Name: 膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: 学ぶ質量感受性粒子追跡法による脂質膜上の高分子ダイナミクス解析。iSCATを用いたラベルフリー観察で、オリゴマー状態と拡散係数を定量化し、膜関連システムの生物物理学的理解を深める。

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フィリップ・ククラ、ギャビン・ヤング、Refeynソフトウェアチームからの支援に心から感謝し、画像解析コードの一部を共有することで彼らの支援に感謝します。我々は、商用のRefeyn質量光度計へのアクセスを提供してくれたCryo-EM MPIBコアファシリティに感謝する。F.S.は、ユルゲン・プリツコとヴォルフガング・バウマイスターが与えた支援と資金提供に感謝の意を表します。T.H.とPSは、ドイツ研究財団(DFG)-Project-ID 201269156 - SFB 1032(A09)を通じて資金提供を受けました。N.H.はDFGのリターングラントHU 2462/3-1によって支援されました。PSは、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)とマックスプランク協会の共同資金提供イニシアチブ を通じて 、研究ネットワークMaxSynBioを通じた支援を認めています。

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</ol>

著者には利益相反はありません。

提示されたプロトコルは、ガラスに吸着する単一の生体分子の質量を分析する技術である質量測光法21を、標識されていない膜相互作用生体分子の質量および拡散を同時に測定することができるさらに汎用性の高いツールに拡張する。この分析拡張は、分子24、25の横方向運動に適合した修正バックグラウンド除去戦略の実施によって達成される。一般に、ガラス表面粗さの強い散乱が主な解析障害を表し、各ピクセルの局所背景の正確な決定が粒子の質量と位置の定量化に不可欠であるため、バックグラウンド除去はiSCATベースのアプローチにとって最も重要です。粒子の動きに適応した画像解析に加えて、その後の粒子検出、軌道連結、およびデータ解析は、MPの質量感受性粒子追跡(MSPT)への新規な拡張を完了する。
一般に、徹底的に洗浄されたガラスカバースライドとクリーンな作業環境は、MSPT実験を成功させるための重要な要件です。巨大分子標識がないため、獲得されたシグナルは本質的に非選択的である。したがって、クリーンなサンプルと適切なサンプル処理は、観測値が誤って解釈されないようにするために不可欠です。特に、低分子量の分子が検査される場合、バックグラウンド寄与を評価するために、タンパク質非含有膜の対照測定が承認される(補足図1)。したがって、制御測定を含めることに加えて、各フローチャンバについて 図2 に示す準備手順に従うことをお勧めします。これらの安全対策を組み合わせると、検出された信号が目的の生体分子から発信され、汚染された流れチャンバ、緩衝液、または膜などから発信されないことが保証されます。
実験計画に関する注意事項のほかに、MSPT画像処理の際にも注意が必要です。ビデオ処理中は、正しい結果が得られるように、3 つのパラメータの値を慎重に選択する必要があります: i) 背景除去の中央値ウィンドウの長さ、ii) 粒子検出のしきい値、iii) リンク割り当て時の最大検索半径。より大きな中央値窓(i)は、一般に、重畳された準定数バックグラウンドからの拡散粒子の分離を容易にする。ただし、ウィンドウ サイズが大きすぎると、サンプル ドリフトが最終的に顕著になり、バックグラウンド推定の精度が低下します。最適な設定は、サンプルの特性と測定条件に大きく依存します。それにもかかわらず、値 1,001 を堅牢な開始点として使用できます。閾値パラメータ(ii)は、サンプルで予想される最低分子量に応じて調整する必要があります。0.0005未満の値は、この研究で使用した質量光度計で測定するには推奨されません。分析時間を短縮するために、高分子量のサンプルが予想される場合は、より高い値を選択できます。軌道リンクにおける検索半径(iii)は、粒子のシフト位置が連続するフレーム内で検索される最大半径距離をピクセル単位で指定する。サンプル内の最速のパーティクルに適合させる必要があり、好まれる場合は、代わりに適応検索範囲( trackpyのドキュメントを参照)を使用して計算時間を短縮することができます。特にプロジェクトの初期段階では、得られた結果を検証するために、さまざまなパラメータで映画を再分析することをお勧めします。
MSPTの単一分子の性質に照らして、正確なコントラストおよび質量決定を妨げる可能性があるため、高い膜粒子密度で測定することは避けるべきである。1平方マイクロメートル当たり1粒子未満の密度がMSPT測定に有利であることが示されている24。もう 1 つの考慮事項は、サンプル内の予想される拡散係数です。広範囲の拡散係数に適用可能であるが、MSPTはアクセス可能な拡散係数の下限を有する。中央値ウィンドウ期間のかなりの部分の間に、少数のピクセルの領域への局所的な閉じ込めは、パーティクルを静的背景とマージします。このプロトコルで使用されるイメージング条件では、0.01 μm2/s 未満の拡散係数の測定は推奨されません。この拡散速度では、例えば、中央値窓半値の間の粒子の平均二乗変位は約4ピクセルであり、したがってPSFの範囲と同様のサイズである。その結果、静的バックグラウンド推定値には粒子自体からの信号寄与が含まれる可能性が高く、その結果、最終的にノイズレベルに近づくまで粒子のコントラストが明らかに低下します。しかし、0.05~10μm2/sの範囲の高分子拡散係数は明確に解くことができます。
MSPTアプリケーションの範囲をさらに広げるために、パーティクルで一時的に占有されているピクセルを排除するか、より大きな中央値ウィンドウサイズを可能にするサンプルドリフト補正によって、中央値ベースのバックグラウンドアルゴリズムの進歩を想像することができます。どちらのアプローチも、高い粒子密度と遅い拡散での測定に関する問題を緩和するだろう。低質量感度の面での改善は、50kDa未満の生体分子へのアクセスを提供する可能性のある新世代の質量光度計で地平線上にあります。したがって、将来のMSPT実験では、クッション性二重層や高分子系などのさらに広い範囲の膜模倣物について、単一分子ダイナミクスと膜関連相互作用を研究することができます。

