Name: 生理条件下での細胞内膜リモデリングを調査するためのマウス皮膚における好中球移動のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶマウス皮膚における好中球移動のイメージング手法。生体内微小細胞顕微鏡を用いて細胞膜リモデリングを可視化し、免疫応答における細胞動態を詳細に解析する技術を習得できます。

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この研究は、国立衛生研究所、国立がん研究所、がん研究センターの学内研究プログラムによって支援されました。

<ol><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
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<li>Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+in+mesenchymal-to-amoeboid+transition+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
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<li>Sack, F. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+pulmonary+microcirculation+after+single+lung+transplantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs.</a> Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).</li>
<li>Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+3D+visualization+of+cellular+and+tissue+structures+in+intact+muscle+with+second+and+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy.</a> PloS One. 6 (11), 28237(2011).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+third+harmonic+generation+microscopy+of+collective+melanoma+cell+invasion%3A+Principles+of+interface+guidance+and+microvesicle+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics.</a> Intravital. 1, 32-43 (2012).</li>
<li>Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microscopy+and+the+extracellular+matrix+structure%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review.</a> Cells. 10 (7), 1760(2021).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+harmonic+generation+microscopy+of+cells+and+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization.</a> Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polyhedral+actomyosin+lattices+remodel+micron-scale+curved+membranes+during+exocytosis+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).</li>
<li>Shitara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+negatively+regulates+endocytosis+during+apical+membrane+maintenance+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Subramanian, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LTB4-BLT1+axis+regulates+actomyosin+and+%CE%B22-integrin+dynamics+during+neutrophil+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).</li>
<li>Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+F-Actin+filament+organization+during+lymphocyte+transendothelial+and+interstitial+migration+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy.</a> iScience. 16, 283-297 (2019).</li>
<li>Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-wide+synchronization+of+mitochondrial+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations.</a> Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).</li>
<li>Takihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Calvo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mitochondrial+calcium+levels+associated+with+neuronal+death+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 11, 2146(2020).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).</li>
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<li>MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: 
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<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).</li>
<li>Xu, C., Prince, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakes%2C+shapes%2C+and+gradient+vector+flow%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+A+Publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Snakes, shapes, and gradient vector flow.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).</li>
<li>Driscoll, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+nuclear+shape%3A+what+can+we+learn+from+a+prematurely+aged+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell.</a> Aging. 4 (2), 119-132 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+phototoxicity+during+multiphoton+microscopy+of+live+Drosophila+embryos+in+the+1.0-1.2+%C2%B5m+wavelength+range%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range.</a> PloS One. 9 (8), 104250(2014).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoregulin+regulates+a+shedding+mechanism+that+drives+melanosome+transfer+from+melanocytes+to+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

細胞遊走と膜リモデリングの分野では何十年にもわたる進歩が進んでいますが、生きた動物の細胞内の特徴を視覚化するためにIVMを使用した研究はほとんどありません。このプロトコルに記載されている手順は、生きた動物における好中球の移動、より具体的にはこのプロセス中の原形質膜のリモデリングに関する新たな洞察を得るための強力なツールを提供します。このアプローチにより、組織微小環境の固有の複雑さを考慮した生理学的条件下での好中球の移動を調べることが可能になります。実際、MPMを使用すると、選択した蛍光マーカーを発現するマウス系統、外因性組織標識、内因性蛍光の励起、およびSHGまたはTHGを介して生成されるシグナルの組み合わせを使用して、宿主組織内の複数の特徴を視覚化できます12,13。
この手順で考慮すべき潜在的な問題の1つは、光損傷です。MPMは、光退色および光毒性に関して、一般に共焦点顕微鏡法よりも安全であるが、生きた組織をイメージングする際には注意が必要である34。光毒性は、小さな明るい斑点から損傷した組織のより大きな領域まで、さまざまなイメージングアーチファクトを作成するか、さまざまな細胞内経路を阻害/刺激することにより、結果を大幅に妨げる可能性があります。光毒性を防ぐために、レーザー出力は最小限に抑えるべきであり、生理学的条件が維持されていることを確認するための適切な制御を設計する必要があります(例えば、血流の測定、酸化ストレスのプローブ)35,36。さらに、皮膚を含むこの特定の手順では、ダークコート動物に存在するメラニンが光毒性36,37,38に対してより敏感であるため、アルビノ株が強く推奨されます。
この手順の主な制限の中には、使用される顕微鏡システムと好中球の性質があります。MPMを使用すると、他の光学顕微鏡技術(共焦点、回転ディスクなど)と比較すると、組織イメージングの深さが大幅に増加しますが、耳の細胞内ダイナミクスを視覚化する能力は、組織の最も外側の層(80〜100μm)に制限されます。これは、厚いECM層によって生成される強い光散乱により、より深い層での移動を調査することが困難になるためです。また、好中球は非常に短命で、遺伝子編集技術を行うのに十分な期間、培養物に留まることができないという制約もあります。これは、特定の遺伝子を欠く、または選択された突然変異を持つ好中球を作製するようにマウスを操作することで克服できますが、これはもちろん研究コストと期間を増加させます。
ここで説明する手順は、膜のダイナミクスを調べるように設計されていますが、好中球だけでなく、他の免疫細胞タイプや遊走細胞の細胞生物学的な問題にも対処できるように調整できます。低倍率IVMを通じて細胞の挙動(例えば、移動性表現型、細胞速度、および方向性22)について収集された情報は、オルガネラの再配置、タンパク質分泌、エンドサイトーシス、核ダイナミクス、カルシウムダイナミクス、細胞骨格組織化、およびネトーシスに関するISMicを通じて取得された機構情報と補完し、相関させることができます。薬理学的および/または遺伝子操作の使用は、関心のあるプロセスにおける特定の分子経路の役割を強調することができ、これをユニークで非常に強力なアプローチにします。

