Name: 敗血症の盲腸結紮および穿刺誘発マウスモデルにおける信頼性の高いバイオマーカーの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 学ぶ敗血症マウスモデルにおける信頼性の高いバイオマーカー評価法。C57BL/6マウスを用いた盲腸結紮穿刺法（CLP）でCitH3を測定し、敗血症診断の新たな指標としての可能性を探索する標準化プロトコルを解説します。

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実験に協力してくださったWang Wei教授とLiu Shuai博士に感謝します。この研究は、中南大学襄雅病院の若手研究資金(No.2019Q10)、湖南省国家科学基金会(No.2020JJ4902)、および中国国家自然科学基金会(No.82202394)からの助成金によって資金提供されました。

すべての動物実験は、襄雅病院および中南大学の動物審査委員会(第202103149号)によって承認されたガイドラインに従って実施されました。
1. 事前準備
<ol><li>雄のC57BL / 6Jマウス(体重:20〜25 g、年齢:8〜12週)を選択し、手順を実行する前に3日間ハウスします。</li>
	<li>マウスの重量を量ります。</li>
	<li>マウスを1.5%イソフルランで吸入麻酔し、つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。</li>
	<li>マウスを加熱パッドに固定します。脱毛クリームを腹部に塗り、クリームと髪を取り除く前に1分以内放置します。 注:手術中は、麻酔をかけたマウスの下に温かいパッドを置くことで、正常な体温を維持する必要があります。</li>
</ol>2. 運用
<ol><li>げっ歯類の動物の手術に適した滅菌手術器具を準備します。無菌状態を確保するために、滅菌手袋、フェイスマスク、手術用ガウンを着用してください。</li>
	<li>腹部の皮膚をヨウ素ワイプで少なくとも3回消毒します。手術部位を滅菌手術用ドレープで覆います。</li>
	<li>滅菌手術用ハサミを使用して、リネアアルバに沿って腹壁を約2cm切開します。 注意: 臓器を傷つけないでください。</li>
	<li>滅菌ピンセットで腹腔から盲腸を識別して隔離します。</li>
	<li>盲腸の体積の75%を4-0の絹縫合糸で結睭化する。腸間膜血管を結紮しないでください。 注:結紮された盲腸の割合は、敗血症の重症度を決定します。</li>
	<li>尾端と結紮セットの中間点に21 Gの針(片側から盲腸壁を通って反対側まで)で1つの貫通穿孔(2つの穴)を作成して盲腸を穿刺します。</li>
	<li>針を捨てます。浸透孔を通して盲腸から小滴の糞をそっと絞ります。 注:腹腔に押し込まれる糞便の量は、敗血症の重症度も決定するため、一貫している必要があります。偽マウスの場合は、手順2.5〜2.7をスキップする必要があります。</li>
	<li>盲腸を腹腔内にそっと入れ替えます。</li>
	<li>6-0シルク縫合糸で腹筋と皮膚を別々に閉じます。</li>
	<li>切開部をヨウ素で消毒します。</li>
	<li>盲腸を避けるために、腹部の左下象限にケトプロフェン(5 mg / kg)を注射します。麻酔薬から完全に回復するまで、マウスを温かいパッドの上に置きます。</li>
	<li>温度管理された部屋(22°C)のケージにマウスを置き、餌と水に自由にアクセスできるようにします。術後最初の1週間は6時間ごとにマウスを確認してください。<ol><li>敗血症の症状が事前に定義されたエンドポイントを満たしている場合は、二酸化炭素の過剰摂取によってマウスを安楽死させます。</li>
	</ol></li>
</ol>3.治療
<ol><li>マウスを無作為に偽群、CLP群、CLP+YW3-56群(図2a)、CLP+Cl-アミジン群(図1)に分けます。 注: 偽グループは、CLP を除く CLP グループと同じ手順を実行しました。YW3-56(5 mg / kg)またはCl-アミジン(40 mg / kg)は、筋肉と皮膚層を縫合するときに、ステップ2.9の1時間後に腹腔注射 で 投与されました。</li>
	<li>サンプル収穫<ol><li>手術後15 24時間で球後神経叢から末梢血を採取する。</li>
	</ol></li>
	<li>遠心分離(1,000 x g、5分)で血清を調製し、使用するまで-80°Cで保存します。</li>
	<li>前述の13の間接サンドイッチELISAキットを用いてCitH3濃度を測定する。<ol><li>抗CitH3モノクローナル抗体を96ウェルプレートにコーティングして、CitH3タンパク質を捕捉します。</li>
		<li>血清をDNase I(150ユニット/mL、37°で1時間)で処理し、ウェル(20 μL、室温)でインキュベートします。</li>
		<li>抗CitH3ポリクローナル抗体(0.33 μg/mL、100 μL、2時間)を加えて、捕捉されたCitH3タンパク質を検出します。</li>
		<li>抗ウサギペルオキシダーゼ標識二次抗体(0.02 μg/mL、100 μl、1時間)をウェルでインキュベートします。</li>
		<li>十分に洗浄した後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(100 μL、20分)でウェルを開発します。 注:ELISAキットのプロトコルの詳細は、以前の出版物13に記載されています。</li>
	</ol></li>
	<li>統計解析<ol><li>一元配置分散分析を実行して3つのグループ間の差を分析し、続いて多重比較のためのボンフェローニ事後検定を実行します。統計ソフトウェアを使用して分析を実行します。0.05以下の p 値は有意であると考えられた。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+international+consensus+definitions+for+sepsis+and+septic+shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Shankar-Hari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+new+definition+and+assessing+new+clinical+criteria+for+septic+shock%3A+For+the+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).</li>
<li>Fleischmann-Struzek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+mortality+of+hospital-+and+ICU-treated+sepsis%3A+results+from+an+updated+and+expanded+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis.</a> Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).</li>