かつては、広範囲の周囲の物理的条件に対する障壁として認識されていただけで、生体膜は今日では機能的実体および触媒プラットフォームと考えられている1,2。膜関連巨大分子反応に応答してシグナルを局在化、増幅、および誘導する能力に基づいて、脂質界面は、膜トラフィッキングおよびシグナル伝達カスケードなどの多種多様な細胞プロセスにとって重要な要素を構成する3、4、5。安定な複合体の集合のための核生成部位として機能する膜付着は、しばしば、膜会合型と細胞質ゾル型の巨大分子との間の動的平衡に依存し、したがって一過性の性質を有する6,7。
生物学におけるそれらの大きな重要性にもかかわらず、膜関連巨大分子反応の組成的、空間的、および時間的不均一性へのアクセスをリアルタイムで提供できる方法を開発することは、これまでのところ困難であった7,8。基礎となる分子プロセスを解明するために、2つの実験的側面が決定的である:十分な時間分解能および単一粒子感度。したがって、フォトブリーチング後の蛍光回復(FRAP)だけでなく、はるかに高感度な蛍光相関分光法(FCS)などのアンサンブル平均技術には、空間情報と時間的情報の大部分が切り離されるため、限界があります9。したがって、個々の分子ダイナミクスの特性評価に向けた重要なステップは、高感度顕微鏡法と組み合わせた単一粒子追跡(SPT)の出現であった。特に、2つのSPTアプローチがこの点で有効であることが証明されています。第一に、蛍光色素を標識として利用し、それに対応する蛍光検出システムを利用することで、ナノメートル精度とミリ秒の時間分解能10,11,12への道が開かれました。第二に、金ナノ粒子を用いた散乱ベースの検出は、それぞれ13、14、15、16のサブナノメートルおよびマイクロ秒範囲への局在化精度および時間分解能の両方を改善した。両方のアプローチの多くの利点と、膜関連系の機構的理解に関するそれらの重要な貢献17,18にもかかわらず、両方の技術は、これまでのところ限定的であった:それらは、潜在的にそれらの本来の挙動を摂動させ、膜関連粒子19,20の分子組成に鈍感である、関心のある分子の標識を必要とする。
これらの制限は両方とも、質量測光(MP)21、22、23と呼ばれる新しい干渉散乱(iSCAT)ベースのアプローチの導入によって最近克服されました。この技術により、ガラス界面に着弾したときのiSCATコントラストに従って生体分子の溶液中質量分布を決定することができます。しかし、脂質膜上に拡散する移動分子の検出と特性評価のためには、より洗練された画像解析アプローチを開発する必要がありました。これは、その間、首尾よく実施されており、脂質界面24、25上に拡散している単一の非標識生体分子の分子質量を検出、追跡、および決定することを可能にする。動的質量測光法または質量感受性粒子追跡(MSPT)と呼ばれるこの技術は、追跡された実体の分子量の変化を直接記録することによって複雑な巨大分子相互作用の評価を可能にし、したがって膜関連分子動力学の機構的分析のための新しい可能性を開く。
ここでは、MSPTに必要なサンプル調製、イメージング、およびデータ分析パイプラインのための詳細なプロトコルが提示される。特に、測定および分析中に発生する可能性のあるサンプル要件および潜在的な問題が議論される。さらに、膜相互作用する高分子系を分析する比類のない可能性は、様々な代表的な結果を通して示されています。