指向性細胞遊走は、発生、免疫応答、組織修復、腫瘍の開始、進行、播種など、さまざまな生理学的および病理学的プロセスで発生する重要なイベントです1,2。このプロセスは、原形質膜で同族の受容体によって感知され、その後、複雑な細胞内シグナルに変換される特定の細胞外走化性シグナルに依存しています。これらの経路は、細胞骨格の局所的な活性化、膜の輸送とリモデリング、細胞分極3などの一連の応答を通じて細胞移動を活性化します。細胞遊走には、間葉系とアメーバ4の2つの異なるタイプがよく特徴付けられています。間葉系の遊走は比較的遅く(<1 μm/分)、細胞と細胞外マトリックス(ECM)との間の強い接着に依存し、メタロプロテアーゼによって誘発されるマトリックスの分解に依存します。対照的に、アメーバ遊走は、炎症の合図に迅速に反応する免疫細胞の特徴であり、より速く(>10μm/分)、ECMを通過するために弱い接着を利用します。モダリティに関係なく、細胞遊走は、細胞の前縁に突出構造を生成する結果、原形質膜の絶え間ないリモデリングを必要とし、その結果、後部の膜の収縮と緊密に調整される1。
これらの細胞内プロセスの根底にある分子メカニズムを解明するためには、移動する細胞の膜の動態を適切な時間的および空間的分解能で可視化することが基本です。さらに、膜リモデリングは、移動する細胞を取り巻く組織微小環境の特性に強く影響されるため、このプロセスを生きた動物の中の天然組織で直接イメージングすることが重要です。これは、生体内顕微鏡(IVM)5を使用して実現されます。最初のIVMイメージングは~200年前に行われ、白血球の血管外漏出が単純な経光顕微鏡で可視化され6、その後、IVMは主にゼブラフィッシュやショウジョウバエなどの半透明モデル生物に使用されました7,8。過去20年間で、IVMは、マウス、ラット、およびブタなどの大型哺乳類の細胞プロセスを調査するために成功裏に使用されてきました5,9。これは、1)共焦点顕微鏡および多光子(MP)顕微鏡法の大幅な発展と、2)CRISPR-Cas9などの遺伝子編集技術の台頭により、蛍光タグ付きタンパク質やレポーターを発現するためのさまざまな動物モデルの迅速なエンジニアリングを可能にしたために可能になりました。さらに、腫瘍の開始、細胞遊走、免疫応答などのプロセスにおける個々の細胞とその微小環境の可視化は、血管系を標識するための色素の全身導入など、他の形態の外因性標識10,11と、第2高調波発生(SHG)10によるコラーゲンなどの内因性分子の興奮の両方によって可能になった。12および第3高調波発生(THG)11,13による神経線維。最後に、心拍や呼吸による運動アーチファクトを最小限に抑える技術の向上により、生体内細胞内顕微鏡(ISMic)が開発され、研究者は生体内で観察されるのと同様の解像度で、生きた動物でいくつかの細胞内イベントを直接画像化し、調査することができるようになった14,15,16,17 .ISMicの例としては、エキソサイトーシス14,15,16,17およびエンドサイトーシス15における細胞骨格ダイナミクスの調査、細胞遊走17,18における細胞骨格ダイナミックリモデリング17,18、ミトコンドリアの局在化および代謝19,20、脳21におけるカルシウムシグナル伝達の調査が含まれる。
このプロトコルでは、ISMicを使用して生きたマウスの耳の皮膚に好中球が移動する際の細胞膜リモデリングを細胞内分解能で調査するためのさまざまな手順と手順について詳しく説明します。このアプローチは、前述のプロトコル22,23に基づいており、より高い空間的および時間的解像度を達成するために適合されている。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL</td>チューブ <td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>15 mL</td>チューブ <td>コーニング</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>1 mLシリンジ</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>27 G ニードル</td><td>ケンドール</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>27 G 翼付き輸液セット</td><td>テルモ</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>30x 対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1.05 NA、シリコンオイル浸漬</td></tr><tr><td>40倍対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1.23 NA、シリコンオイル浸漬</td></tr><tr><td>60 mm ディッシュ</td><td>ファルコン</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 mL シリンジ</td><td>ケンドール</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>アセプロマジン (10 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>品質 生物学的</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>バランス</td><td>AND</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>セル ストレーナー 40 & マイクロ;m</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>フィジー</td><td>ImageJ</td><td>該当なし 画像</td><td>可視化/分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Fluoviewソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td>N/A</td><td>取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>FVB マウス ジャ</td><td>クソン</td><td>N/A</td><td>FVBバックグラウンド</td></tr><tr><td>ガス麻酔システム</td><td>パターソン 獣医</td><td>07-8915712</td><td>リンク 7モデル</td></tr><tr><td>グリーンセルトラッカー</td>サー<td>モ</td><td>C2925</td>細胞<td>培養グレードのDMSOで可溶化して1 mM濃度(1000x)</td></tr><tr><td>脱毛クリームNair</td><td></td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS(w / o Ca2 +、Mg2 +)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7.3</td>品質<td>生物学的</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ヒストパク1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>画像可視化/解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>ラボで生成</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J 背景</td></tr><tr><td>手動マイクロマニピュレーター</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>mtomato マウス 研究室</td><td>で生成された</td>マウス系統 <td>N/A</td><td>mT/mG, FVB 背景</td></tr><tr><td>多光子レーザー</td><td>スペクトル物理学</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>多光子顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>ナノフィル 10 & マイクロ;Lシリンジ</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G ニードル</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>オブジェクティブヒーター</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>オブジェクティブヒーターコントローラー</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>メジャー</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>酸素濃縮器</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS(Ca2+、Mg2+なし)</td><td>品質 生物学的</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td></td><td>品質 生物学的 114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>ステージヒーター</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ステージヒーターコントローラー</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>低アレルギー性</td></tr><tr><td>シリンジドライバー</td><td>ハーバード大学装置</td><td>PHDウルトラ</td><td></td></tr><tr><td>温暖化パッド</td><td>パークランドサイエンティフィック</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>温暖化ポンプ</td><td>パークランドサイエンティフィック</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン (100 mg/mL)</td><td>獣医 1</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