<li>Evans, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+sepsis+campaign%3A+international+guidelines+for+management+of+sepsis+and+septic+shock+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021.</a> Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).</li>
<li>Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effectiveness+of+interventions+to+reduce+peripheral+blood+culture+contamination+in+acute+care%3A+a+systematic+review+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol.</a> Systematic Reviews. 7 (1), 216(2018).</li>
<li>Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+sepsis+in+critical+care%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).</li>
<li>Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%3A+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).</li>
<li>Hotchkiss, R., Karl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+and+treatment+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology and treatment of sepsis.</a> The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).</li>
<li>Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+peptidylarginine+deiminase+reduces+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+tissue+injury+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+peptidylarginine+deiminase+alleviates+LPS-induced+pulmonary+dysfunction+and+improves+survival+in+a+mouse+model+of+lethal+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia.</a> European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullinated+histone+H3+as+a+therapeutic+target+for+endotoxic+shock+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2957(2019).</li>
<li>Li, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+citrullinated+histone+H3+as+a+potential+serum+protein+biomarker+in+a+lethal+model+of+lipopolysaccharide-induced+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock.</a> Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CitH3%3A+a+reliable+blood+biomarker+for+diagnosis+and+treatment+of+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8972(2017).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+plasmo-photoelectronic+nanostructure+biosensor+detects+an+infection+biomarker+accompanying+cell+death+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils.</a> Small. 16 (1), 1905611(2020).</li>
<li>Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+various+methods+of+blood+sampling+in+mice+and+rats%3A+Effects+on+animal+welfare%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare.</a> Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).</li>
<li>Brook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+mouse+model+for+neonatal+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58574(2019).</li>
<li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).</li>
<li>Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+factors+affecting+mortality+rate+after+sepsis+in+a+murine+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model.</a> Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

