Name: 涙腺幹細胞のための3次元、無血清培養システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶ涙腺幹細胞の3次元無血清培養法。BALB/cマウスから細胞を分離し、長期増殖と腺房・管状細胞への分化を実現。涙腺再生医療と組織修復研究に応用可能な革新的プロトコルです。

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この研究は、中国国家自然科学財団(第31871413号)と広東省科学技術の2つのプログラム(2017B020230002と2016B030231001)からの助成金によって支援されました。研究中に私たちを助けてくれた研究者と、動物ケアのサポートのために動物センターで働くスタッフに本当に感謝しています。

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。

涙腺幹細胞培養およびLG傷害修復のための涙腺幹細胞の単離および体外培養のための十分に確立された方法がある。Shatos et al.17 および Ackermannet al.6ラット及びマウスの涙道幹細胞をそれぞれ2D培養法により培養及び継代培養することに成功し、ADDの治療のために涙道幹細胞を移植することが可能となった。2Dで培養されたLGsの幹細胞18および間葉系幹細胞19,20に関する研究は、これらの細胞の移植がADDの症状をある程度緩和できることを示した。蛍光活性化細胞選別による、Gromovaら。マウスLGsからLG前駆細胞マーカーを発現する幹細胞を2個選択し、インビトロでダクトやアシニに分化させ、成体幹細胞のLGsの機能細胞への分化に成功しました。...

涙腺幹細胞(LGSC)は、涙腺(LG)細胞の再生を維持し、腺房および乳管細胞の供給源である。したがって、LGSC移植は、重篤な炎症性損傷および水性欠損ドライアイ疾患(ADDED)1、2、3を治療するための代替的アプローチと考えられている。Tiwariらは、コラーゲンIおよびいくつかの成長因子を添加したマトリックスゲルを用いて初代LG細胞を分離および 培養した。しかしながら、LG細胞を連続的に培養することができなかった4。二次元(2D)培養を用いて、マウスLG由来幹細胞を、Youら5 およびAckermannらによって単離した。図6から、幹/前駆細胞マーカー遺伝子、 Oct4、 Sox2、 Nanog、および ネスチンを発現することが見出され、継代培養することができた。しかしながら、これらの細胞が腺房細胞や乳管細胞に分化しうるという明確な兆候はなく、 生体内での分化能を検証する移植実験もない。
最近、c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45-細胞をフローサイトメトリーによりマウスLGから単離し、Pax6やRunx1などのLG前駆細胞マーカーを発現することが判明し、インビトロでダクトやアチーニに分化した。ADDのマウスでは、これらの細胞による同所性注射は、損傷したLGを修復し、LGs2の分泌機能を回復させることができる。しかしながら、この方法により単離された幹細胞の数は少なく、単離されたLGSCsを増殖させるのに好適な培養条件はなかった。要約すると、ADDEDの治療におけるLGSCsの研究のために、安定的かつ継続的な拡大を伴う成人LGSCを効果的に単離および培養するために、適切な培養システムを確立する必要がある。
幹細胞または多能性幹細胞に由来するオルガノイドは、関連する器官に組織学的に類似しており、それら自身の再生を維持することができる細胞群である。2009年に佐藤らによってマウス腸オルガノイドの培養に成功した後7、佐藤の培養系に基づいて他の臓器由来のオルガノイドを連続して培養し、例えば胆嚢8、肝臓9、膵臓10、胃11、乳房12、肺13、前立腺14、及び唾液腺15.オルガノイド培養における細胞分化前の成体幹細胞の割合が高いため、三次元(3D)オルガノイド培養法はLGの成体幹細胞の単離および培養に最適と考えられる。
本研究では、3D無血清培養法を最適化することにより、成体マウスLGSC培養系を確立した。正常マウスとADDマウスの両方から培養したLGSCsは、自己複製および増殖の安定した能力を示したことが証明されている。ADDマウスLGsへの移植後、LGSCsは障害のあるLGsに定着し、涙液産生を改善した。また、ROSA26mT/mG マウスから赤色蛍光LGSCsを単離し、培養した。この研究は、イン ビトロでの LGSC濃縮およびADD療法の臨床応用におけるLGSC自家移植片の信頼できる参照を提供する。