<table><tbody><tr><td>アネキシンV</td><td>、シグマ、アルドリッチ</td> <td>#SRP8026</td><td>、例:膜相互作用タンパク質</td></tr>、<tr><td>バイオ・ラッド、タンパク質アッセイ</td>、<td>バイオ・ラッド、ラボラトリーズ、インク</td><td>#5000006</td><td>タンパク質ストック濃度を決定するためのブラッドフォードアッセイキット</td></tr><tr><td>ビオチン標識ウシ</td>アルブ<td>ミン シグマ・アルドリッチ</td> <td>#A8549</td><td>例 MSPT</td></tr><tr><td>コレラ毒素サブユニットB</td>の標準タンパク質として使用できるタンパク質 <td>シグマ・アルドリッチ</td> <td>#SAE0069</td><td>例 膜相互作用タンパク質</td></tr><tr><td>カバーガラス、#1.5、24 x 24 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>#0102062</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス、#1.5、24 x 60 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>#0102242</td><td></td></tr><tr><td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#850375</td><td>脂質 - 支持脂質二重層形成に必要な押し出し小さなユニラメラ小胞の形で</td></tr><tr><td>ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-キャップ ビオチニル (18:1 Biotinyl Cap PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#870273</td><td>脂質 - 支持脂質二重層形成に必要な押し出した小さな単層小胞</td></tr>の形で <tr><td>ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#840475</td><td>脂質 - 支持された脂質二重層形成に必要な押し出した小さな単層小胞の形で</td></tr><tr><td>ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#840035</td><td>脂質 - 押し出された小さな単層小胞の形で 支持された脂質二重膜形成に必要な</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>TESA</td><td>#57912-00000-02</td><td>ガラスサンプルチャンバーの組み立てに必要な</td></tr><tr><td>押出機</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#610023</td><td>単分散小胞分布を可能にする脂質押出機</td></tr><tr><td>EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td> <td>#A39261</td><td>MSPT</td></tr><tr><td>フィブロネクチン(ビオチン化)</td>の標準タンパク質のビオチン化に使用できるマイレイミド融合ビオチン(<td>Cytoskeleton Inc.)</td><td>#FNR03-A</td><td>例 MSPT</td></tr><tr><td>Gel Filtration HMW Calibration Kit</td><td>Cytiva</td><td>#28403842</td><td>標準タンパク質、例えばビオチン化して分子量標準として使用することができるアルドラーゼ MSPT</td></tr><tr><td>GM1 ガングリオシド (脳、ヒツバシ-ナトリウム塩)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#860065</td><td>脂質 - 支持された脂質二重層形成に必要な押し出した小さな単層小胞の形で</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 二次抗体, Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)</td><td>#31820</td> 分光法のための異なる<td>タンパク質状態の存在を強調するためのタンパク質</td></tr>の例 <tr><td>Isopropanol, 99.5%,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10003643</td><td></td></tr><tr><td>Low Autofluorescence Immersion Oil</td><td>オリンパス(株)</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>pET21a-Streptavidin-Alive</td><td>Addgene</td><td>#20860</td> 二<td>価ストレプトアビジンの発現・精製</td></tr>に必要な <tr><td>pET21a-Streptavidin-Dead</td><td>Addgene</td><td>#20859</td> 二<td>価ストレプトアビジンの発現・精製に必要な</td></tr><tr><td>Pierce Alkaline Phosphatase, Biotinylated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#29339</td><td>例えば、MSPT</td></tr><tr><td>Pierce Protein Aの標準タンパク質として使用できるタンパク質、Biotinylated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#29989</td> MSPT Refeyn Acquire Refeyn Ltd.<td>の標準タンパク質として使用できるタンパク質</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Refeyn OneMP</td></tr><tr><td>Refeyn One</td><td>Refeyn Ltd.</td>の制御ソフトウェア<td>-</td><td>質量光度計</td></tr>滅菌<tr><td>シリンジフィルター0.45 & マイクロ;m セルロースアセテート膜</td><td>VWR International</td><td>#514-0063</td><td>目的のバッファーから粒子をろ過するために必要な</td></tr><tr><td>四価ストレプトアビジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>#SNN1001</td><td>四価ストレプトアビジン いくつかのビオチン結合部位の存在を可能にする</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore 親水性膜, 0.05 & micro;m 細孔径、25 mm Circle</td><td>Cytiva</td><td>#110603</td> MSPT Zepto model 2 プラズマクリーナー Diener electronic GmbH- の<td>文脈で脂質二重層形成をサポートするために、50 nm の細孔径が推奨されます</td></tr><tr><td></td><td></td><td>。</td><td></td></tr></tbody></table>