生理条件下での細胞内膜リモデリングを調査するためのマウス皮膚における好中球移動のイメージング

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

免疫細胞の動員と組織機能の研究は、過去20年間にわたって非常に活発な分野でした。好中球は、感染時や組織損傷時に炎症部位に到達し、自然免疫応答に関与する最初の免疫細胞の一つです。これまでに、好中球の遊走は、均一な刺激に基づくさまざまなin vitro実験システム、またはアガロースまたはマイクロ流体チャネルの下での閉じ込められた遊走を使用して、成功裏に視覚化されてきました。しかし、これらのモデルは、好中球が生体内で遭遇する複雑な微小環境を再現するものではありません。生体内細胞内顕微鏡(ISMic)などの多光子顕微鏡(MPM)ベースの技術の開発は、生理学的条件下で細胞内分解能で好中球ダイナミクスを可視化および調査するための独自のツールを提供します。特に、麻酔をかけた生きたマウスの耳は、そのアクセスの容易さと外科的曝露の欠如により、好中球間質性移動をリアルタイムで追跡するための実験的利点を提供します。ISMicは、細胞プロセスと、さらに重要なことに、細胞内プロセスを経時的に3D(4D)で追跡するために必要な光学的解像度、速度、および取得深度を提供します。さらに、間質性微小環境(すなわち、血管、常在細胞、細胞外マトリックス)のマルチモーダルイメージングは、選択した蛍光マーカーを発現するトランスジェニックマウス、蛍光プローブによる外因性標識、組織内因性蛍光、および第2/第3高調波生成シグナルの組み合わせを使用して容易に達成できます。このプロトコルでは、1)マウスの耳への養子移植のための好中球の調製、2)最適な細胞内イメージングのためのさまざまな設定、3)生理学的応答を維持しながら運動アーチファクトを最小限に抑える戦略、4)ISMicを使用して好中球で観察された膜リモデリングの例、および5)in vivoで移動する好中球における膜リモデリングの定量分析のためのワークフローについて説明します。

