修飾できる角膜上皮細胞を追跡するための特定のプロトコルを提供します。...

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア...

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D...

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。...

角膜創傷治癒を研究するための上皮擦過傷モデル

この記事では、角膜の解剖学と組織学、およびその治癒過程を研究するために開発された新しい動物モデルについて説明します。この新しい動物モデルは、ヒトの角膜と多くの類似点を持つ角膜を持つモンゴルスナネズミを使用しています。...

創傷治癒の動物モデルとしてのモンゴルスナネズミ

デスメのストリッピングのみは、フックス内皮角膜ジストロフィーに起因する中枢角膜ガッタを有する患者が、末梢細胞が内皮層を再生するためにデスメの膜を剥離する実験手順である。我々は、eFGF1(NM141)によって刺激された治癒の促進を伴うジストロフィー性ヒト角膜 エクスビボ におけるDSOをシミュレートする新規方法論を提示する。...

操作された線維芽細胞増殖因子によって刺激された加速治癒を伴うデスメのストリッピングのみのヒト角膜器官培養モデル1

ここでは、角膜を神経支配する感覚線維を損傷する3つの異なる方法を提案します。これらの方法は、マウスの軸索再生の研究を容易にします。これら3つの方法は、他の動物モデルにも適応可能であり、角膜神経支配の生理学と再生の研究に最適です。...

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

臓器培養ブタ角膜および上皮創傷治癒を用いた治療毒性および化学的毒性の評価

ウサギの角膜間質創傷修復のための現場ブルーライト交差ゲラチンリボフラビンハイドロゲルの調製、濃縮、適用に関する再現可能なプロトコルを提示し、手術的取り扱い、部分的な足蘠切除術、術後ケアの手技手順を含みます。...

ウサギの角膜創傷修復のための強化光交連ゲラチン–リボフラビンハイドロゲルの製造および外科的応用

学ぶ 胚性ヒヨコ角膜の創傷法と瘢痕なし治癒メカニズム。上皮と間質への一貫した傷形成と断面解析により、組織再生の分子・細胞要因を解明し、角膜損傷治療の発展に貢献します。

胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査

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