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

多数の重要な生物学的反応が起こる界面である脂質膜における高分子の短命または一過性の相互作用は、標準的な生物物理学的方法で評価することは本質的に困難である。質量感受性粒子追跡(MSPT)の導入は、そのようなプロセスの徹底的な定量的特性評価に向けた重要なステップを構成する。技術的には、これは干渉散乱顕微鏡(iSCAT)ベースの質量測光法(MP)の出現によって可能になりました。膜関連粒子の2次元運動を明らかにするためにバックグラウンド除去戦略が最適化されると、この技術は、生体膜上の標識されていない巨大分子の拡散および分子質量の両方のリアルタイム分析を可能にする。ここでは、膜関連システムの質量感受性粒子追跡を実行および分析するための詳細なプロトコルが記載されている。市販の質量光度計で実行される測定は、ミリ秒レジームの時間分解能を達成し、MPシステムに応じて、50kDaまでの質量検出限界を達成します。膜触媒巨大分子ダイナミクス全般の詳細な分析のためのMSPTの可能性を示すために、天然の膜相互作用体アネキシンVなどの例示的なタンパク質系について得られた結果が提示される。

このプロトコルは、iSCATベースの画像処理と単粒子追跡アプローチを記述し、脂質膜と相互作用する高分子の分子量と拡散挙動の同時調査を可能にします。サンプル調製、質量コントラスト変換、ムービー取得、および後処理に関するステップバイステップの手順が、潜在的な落とし穴を防ぐための指示とともに提供されます。