ここでは、細胞内分解能と細胞内分解能をそれぞれ提供する従来のIVMとISMicを示すために、2つの異なる結果セットを示します。第1の例では、野生型(WT)マウスから好中球を精製し、細胞質を染色するためにCell Tracker Greenで標識し、原形質膜を標的とする蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス(mTomatoマウス、別名mT/mG33、 図1 、 動画1、動画2)に注射した。このレシピエントマウスは、血管、常在細胞、毛包などの耳組織の構造的特徴(図1C および 動画1)をIVMベースのアプローチ(ステップ6.8.1) で 可視化することを可能にしました。SHG(励起の半分の波長で検出) を介して 明らかになったコラーゲン線維は、好中球が注入された真皮の複雑なネットワークに配置されました。毛包(HF)の縁に沿って、上皮細胞(すなわち、ケラチノサイト)の層が観察されました。時折、皮膚の局所的な陥凹をもたらす残留毛からのアーティファクトが視覚化されました(H)。レーザー誘発性の損傷は、すべてのチャネルで検出される強力な自家蛍光とコラーゲン配置の変化により、容易に視覚化できました(図1D)。皮膚の3D構造と注入された好中球の局在化のより完全なビューは、外層から内層までの皮膚のZスタックと3Dボリュームレンダリングを描いた ムービー1で評価できます。タイムラプスイメージングでは、好中球が耳の皮膚をサンプリングし、ECMや宿主組織と相互作用していることが示されました(動画2)。この分解能でイメージングし、30秒ごとにZスタックを取得することで、細胞の追跡や運動性パラメータ(速度や方向性)の測定が可能になりますが、この分解能では膜リモデリングの精密かつ詳細な解析は困難です。
2番目の例では、LyzM-cre mT/mGマウスから精製したmGFP発現好中球をWT動物に注入したISMicアプローチ(ステップ6.8.2)により、膜リモデリングを評価しました(図2A、実験フローチャート)。ISMicプロトコル(動画3、図2Bの静止画)を用いてレーザー損傷を受けた場合、移動中の原形質膜の動的リモデリングが観察され、前縁での膜突起の形成と細胞後部の収縮が明確に可視化されます(図2、動画3)。ムービー3でハイライトされたタイムラプスシーケンスは、ECMとの相互作用の複雑さを明らかにしています。実際、好中球は間質性空間を通って移動し、繊維に沿って移動するか、繊維の間の空間を移動しました。最後に、曲率の変化や細胞の表と裏の面積変化などの定量的な側面を、各時点について定量化しました。図2Bに示した細胞を例にとり、細胞表面の基礎となる100の境界点の同定に基づくアルゴリズムパイプライン(ステップ7参照)を用いて、原形質膜の局所的なダイナミクスを解析しました(図3A)。局所的な曲率の変化(図3B)と原形質膜突起によって下線が引かれた領域(図3C)は、境界点ごとに計算され、キモグラフとして各時間枠で報告されました(図3D、E)。細胞の前面と背面の両方が、細胞の側面よりも高い湾曲を維持します(図3D)。負の領域の変化(収縮、青色の領域)は、正の領域の変化がより目立つ前縁(突起、赤色の領域)よりも、細胞の背面でより顕著になります(図3E)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> 図1:マウスの耳の皮膚における好中球のIVM. (A)顕微鏡ステージ上の耳のセットアップの概略図。(B)実験フローチャート。(C)mTomatoマウスの耳の皮膚に蛍光標識好中球を注入した、異なる投影法の代表的な画像。毛包(HF)、血管(BV)、表皮(E)、真皮(D)、基底細胞層(BCL)、および毛のアーチファクト(皮膚表面の残留毛によるH)。(D)無菌レーザー損傷後のマウス皮膚の代表画像:青チャンネル(右)、緑と赤チャンネル(中央)、合成画像(左)。画像の左側には、緑と赤の両方のチャネルでの強い自家蛍光発光と、コラーゲン-I線維の穴の形成によって観察されるECMの破壊によって損傷が見られます。 C および Dでは、緑:好中球;赤:マウス宿主組織;シアン:コラーゲン-I SHG。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> 図2:WTマウスの耳の中を移動するmGFP好中球のタイムラプス。 (A)実験フローチャート。(B) 動画3の代表的な静止画です。(C)膜の3D組織を視覚化するための同じ細胞のボリュームレンダリング。膜ダイナミクスが高い領域は矢印で示されています(赤は収縮、青は突出)。(D)レンダリングされたセルボリュームのクローズアップおよび傾斜した視覚化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> 図3:ISMicを使用して収集された膜動態の定量化のための解析パイプライン (A) 図2Bに記載されているmGFP好中球の細胞輪郭決定と2つの連続フレーム間の境界点再分配(100境界点)。(B)色付きの境界は、各境界点について決定された局所的な膜曲率を表します。(C)2つの連続するフレーム間のローカルエリアの変化(現在:青、次:赤)。緑色の領域は、局所的な膜運動の追跡結果を表しています。黄色の矢印は、膜の変位の一般的な方向を示しています。(D)時間の経過に伴う細胞の境界曲率キモグラフ。縦軸は境界ポイントのインデックスを表し、1 と 100 は移動方向に従ってセルの後部を表します。(E)細胞の膜突起(赤)と膜収縮(青)を経時的に反映する局所領域変化キモグラフ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
動画1:IVMを用いてmTomatoマウスの耳に可視化された緑色の標識好中球。 赤:mTomato宿主マウス組織。シアン:コラーゲン-I SHG;緑:好中球。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画2:mTomatoマウスの耳の皮膚で移動する好中球のIVM。 ビデオは、5フレーム/秒のフレームレートで27分間に取得した画像スタックの最大強度投影です。赤:mTomato宿主マウス組織。シアン:コラーゲン-I SHG;緑:好中球。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画3:WTマウス耳の好中球遊走中の膜リモデリングのISMic。 ビデオは、10フレーム/秒のフレームレートで8分間に取得した画像スタックの最大強度投影です。赤:mTomato宿主マウス組織。シアン:コラーゲン-I SHG;緑:mGFP好中球;ライトグリーン:好中球をレンダリング。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