CLPは病原体を腹部に導入して敗血症の前臨床モデルを作成します。CLPを実施する際には、外因性細菌の干渉を排除し、麻酔薬の正確な投与量を使用するために無菌条件を使用することが重要です16。敗血症モデルの重症度と再現性に影響を与えるCLPの3つの技術的側面は、結紮された盲腸の割合、盲腸穿刺に使用される針のサイズ、および腹腔内に押し込まれた糞便の量です。盲腸の約75%の結紮は重度の敗血症をもたらし、50%の結紮は中等度の敗血症をもたらし、25%以下の結紮は軽度の敗血症をもたらす17。穿刺回数と針のサイズによって死亡率18が決まり、スルーアンドスルー穿刺によって最良の結果が得られます。少量(液滴)の糞便は細菌性腹膜炎を引き起こすのに十分であり、糞便を絞り出すときは注意が必要です。CLPは、経験豊富な個人が実行した場合、約10分かかります。
この研究に記載されているCLP誘発敗血症のマウスモデルには、いくつかの制限があります。第一に、マウスは末梢血...

敗血症は、感染に対する調節不全の宿主反応によって引き起こされる生命を脅かす臓器機能障害として定義され1、敗血症性ショックは敗血症の重症例の主要な死因です2。敗血症と敗血症性ショックは、毎年世界中で何百万人もの死者を出しています3。敗血症患者の転帰を改善するための鍵は、抗生物質などの治療の迅速な開始です4。敗血症の診断のためのゴールドスタンダードの方法は微生物培養です。しかし、微生物培養は時間がかかり、偽陽性および偽陰性の結果につながる可能性があり、臨床的意義が大幅に制限されます5。従って、敗血症の血液バイオマーカーを同定することが極めて望ましい。プロカルシトニンは理想的な敗血症バイオマーカーとして認識されていますが、敗血症と無菌性疾患を区別できないため、診断効果は限られています6。 
マウス盲腸結紮および穿刺(CLP)は、科学研究における敗血症のモデルを作成するために一般的に使用されます。CLPは、多微生物性腹膜炎を模倣し、炎症誘発性免疫応答と抗炎症性免疫応答の両方を活性化するため、最も広く使用されている敗血症モデルの1つです7。CLPは、細菌性エンドトキシンの注射などの代替技術よりも臨床的に関連性のある敗血症モデルを作成することは広く受け入れられています。したがって、CLPは、研究8で使用するための古典的な敗血症モデルと見なされます。ただし、CLPの主な欠点は、モデルの重症度が盲腸結紮の割合、針のサイズ、穿刺回数、開腹術などのいくつかの要因によって影響を受けるため、再現性です。したがって、CLP誘発敗血症モデルを標準化する必要がある。本研究では、CLP誘発敗血症モデルのプロトコルの詳細を説明し、標準化された手順を示し、その再現性を高めます。
炎症反応は敗血症の初期段階で起こり、好中球は臓器損傷を引き起こす過剰な量の酸化剤とプロテアーゼを放出します8。敗血症の病態生理における重要な要因は、DNA、シトルリン化ヒストン、抗菌プロテイナーゼなどの核および細胞質成分を放出する好中球細胞外トラップ(NET)の形成です9。最近の研究では、NETの過剰な生成が敗血症の病理を媒介することが示唆されています。一方、YW3-56やCl-アミジンなどの化学物質によるペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)の酵素的阻害によるNETの減少は、敗血症のマウスモデルで生存促進効果を発揮します10,11。シトルリン化ヒストンH3(CitH3)は2011年に敗血症特異的タンパク質として同定され12、その後の出版物は、循環CitH3濃度が敗血症の信頼できる診断バイオマーカーであることを実証している13,14。CitH3は、プロカルシトニンよりも感度が高く、長持ちするバイオマーカーと考えられており、炎症性サイトカインよりも敗血症の区別においてより特異的です13。
この研究では、敗血症のCLP誘発マウスモデルにおける敗血症の信頼できる診断バイオマーカーを評価しました。

<table><tbody><tr><td>21G針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン&nbsp;</td><td>R&D Systems Inc</td><td>DY999</td><td></td></tr><tr><td>抗CitH3モノクローナル抗体</td><td>研究所 自己開発</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CitH3ポリクローナル抗体</td><td>アブカム</td><td>ab5103</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>中央南大学</td><td></td><td></td>香雅医科大学</tr><tr><td>Cl-アミジン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>SML2250</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドナーゼI</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>ケトプロフェン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>PHR1375</td><td></td></tr><tr><td>シルク縫合糸 (4-0 & 6-0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術器具&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>YW3-56</td><td>GLPBIO</td><td>GC48263</td><td></td></tr></tbody></table>

敗血症の盲腸結紮および穿刺誘発マウスモデルにおける信頼性の高いバイオマーカーの評価

Evaluation of a Reliable Biomarker in a Cecal Ligation and Puncture-Induced Mouse Model of Sepsis