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

質量感受性粒子追跡により、脂質膜上で拡散している個々の生体分子を観察し、そのダイナミクスをリアルタイムで定量化することができ、すべて完全に標識されていません。標識が不要なため、生体分子の動的挙動を乱す危険性はありません。この方法のもう1つの利点は、その質量感受性であり、膜結合オリゴマー状態を決定することを可能にする。その汎用性のために、我々は、任意の膜関連システムにこの方法を適用することができます。特に、リガンド誘導性受容体複合体の形成を研究するために使用することができる。まず、PTFEホルダーに同数の顕微鏡スライドを配布します。PTFEホルダーをビーカーに移します。超純水を加え、室温で15分間超音波処理する。ピンセットを使用してホルダーをビーカーに移し、超高純度イソプロパノールを追加します。15分間再び超音波処理し、次いで再びイソプロパノールを超純水と交換し、ホルダーを含むビーカーを15分間超音波処理する。ビーカーからホルダーを取り外し、窒素ガスまたは圧縮空気の安定した流れの下でホルダー内の顕微鏡スライドを吹き飛ばして乾燥させます。大型顕微鏡スライドの入った乾燥ホルダーをプラズマクリーナーに入れ、スイッチを入れます。平らな段ボールをアルミホイルで包みます。洗浄した24ミリメートルを24ミリメートルの顕微鏡スライドで広げ、互いに十分な距離を置いてアルミ箔上にスライドさせる。次に、スライドの上端と下端に両面テープストリップを取り付けます。各顕微鏡スライドをメスで切り取り、アルミホイルから取り外せるようにします。各スライドには、スライドの上端と下端に両面テープのストライプを貼り付ける必要があります。次に、2 枚の両面テープストリップでスライドを親水化スライドに取り付けます。これにより、小さい顕微鏡スライドと大きい顕微鏡スライドの間に流路が形成されます。新しく押し出された小さな単層小胞またはSUVを、必要な反応緩衝液中で1ミリリットル当たり0.4ミリグラムの最終濃度に希釈する。任意選択で、小胞破裂を促進するために、2ミリモルの塩化カルシウムを小胞懸濁液に加える。流量チャンバーを質量光度計ステージに取り付けます。25マイクロリットルのベシクル懸濁液を流チャンバに流し、チャンバを2分間インキュベートし、次いで、毎回200マイクロリットルの反応緩衝液によるフローチャンバの繰り返し洗浄を通して未融合ベシクルを除去する。脂質膜に未融合小胞がなくなったら、50マイクロリットルの目的タンパク質をサンプルチャンバーに加える。次に、視野の大きさ、露光時間、フレームレート、取得時間などの撮影条件を集録ソフトウェアで設定します。フォーカスを自動的に調整します。必要に応じて、横方向制御を使用して、視野を均質な膜のある位置に移動します。プロジェクトフォルダを作成し、ムービーの録画を開始します。録音が完了したら、集録ソフトウェアからプロンプトが表示されるダイアログでファイル名を指定します。ムービーは、その後の解析のためにMPファイルとしてプロジェクトフォルダに自動的に保存されます。録画したビデオを分析するには、Jupyter ノートブック アプリを起動します。表示されるフォルダ リストで、MSPT 分析を行う場所に移動します。ipyノートブックファイルが保存され、ファイルをクリックします。Jupyter ノートブックでは、コードはセルに編成され、段階的に実行できます。セルの横にある小さな再生ボタンをクリックするか、セルを選択してShift Enter キーを押してセルを実行します。まず、分析に必要なすべてのパッケージをインポートします。次のセルを実行して、ファイルプロンプトを起動します。分析する1つまたは複数のMPビデオファイルを含むフォルダを選択し、[フォルダの選択]を押します。選択したファイルのリストがセルの下に印刷されます。ピクセル単位の背景推定アルゴリズムで光の支配的な静的散乱を除去するには、パラメータモードの連続中央値オプションを選択し、スライド中央値ウィンドウに適切な長さを設定します。必要に応じて、背景を削除した後、save_processed_movies True に設定してムービーを保存し、パーティクル検出と軌道リンクに使用します。CPU での処理の場合は並列 True と GPU False を、GPU での処理の場合はその逆を設定してください。パーティクルとそのそれぞれの位置は、ムービー全体で識別され、ローカライズされます。画像の二値化によって候補スポットを強調表示するために使用されるしきい値パラメータを使用して、粒子検出の感度を調整します。スポット検出感度に対するしきい値パラメーターの変化の影響を、ムービー ビジュアライゼーションと呼ばれる別のノートブックで調べます。