<table><tbody><tr><td>動物(マウス)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>南京大学</td><td></td><td></td>モデル動物研究センター</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>中山大学</td><td></td><td></td>実験動物センター</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>南京大学</td><td></td><td></td>モデル動物研究センター</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>南京大学</td><td></td><td></td>モデル動物研究センター</tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>ザルトリウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動脱水機</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血液計数チャンバー</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2恒温インキュベータ</td>ー <td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECLゲルイメージングシステム</td><td>GEヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴用電気浴</td><td>Yiheng Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動装置</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光定量PCR装置</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凍結組織スライサー</td><td>レシア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>横型遠心分離機</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立型蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザーラメラ走査型顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素容器</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低温 高温速度遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペッター</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>パナソニック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ 紫外線分光光度計</td><td>サーモ</td><td>測定 RNA濃度</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンスライシングマシン</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCRアンプ</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH値テスター</td><td>ザルトリウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C冷却装置</td><td>ハイアール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のサーモスタットの文化の発振器</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ パラフィンの包埋器</td><td>械Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg;C 超低温冷蔵庫</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&deg;C 超低温冷凍機</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超純水製造装置</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>動物実験</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Σ</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタール ナトリウム Σ</td><td></td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Matrix gel)</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>マウス Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>マウス Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>マウス EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤 (TI)</td><td><</td>em>Glycine max; から得られる Sigma <td>T6522</td> トリ<td>プシン、キモトリプシン、およびプラスミナーゼをより少ない程度で阻害できます。1 mgは1.0〜3.0 mgのトリプシンを阻害します。.</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>HE染色 &免疫染色</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488ロバ抗マウスIgG</td><td>サーモ</td><td>A-21202</td><td>使用希釈:IHC)2 &mu;g/mL, (IF) 0.2 &μ;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギ IgG</td><td>サーモ</td><td>A-21206</td><td>使用希釈: (IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 2 &μ;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ロバ抗マウス IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10037</td><td>使用希釈: (IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 2 &μ;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ロバ抗ウサギ IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10042</td><td>使用希釈: (IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 4 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>抗 AQP5 ウサギ抗体</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>使用希釈率: (IHC) 1 &mu;g/mL, (IF) 0.1 &μ;g/mL</td></tr><tr><td>抗E-カドヘリンラット抗体</td><td>アブカム</td><td>ab11512</td><td>使用希釈率: (IF)&nbsp; 5 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>抗ケラチン14ウサギ抗体</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>使用希釈率:(IHC) 1 &mu;g/mL, (IF) 2 &μ;g/mL</td></tr><tr><td>抗Ki67ウサギ抗体</td><td>アブカム</td><td>ab15580</td><td>使用希釈率:(IHC) 1 &mu;g/mL, (IF) 1 &μ;g/mL</td></tr><tr><td>抗 mCherryマウス抗体</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>使用希釈率: (IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 2 &μ;g/mL</td></tr><tr><td>抗mCherryウサギ抗体</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>使用希釈率: (IF)&nbsp; 2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>C6H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>DAB キット (20x)</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>蛍光マウントミディア</td>ム <td>ダコ</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>サンゴン バイオテック</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG 抗体 (HRP)</td><td>アブカム</td><td>ab6789</td><td>使用希釈: 2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG抗体(HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>使用希釈率:2 &μ;g/mL</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>ヒストゲル(埋め込みヒドロゲル)</td><td>サーモ</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>広州化学</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>30% 過酸化水素溶液</td><td>広州化学</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>広州化学</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラルバルサム</td><td>SHANGHAI YIYANG</td><td>YY-Neutral balsam</td><td></td></tr><tr><td>非免疫ヤギ血清</td><td></td><td>BOSTER AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>広州化学</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. 化合物</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR & qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>アルコール</td><td>広州化学</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>広州化学</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>広州化学</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR グリーン I マスターミックス</td><td>ロシュ</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT マスターミックス</td><td>TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNAポリメラーゼ</td><td>タカラ</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (核酸染色)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td>Vector Construction &細胞トランスフェクション</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>OXID</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td></td><td>Sigma 56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>エンドトキシンフリープラスミド抽出キット</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 プラスミドトランスフェクションキット</td><td>Thermo</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR 反応キット</td><td>Thermo</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド抽出キット</td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&alpha;ケミカルコンピテントセル</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>トライトン</td><td>OXID</td><td>酵母</td><td></td></tr><tr><td>エキス</td><td>OXID</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Primers and Sequence</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: AQP5 Sequence: F:CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCCCATCCCCCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: &beta;-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCCTCCCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGGagg R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 レンチウイルス無負荷ベクター</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>Xiaofeng Qin 研究室, 中山大学</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