好中球の移動は、化学誘引物質とその細胞外微小環境との相互作用に応答した原形質膜の急速かつ連続的なリモデリングに依存しています。本明細書に記載されるのは、麻酔マウスの耳に注入された好中球における膜リモデリングの動態を調査するための生体内細胞内顕微鏡法に基づく手順である。

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

この方法は、生体内細胞内顕微鏡を使用して、生きた動物の好中球移動中の膜リモデリングを研究する技術を示しています。このプロトコルは、物理的条件下での動物移動中の膜ダイナミクスを研究し、組織の微小環境に関与しないようにするための独自のアプローチを提供します。この技術は、膜リモデリングと細胞骨格の動的臓器再配置、およびさまざまな細胞タイプおよび遊走細胞における膜輸送に対処するように調整できます。まず、野生型マウスから精製した好中球懸濁液に緑色蛍光色素を1.5ミリリットルのBSAコーティングチューブで加えます。チューブローテーター内で穏やかに攪拌し、室温で30分間インキュベートします。HBSSを使用して3回洗浄した後、室温でGの400倍で5分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのハンクスバランス塩溶液に再懸濁します。この懸濁液をBSAコーティングされたチューブに入れ、注入手順まで穏やかに攪拌しながらチューブローテーターに入れます。注射の前に、細胞ペレットを生理食塩水に再懸濁して、20マイクロリットルあたり200万〜500万個の細胞の密度に達します。麻酔をかけた動物を摂氏37度の温熱パッドに移し、体温を維持します。足の引き抜き反射をテストした後、画像品質を最適化するために、細かいトリマーを使用して耳から毛を取り除きます。動物を横向きに置き、耳の端を持ち、サージカルテープを使用して加温パッドに沿って平らにしてから、33ゲージの針を備えた注射器に好中球懸濁液を充填し、マイクロマニピュレーターに取り付けます。針を耳に向かってゆっくりと動かし、ゆっくりと皮膚に穴を開けます。針が皮膚の内側に入ったら、ピストンをゆっくりと押し、2〜3マイクロリットルの細胞懸濁液を供給します。耳の2〜3つの異なる領域に注射を慎重に繰り返した後、手術用テープを慎重にはがし、監視下で動物が意識を取り戻すのを待ちます。イメージングの前に動物を1時間休ませて、組織と細胞が注射手順から回復するのを待ちます。顕微鏡の電源がオンになっていて、ステージとレンズが摂氏37度に予熱されていることを確認してから、麻酔をかけた動物を顕微鏡ステージに置きます。ステージの穴をガラスのカバースリップで覆います。麻酔をかけた動物を慎重にステージに移動します。イメージングが1時間以上計画されている場合は、眼科用軟膏を塗布し、翼のある注入ベースの灌流システムを固定します。.カバーガラスの中央に生理食塩水を一滴垂らし、その上に注入した好中球の耳を置きます。カバースリップの中央を横切る滅菌綿棒を使用して耳をそっと平らにし、エアポケットを取り外します。動物の頭に近い耳の側面に木の棒をそっと押し付け、テープでロックして耳を固定します。次に、顕微鏡の接眼レンズを使用して関心のある領域を見つけ、多光子取得モードに切り替えます。レーザー励起波長を900〜930ナノメートルに設定すると、緑色蛍光色素、mTomato、およびコラーゲン-Iを同時に取得できます。