ipyノートブック。ムービーをフレームビューアにロードしたら、しきい値スライダーを使用して粒子検出しきい値を調整し、適切な設定を見つけます。他のノートブックに戻り、Python パッケージのトラックピーを使用して、連続するフレーム内のパーティクルを軌道にリンクするための 3 つのパラメーターを選択します。予想される最大拡散速度に従って、あるフレームから次のフレームへのパーティクルの最大変位を設定します。パーティクルが消えて再表示されるフレームの最大数を選択しますが、それでも同じパーティクルと見なされます。点が少なすぎる軌道は、拡散係数をよりロバストに決定するために、パラメータminimum_trajectory_lengthを使用して削除できます。セル内のすべてのパラメータを実行して修正します。次のセルを実行して、選択したすべてのビデオを選択したパラメータで分析します。各処理ステップの進行状況バーがセルの下に表示されます。ビデオの長さ、パラメータ設定、ハードウェアによっては、この処理に時間がかかることがあります。次のステップでは、ジャンプ距離分布と平均二乗変位解析の両方に基づいて、前のセクションで見つかった軌道の拡散係数が決定されます。まず、ムービーのframe_rateとpixel_sizeを指定します。セルを実行して修正し、次のセルを実行して、trackpyによって生成されたすべてのCSVファイルを含む親ディレクトリを選択します。見つかったCSVファイルのリストがセルの下に印刷されます。次のセルで、結果が保存されているHDF5コンテナの名前を選択して実行します。最後にセルC.4を実行し、拡散解析を行う。セルC.5では、既知の質量のサンプルを使用して決定された傾きとオフセットを意味する質量較正線パラメータへのコントラストを入力し、それを実行してすべての粒子コントラストを分子量に変換します。セル C.6 を実行して、膜上の見かけの粒子密度を評価し、検出された粒子と各フレーム間の現在の軌跡に関する中央値の値をデータ フレーム内の追加の列として返します。質量係数と拡散係数の相関関係の最終プロットを生成するには、セル D.1 を実行してファイル プロンプトを読み込み、MSPT 結果を含む HDF5 ファイルを指定してから、1 つのビデオからデータ セットを選択してセル D.2 にプロットするか、セル D.3 を実行して複数のビデオのデータを 1 つのデータ フレームに結合します。この例では、すべてのビデオが同じサンプルの複製であるため、データセットはプールされます。最後に、セルD.4を実行して2Dカーネル密度をプロットします。これで問題が解決しない場合は、プロットをセル D.5 の PDF ファイルに保存する場所を指定して実行します。インタクトな支持脂質二重層を有する、支持された脂質二重層の形成中のガラスカバースライドの表面粗さの代表的な画像、およびSLB上で再構成された例示的なタンパク質の代表的な画像がここに示されている。4つの例はすべてネイティブモードで表示され、測定自体の間にアクセスでき、中央値ベースの背景除去後に処理されたレシオメトリック画像として表示されます。コントラストを分子質量に変換する較正は、ビオチン - ストレプトアビジン - ビオチン複合体を介して既知の質量の生体分子をSLBに結合させることによって達成することができる。例示的な戦略として、それ自体が膜中のビオチン含有脂質に結合しているストレプトアビジンに結合するウシ血清アルブミン、プロテインA、アルカリホスファターゼ、およびフィブロネクチンのビオチン化変異体を使用することができる。これらの例示的な巨大分子のますます顕著なコントラストは、それぞれのビオチン化標準物質の分子量の増加を反映している。コントラストヒストグラムの各ピークを標準タンパク質のオリゴマー状態の対応する質量に割り当てることにより、コントラストと質量の線形関係が明らかになり、その後、未知の巨大分子系の解析に使用することができる。ビオチン化アルドラーゼまたはビオチン修飾ヤギ抗ウサギIgG抗体との複合体における4価ストレプトアビジンの質量および拡散係数の両方の2Dカーネル密度推定をここに示す。代表的な画像は、ビオチン修飾アルドラーゼまたはIgGとの4価ストレプトアビジンの複合体について決定されたオリゴマー質量および予想される分子量の比較を示す。MSPTを使用すると、生体分子を脂質膜上で直接追跡し、それらがどの質量を持ち、どのように動き、どのように相互作用するかを決定できます。この技術が、膜上および膜を用いた生物学的プロセスの理解を変えると確信しています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