敗血症は、生命を脅かし、急速に発症する深刻な病気であり、世界中で毎年数百万人が死亡しています。研究者は、さまざまな動物モデルを使用して敗血症の病態生理学を解明するために多大な努力を払ってきました。盲腸結紮および穿刺(CLP)によって誘発される敗血症のマウスモデルは、実験室で広く使用されています。CLPモデルの重症度と再現性に影響を与える3つの技術的側面は、盲腸結紮の割合、盲腸穿刺に使用される針のサイズ、および腹腔内に押し込まれた糞便の量です。敗血症の迅速かつ具体的な診断は、結果に影響を与える重要な要素です。敗血症診断のゴールドスタンダードは微生物培養です。ただし、このプロセスは時間がかかり、場合によっては不正確です。敗血症特異的バイオマーカーの検出は高速ですが、既存のバイオマーカーは、半減期が短く、非特異性があり、感度が不十分なため、不十分です。したがって、初期段階での敗血症の信頼できるバイオマーカーが緊急に必要とされています。以前の出版物は、過剰な好中球細胞外トラップ(NET)が敗血症で発生することを示唆しています。NET成分としてのシトルリン化ヒストンH3(CitH3)は、敗血症動物と患者の両方で上昇しており、CitH3の存在は敗血症の信頼できる診断バイオマーカーです。本研究は、CLP誘発敗血症の標準化されたマウスモデルを記述し、敗血症の信頼できる血液バイオマーカーを確立することを目的とした。私たちの研究は、将来的に敗血症の早期かつ正確な診断に貢献する可能性があります。

図2Aに示すように、ウエスタンブロッティングにより偽群ではCitH3は検出されなかった。血清CitH3濃度はCLP後に有意に上昇し,この増加はPAD阻害剤であるYW3-56の投与によるNET形成の阻害によって阻止された10.図2Bは、ELISA法により測定した血清CitH3濃度を示す。CLP後24時間で、偽群と比較してCLP群でCitH3の血清濃度が増加し(p=0.0008)、このCitH3の増加は、NET形成を制限するPAD阻害剤であるCl-アミジンによって有意に減弱した(p=0.0028)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63584/63584fig01.jpg"> <strong ...

このプロトコルは、敗血症のマウスモデルにおける盲腸結紮および穿刺(CLP)の手術の詳細を提示します。CLPは、敗血症の動物モデルを作成するために最も広く使用されている技術の1つです。したがって、信頼性の高い研究結果を得るためには、標準化されたCLPプロトコルが必要です。

Sepsis is a severe life-threatening and rapidly developing disease that causes millions of deaths annually worldwide. Researchers have made tremendous ...

この研究の主な目的は、盲腸結紮と穿刺誘発性敗血症のマウスモデルを使用して、敗血症の信頼できる血液バイオマーカーを評価することです。盲腸結紮および穿刺、または略してCLPは、敗血症の臨床的に関連するモデルです。CLPは敗血症研究で一般的に使用されるモデルです。シトルリン化ヒストンH3、またはCitH3は、敗血症誘発性NETosisに由来します。私たちの以前の研究は、CitH3が敗血症の信頼できる診断バイオマーカーであることを示しています。雄のC57BL/6マウスを選択します。マウスの体重を測定し、1.5%イソフルランを吸入してマウスを麻酔する。マウスを加熱パッドに固定します。脱毛クリームを腹部に塗り、クリームと髪を取り除く前に1分以内放置します。げっ歯類の動物の手術に適した滅菌手術器具を準備します。腹部の皮膚をヨウ素で少なくとも3回消毒します。手術部位を適切な滅菌手術用カーテンで覆います。滅菌手術用ハサミを使用して、リネアアルバに沿って腹壁を約2センチ切開します。滅菌ピンセットで腹腔から盲腸を識別して隔離します。盲腸の75巻を4-0絹縫合糸で結睭化する。腸間膜血管を結紮しないでください。盲腸結紮の割合が異なると、敗血症の重症度が決まります。25%は低悪性度敗血症につながり、50%は中性度敗血症につながり、75%は高悪性度敗血症につながります。尾端と結紮の中間点に21ゲージの針を使用して、盲腸を1回の貫通穿孔で穿刺します。浸透穴を通して盲腸から糞便をそっと絞り出します。なお、糞便も敗血症の重症度を決定するので、腹腔に押し込まれる糞便の量は一貫していなければならない。盲腸と糞便を腹腔内にやさしく交換します。腹筋層と皮膚層を6-0シルク縫合糸で閉じます。切開部をヨウ素で消毒します。ケトプロフェンの注射、キログラムあたり5ミリグラムは、盲腸を避けるために腹部の左下の象限で実行する必要があります。完全に回復するまでマウスを加熱パッドに置きます。マウスは温度管理された部屋に収容され、食物と水に自由にアクセスできます。動物は、敗血症の症状を伴う二酸化炭素の過剰摂取によって安楽死させられます、提示された私たちの研究に基づいて私たちの事前定義されたエンドポイントに関連しています。マウスは、偽群、CLP群、およびCLPプラスCl-アミジンまたはYW3-56処置群に無作為に分けられる。偽群のマウスは、盲腸結紮と穿刺を除くすべてのCLP手順を受けます。術後24時間で末梢血を採取し、遠心分離により血清を調製する。CitH3濃度は、ウェスタンブロッティングおよび自社開発のELISAキットにより測定した。図2に示すように、偽群ではCitH3は検出されなかった。CitH3レベルはCLP挿入後に上昇し、PAD阻害によって有意に減弱した。我々のデータに基づいて、循環CitH3は敗血症の信頼できる診断バイオマーカーであると結論付けました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

