敗血症の盲腸結紮および穿刺誘発マウスモデルにおける信頼性の高いバイオマーカーの評価
2022年12月9日
このプロトコルは、敗血症のマウスモデルにおける盲腸結紮および穿刺(CLP)の手術の詳細を提示します。CLPは、敗血症の動物モデルを作成するために最も広く使用されている技術の1つです。したがって、信頼性の高い研究結果を得るためには、標準化されたCLPプロトコルが必要です。
この研究の主な目的は、盲腸結紮と穿刺誘発性敗血症のマウスモデルを使用して、敗血症の信頼できる血液バイオマーカーを評価することです。盲腸結紮および穿刺、または略してCLPは、敗血症の臨床的に関連するモデルです。CLPは敗血症研究で一般的に使用されるモデルです。
シトルリン化ヒストンH3、またはCitH3は、敗血症誘発性NETosisに由来します。私たちの以前の研究は、CitH3が敗血症の信頼できる診断バイオマーカーであることを示しています。雄のC57BL/6マウスを選択します。
マウスの体重を測定し、1.5%イソフルランを吸入してマウスを麻酔する。マウスを加熱パッドに固定します。脱毛クリームを腹部に塗り、クリームと髪を取り除く前に1分以内放置します。
げっ歯類の動物の手術に適した滅菌手術器具を準備します。腹部の皮膚をヨウ素で少なくとも3回消毒します。手術部位を適切な滅菌手術用カーテンで覆います。
滅菌手術用ハサミを使用して、リネアアルバに沿って腹壁を約2センチ切開します。滅菌ピンセットで腹腔から盲腸を識別して隔離します。盲腸の75巻を4-0絹縫合糸で結睭化する。
腸間膜血管を結紮しないでください。盲腸結紮の割合が異なると、敗血症の重症度が決まります。25%は低悪性度敗血症につながり、50%は中性度敗血症につながり、75%は高悪性度敗血症につながります。
尾端と結紮の中間点に21ゲージの針を使用して、盲腸を1回の貫通穿孔で穿刺します。浸透穴を通して盲腸から糞便をそっと絞り出します。なお、糞便も敗血症の重症度を決定するので、腹腔に押し込まれる糞便の量は一貫していなければならない。
盲腸と糞便を腹腔内にやさしく交換します。腹筋層と皮膚層を6-0シルク縫合糸で閉じます。切開部をヨウ素で消毒します。
ケトプロフェンの注射、キログラムあたり5ミリグラムは、盲腸を避けるために腹部の左下の象限で実行する必要があります。完全に回復するまでマウスを加熱パッドに置きます。マウスは温度管理された部屋に収容され、食物と水に自由にアクセスできます。
動物は、敗血症の症状を伴う二酸化炭素の過剰摂取によって安楽死させられます、提示された私たちの研究に基づいて私たちの事前定義されたエンドポイントに関連しています。マウスは、偽群、CLP群、およびCLPプラスCl-アミジンまたはYW3-56処置群に無作為に分けられる。偽群のマウスは、盲腸結紮と穿刺を除くすべてのCLP手順を受けます。
術後24時間で末梢血を採取し、遠心分離により血清を調製する。CitH3濃度は、ウェスタンブロッティングおよび自社開発のELISAキットにより測定した。図2に示すように、偽群ではCitH3は検出されなかった。
CitH3レベルはCLP挿入後に上昇し、PAD阻害によって有意に減弱した。我々のデータに基づいて、循環CitH3は敗血症の信頼できる診断バイオマーカーであると結論付けました。
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概要
本プロトコルでは、敗血症のマウスモデルにおける盲腸結紮穿刺（CLP）の操作詳細について説明します。CLPは敗血症の動物モデルを作成するために最も広く用いられている手法の一つであり、信頼性の高い研究結果を得るためには標準化されたプロトコルが必要です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 敗血症研究
背景
- 盲腸結紮穿刺（CLP）は、臨床的に関連性の高い敗血症モデルです。
- CLPは敗血症の研究で一般的に用いられています。
- 敗血症の診断には、信頼性の高いバイオマーカーが不可欠です。
- シトルリン化ヒストンH3（CitH3）は、敗血症誘発性のNETosisに関連しています。
研究の目的
- マウスモデルを用いて、敗血症の信頼性の高い血液バイオマーカーを評価する。
- 研究の整合性を確保するため、標準化されたCLPプロトコルを確立する。
- 敗血症におけるCitH3の診断能を調査する。
使用した手法
- 研究に使用する雄性C57BL/6マウスの選定。
- 盲腸結紮穿刺による敗血症の誘発。
- 誘発後の血液バイオマーカーの評価。
- 診断の信頼性を評価するためのCitH3レベルの比較。