複数のターゲットトレースは、生きた細胞の細胞膜内で個別に標識分子を追跡するために開発した自家製のアルゴリズムである。効率的に検出するナノ膜のダイナミクスを調べるためにユーザーフレンドリーな、包括的なツールを提供し、高密度で時間をかけて分子を推定し、トレースします。...

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

細胞膜タンパク質と脂質の空間分布と時間ダイナミクスは、生物学におけるホットなトピックです。ここでは、この問題は、概念的には同じ物理量の単一粒子追跡を提供する時空間画像変動解析によって対処されますが、低分子ラベルと標準的な顕微鏡セットアップを使用します。...

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

我々は、高解像度の顕微鏡検査のために雲母支持された脂質二重層を調製する方法を提供する。マイカは、原子スケールで透明で平坦であるが、まれに、取り扱いの困難の撮影で使用されていません。我々の調製マイカシートの偶数堆積をもたらし、二層の調製に使用される材料を減少させる。...

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

ここでは、単一粒子の拡散係数、蛍光顕微鏡で検出する単一粒子の運動とクラスター サイズの種類の定量評価ができる画像解析を追跡するためのプロトコルを提案する.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

3D単分子局在顕微鏡は、生きた細菌細胞における蛍光標識タンパク質の空間位置および運動軌道をプローブするために利用される。本明細書に記載される実験およびデータ分析プロトコルは、プールされた単一分子軌道に基づいてサイトソリックタンパク質の一般的な拡散挙動を決定する。...

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

ここでは、従来の暗視野顕微鏡を用いて、細胞膜上の金ナノロッド(AuNRs)のダイナミクスを監視する方法を示す。単一の AuNR の位置と向きは ImageJ および MATLAB を使用して検出され、AuNRs...

単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化

イメージングによる二乗平均変位(iMSD)解析をマクロピノソームに適用し、構造的および動的特性の観点から、マクロピノソームの固有の時間進化的性質を強調します。次いで、マクロピノソームは、時間不変の平均構造的/動的特性を有する細胞下構造の基準として、インスリン分泌顆粒(ISG)と比較される。...

時空間変動分光法による細胞内ナノ構造のトラッキングの構造と動特性のプロービング

ここでは、単一分子全反射蛍光(smTIRF)顕微鏡を使用して、人工混雑した脂質膜上の単一分子の結合、移動度、および組み立てを実行および分析するためのプロトコルが提示されます。...

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

本記事では、固体支持脂質二重層における単一タンパク質追跡用のサンプル作成方法を詳しく説明します。また、単一分子感度と高速フレームレートを持つシンプルな蛍光顕微鏡の説明もします。最後に、単一タンパク質の軌跡抽出手順を概説します。...

蛍光顕微鏡を用いた脂質二重層中の単一タンパク質の追跡

学ぶ質量感受性粒子追跡法による脂質膜上の高分子ダイナミクス解析。iSCATを用いたラベルフリー観察で、オリゴマー状態と拡散係数を定量化し、膜関連システムの生物物理学的理解を深める。

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

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