人間の敗血症の研究のための貴重なツールとして、盲腸結紮穿刺のマウスモデル。...

盲腸結紮穿刺手順

敗血症は、細菌感染に起因する全身性炎症反応症候群を指し、盲腸結紮穿刺（CLP）と呼ばれる手術法によってシミュレートすることができます。ここでは、治療薬のために薬草をスクリーニングするためのCLP-誘導動物モデルを使用する方法を説明します。...

新しいハーブ治療法を評価するために敗血症の動物モデルの使用

実験的敗血症は盲腸結紮穿刺（CLP）の方法を用いて、マウスにおいて誘発することができる。 CLP誘発性敗血症の文脈においてインビボでオートファジーを評価するための現在のプロトコルがここに提示されている：（GFP）-LC3マウスを用いたオートファジーを測定するためのプロトコル、および電子顕微鏡法によってオートファゴソームの形成を測定するためのプロトコル。...

マウスにおけるオートファジーを研究するためのモデルとして、盲腸結紮穿刺誘発性敗血症

このプロトコルは、長期にわたる重篤な疾患の中枢カテーテルマウスモデルを記述しています。敗血症を誘発するための盲腸結紮法と穿刺法を組み合わせ、体液、薬物、栄養投与のための中心静脈ラインを使用して、人間の臨床環境を模倣します。...

重大な病気のマウスモデルにおける流体、医薬品や栄養管理のための中心静脈ラインの使用

このプロトコルは、必要な手順を確立し、7...

新生児モデル敗血症マウスの制御モデル

このプロトコルは、免疫抑制状態の二次病院後天性感染症の根底にある感染結果を測定する技術を説明し、まず、セカルライゲーション/穿刺マウスを確立し、鼻腔内感染に挑戦して、免疫抑制敗血症の臨床的に関連するモデルを作成します。...

敗血症誘発免疫抑制のセカルライゲーションと穿刺および鼻腔感染の二重モデルの設計

ここでは、独自に設計された加温/抑制装置を用いたげっ歯類の尾静脈注射に対する効果的かつ効率的な方法を提示します。血管拡張の開始を合理化し、プロセスを抑制することによって、このプロトコルは、最小限の苦痛を伴う動物の大規模なグループの正確かつタイムリーな静脈注射を可能にする。...

マウス真菌敗血症モデルにおける効率的な尾静脈注射のための現代的な温暖化/抑制装置

ここでは、ラットにおける再現可能な集中治療室指向エンドトキシンモデルを提示する。...

ラットにおける再現可能な集中治療ユニット指向エンドトキシンモデル

このプロトコールは、マウスモデル系におけるグラム陰性単細菌敗血症の誘導を記載する。このモデルは、敗血症中の炎症性および致死性の宿主応答を調査するのに有用である。...

マウスにおける サルモネラ ・チフス菌誘発性敗血症性腹膜炎の特性評価

コロンはステント性腹膜炎Ascendens（CASP）げっ歯類における複数菌腹部敗血症のための高度に標準化されたモデルです。この記事では、CASPの外科的手順を説明します。...

コロンは（CASP）腹膜炎ステントAscendens - 複数菌腹部敗血症のための標準モデルを

学ぶ敗血症マウスモデルにおける信頼性の高いバイオマーカー評価法。C57BL/6マウスを用いた盲腸結紮穿刺法（CLP）でCitH3を測定し、敗血症診断の新たな指標としての可能性を探索する標準化プロトコルを解説します。

敗血症の盲腸結紮および穿刺誘発マウスモデルにおける信頼性の高いバイオマーカーの評価

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