主な結果
- 信頼性の高い診断バイオマーカーとしてのCitH3の実証。
- 一貫した結果をもたらす標準化されたCLPプロトコル。
- モデルにおける敗血症誘発性NETosisの同定。
- 今後の敗血症研究に向けたマウスモデルの検証。
結論
- CLPモデルは敗血症の研究に有効である。
- CitH3は敗血症診断の有望なバイオマーカーとなる。
- 標準化されたプロトコルは研究の信頼性を高める。
よくある質問
産業上の重要性
信頼性の高い早期バイオマーカーは、敗血症治療薬探索におけるリスクを低減し、前臨床モデルから臨床研究へのトランスレーショナルな連続性を確保するために不可欠です。定量的なCitH3測定を組み合わせたCLP誘発マウスモデルは、敗血症におけるターゲット検証およびメカニズム解析のための標準化されたプラットフォームを提供します。このアプローチは、創薬パイプラインの重要な転換点における予測の信頼性とポートフォリオの優先順位付けを支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 臨床的に関連のある動物モデルを用いて、敗血症の病態生理に関する厳格な仮説検証を可能にします。
- NETosisのメカニズム上のバイオマーカーとしてCitH3を定量化することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
- 生物学的なリスク低減を行い、さらなる開発に向けた候補ターゲットの優先順位付けを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 敗血症のメカニズムを標的とする候補治療薬を評価するための、再現可能なシステムを提供します。
- 検証済みのELISAおよびCitH3のウェスタンブロットアッセイを通じて、バイオマーカーの定量化を標準化します。
- 実験群間における介入効果の信頼性の高い比較を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 敗血症における前臨床バイオマーカーのリードアウトを、臨床診断上のニーズと整合させます。
- 動物モデルでの知見からヒトへのトランスレーショナルなバイオマーカー戦略への継続性をサポートします。
- 堅牢で疾患に関連したエンドポイントを確立することで、トランスレーショナルリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルおよびバイオマーカーのワークフローは、敗血症研究における初期探索、リード化合物の同定、および前臨床検証を繋ぐものです。
- 探索生物学：敗血症誘発性NETosisにおける機序的仮説の検証およびパスウェイの解明を可能にします。
- スクリーニング：標準化されたアッセイ開発および化合物評価のための定量的なCitH3読み取り値を提供します。
- 分析：介入の有効性と疾患の重症度を比較するための再現可能なバイオマーカー測定を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床バイオマーカーデータと臨床診断戦略との整合性を促進します。
- 組織的な再利用：継続的な敗血症研究および治療評価のための、再利用可能な標準化プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：敗血症のターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値：研究チームや研究間での再現性と標準化を向上させる。
- 戦略的価値：早期のバイオマーカー駆動型トリアージを可能にすることで、go/no-go判断および資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の敗血症プログラムの優先順位付けと推進をサポートする。
実施上の検討事項
- 動物手術、バイオマーカーアッセイの開発、および定量分析に関する専門知識が必要です。
- バリデーション済みのELISAキット、ウェスタンブロッティングの設備、および標準化された動物飼育施設へのアクセスが必要です。
- CLP手順の変数およびバイオマーカー測定プロトコルの、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- 他の疾患モデルや種に適用する場合、プロトコルの最適化およびバリデーションが必要になる場合があります。
- 制限事項として、手術手技によるモデルの個体差や、一貫したエンドポイント基準の必要性が挙げられます。