涙腺幹細胞のための3次元、無血清培養システム

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

涙腺(LG)幹細胞ベースの治療は、涙腺疾患のための有望な戦略です。しかしながら、十分な数のLG幹細胞(LGSC)を得るための信頼性の高い無血清培養方法の欠如は、さらなる研究および応用のための1つの障害である。成体マウスLGSCsの三次元(3D)無血清培養法は十分に確立されており、ここに示されている。LGSCsを連続的に継代し、腺房または乳管様細胞に分化誘導することができた。
LGSC初代培養のために、6〜8週齢のマウスからのLGsを、ディスパーゼ、コラゲナーゼI、およびトリプシン−EDTAで消化した。合計1個×104個の単一細胞を、24 ウェルプレートの各ウェル中のマトリックスゲル涙腺幹細胞培地(LGSCM)マトリックス80μLに播種し、20μLのマトリックスゲルLGSCMマトリックスでプレコートした。この混合物を37°Cで20分間インキュベートした後に固化し、LGSCMを600μL添加した。
LGSC維持のために、7日間培養したLGSCsを、ディスパーゼおよびトリプシン−EDTAによって単一細胞に脱凝集させた。この単一細胞を移植し、LGSC初代培養に用いた方法に従って培養した。LGSCは40回以上継代することができ、ステム/前駆細胞マーカーKrt14、Krt5、P63、およびネスチンを連続的に発現することができる。LGSCMで培養されたLGSCCは自己複製能を有し、インビトロおよびインビボで腺房または乳管様細胞に分化し得る。

3D無血清培養システムの確立 本研究では、マウスLGSCs用のEGF、Wnt3A、FGF10、Y-27632を含むLGSCMを開発し、3D培養法によるLGSCCsの単離・培養に成功しました(図1A)。この方法を用いて、C57BL/6マウス、NOD/ShiLtJマウス、BALB/cマウス、およびROSA26mT/mG マウスからのLGSCの3D無血清培養系が成功裏に確立されました16。雄マウスの場合、解離により2つのLGsから1.5-2×106 個の細胞が得られた。1週間の培養後、培養開始時に1〜104 個のLG細胞を播種すると、30〜60個のスフィ×が形成された。また、この方法で培養した細胞は、Epcam、Krt5、Krt14、P63、ネスチン、その他の幹細胞マーカー16を発現し、得られた細胞がLGSCの性質を有していたことを示しており、Krt14およびKi67は、LGSCsを7...