次に、放出された光を収集するために、検出器に適切なミラーとフィルターの組み合わせを設定します。ハードウェア構成に最も適した設定を決定します。移動細胞を30秒から1分間隔で追跡できる場合でも、少なくとも10秒未満の間隔で細胞内イベントを画像化します。従来の生体内顕微鏡法では、30倍レンズと画像サイズ512×512ピクセルのガルボスキャナーを使用して細胞移動を追跡し、宿主マウス組織を調査し、ステップサイズ2マイクロメートルの電動ステージを使用してZ軸の変位を設定し、30秒ごとに30マイクロメートルの深さのボリュームをイメージングできるようにします。生体内細胞内顕微鏡法では、40倍レンズと3倍平均化の共鳴スキャナーを使用して、高ダイナミックな膜リモデリングをより高い倍率と解像度でイメージングします。また、1マイクロメートルのステップサイズのピエゾを使用してZ軸の変位を設定し、4〜5秒ごとに20マイクロメートルの深さのボリュームイメージングを可能にします。高出力励起レーザーを20 x 20マイクロメートルの狭い領域に10秒間集束させることにより、好中球の移動を引き起こす滅菌レーザー損傷を誘発します。レーザー誘発性損傷は、すべてのチャネルに現れる強力な自己蛍光シグナルと、その結果生じるコラーゲン配列の変化によって特定されます。実験の最後にデータを保存して、さらに分析できるようにします。レシピエントマウスは、生体内顕微鏡を用いたアプローチにより、血管、常在細胞、毛包などの耳組織の構造的特徴を可視化することを可能にしました。レーザー誘発性の損傷は、すべてのチャネルで検出される強力な自家蛍光と、コラーゲン配列の変化により、容易に視覚化できました。皮膚の3次元構造と注入された好中球の局在の全体像は、外層から内層までの皮膚のZスタックを3次元ボリュームレンダリングで描写します。タイムラプスイメージングは、好中球が耳の皮膚をサンプリングし、細胞内マトリックスおよび宿主組織と相互作用することを示しました。生体内細胞内顕微鏡を用いて、遊走中の原形質膜の動的リモデリング、前縁での膜突起の形成、細胞後部の後部の収縮を鮮明に可視化します。タイムラプスシーケンスは、細胞内マトリックスとの相互作用の複雑さを明らかにします。細胞膜の局所的なダイナミクスは、細胞表面の下にある100の境界点の同定に基づくアルゴリズムパイプラインを使用して分析されました。局所的な曲率の変化と原形質膜突起によって強調された領域は、境界点ごとに計算され、キモグラフとして各時間枠で報告されました。細胞の前面と背面の両方が、細胞の側面よりも高い曲率を維持します。負の領域変化は、正の領域の変化がより顕著である前縁よりも、セルの後部でより顕著です。イメージング後、組織を採取、固定、染色のために処理することで、目的のターゲットをさらに評価し、メカニズムを解明することができます。膜ダイナミクスを画像化するように設計されたこの手順は、さまざまな細胞タイプやそれぞれの環境で移動する細胞におけるより広範な細胞生物学の問題に対処するように調整できます。

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Research

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生理条件下での細胞内膜リモデリングを調査するためのマウス皮膚における好中球移動のイメージング

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