成体涙腺(LG)幹細胞の三次元無血清培養法は、LGオルガノイドの形成および腺房または腺管様細胞への分化の誘導のために十分に確立されている。

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

このプロトコールは、涙腺の再生および再構築のために涙腺幹細胞を富化するための有利な戦略を提供する。涙腺幹細胞は、長期的な拡張能力および分化の可能性を示す。この技術の主な利点は、涙腺幹細胞の培養培地が無血清であることであり、これは涙腺修復のための莫大な価値を示す 安楽死させた6〜8週齢のBALB / c男性マウスを入手し、耳の後ろの皮膚を切断して涙腺とその周囲の結合組織を露出させることから始める。ピンセットの助けを借りて鈍い解剖によって結合組織を剥がし、涙腺を除去する。涙腺を4ミリリットルの75%エタノールを含む6センチメートルの皿に10秒間浸し、直ちに10ミリモルのPBS溶液で2回すすいでください。涙腺を約1ミリメートル立方体の小さな断片に切る。それらを滅菌15ミリリットル遠沈管に移し、500マイクロリットルの25単位/ミリリットルのディスパーゼおよび500マイクロリットルの0.1%コラゲナーゼIで摂氏37度で1時間組織を処理する。涙腺断片を1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAで摂氏37度で10分間処理し、ピペッティングを繰り返して断片を単一細胞に解離させる。懸濁液を70マイクロメートルのフィルターでろ過し、フィルターを滅菌15ミリリットルの遠沈管に集め、150倍Gで5分間遠心分離する。遠心分離後、上清を取り出し、10ミリリットルの10ミリモルPBS溶液を加えて細胞ペレットを洗浄し、懸濁液を150倍Gで5分間遠心分離した。細胞ペレットの洗浄を繰り返す。次に、上清を除去し、ダルベッコの改変イーグルス培地とハムのF-12の1:1比の1ミリリットルを加えて、細胞ペレットを再懸濁する。20マイクロリットルのマトリックスゲル涙腺幹細胞培地マトリックスを24ウェルプレートのウェルの中央に加える。ピペットチップを使用して直径約6〜8ミリメートルの円に拡大し、混合物を摂氏37度で20分間インキュベートしてウェルをプレコートします。セルカウンターを使用して細胞数を決定し、40マイクロリットルの涙腺幹細胞培地(LGSCM)を合計10,000個の細胞とともに40マイクロリットルのマトリックスゲルに加える。ピペットで優しく混ぜる。ピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルのプレコート領域に80マイクロリットルの混合物を慎重に滴下します。混合物を摂氏37度で20分間インキュベートし、600マイクロリットルのLGSCMを加える。各ウェルの培養液は2日に1回交換する。7日間の培養後、倒立顕微鏡下で直径100〜300マイクロメートルのLGSCスフェアを探します。このプロトコルを使用して、Rosa26およびNODマウスの初代涙腺幹細胞を単離および培養する。7日間の培養後、スフェア培養ウェルから培養液を除去する。摂氏37度で30分間、20マイクロリットルの1ミリリットル当たり10

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド&gt;は6ヶ月間生存したまま。...

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

涙腺（LG）は、ビジョンと眼の健康を維持するために必要な涙の水性成分を生成し、分岐器官である。ここでは、LG電子の開発に関与するシグナル伝達経路を解読するネズミLG郭清およびex vivo培養技術を説明しています。...

マウス涙腺を操作する

ここでは、無血清胚様体（SFEB）と呼ばれるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）から3次元（3-D）システムを開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、器質型のスライス培養のように、ヒトの皮質の発達をモデル化するため、および神経回路を発達させる生理学的な質問のために使用することができる。...

生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

このプロトコルは、xeno ・ フィーダー細胞フリー培養条件下でのひと多能性幹細胞から角膜輪部上皮幹細胞の差別化のための単純な 2...

効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

このプロトコルは、定義された培養システムおよび細胞自己組織化を用いてヒト多能性幹細胞から肝球を産生するアプローチを記述する。このプロトコルは、多くの細胞株で再現可能であり、費用対効果が高く、生物医学的応用のための安定したヒト肝圏の生産を可能にする。...

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

このプロトコルは、初代マウスおよびヒト組織に由来する涙腺オルガノイドを確立、維持、遺伝子改変、分化、機能的に特徴付け、および移植する方法を説明しています。...

マウスおよびヒト涙腺オルガノイドの樹立、維持、分化、遺伝子操作、移植

ここでは、脂肪由来幹細胞(ADSC)培養のための3次元(3D)細胞培養フレームワークとしてのハイドロゲルの使用と、3D培養環境内でのADSCの増殖を促進するための光生体調節(PBM)の導入を実証するプロトコルを紹介します。...

光生体調節増強を用いたハイドロゲル中での脂肪由来幹細胞の三次元細胞培養

このプロトコルは、老化マウスの涙腺を解離し、単一細胞RNAシーケンスのための生存可能な単一細胞を得る最適化方法を説明しています。逐次酵素的消化と穏やかな取り扱いにより細胞の完全性が保たれ、細胞型特異的分離や加成に伴う涙腺集団の変化のトランスクリプトミック解析に適した高品質な懸濁液が得られます。...

高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、RNA配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル

我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。...

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

ヒト血小板溶解液は、増殖因子や細胞培養における強力なサプリメントの豊富な情報源となります。このプロトコルは、多血小板血漿から始まるいくつかの凍結融解サイクルを実行し、血小板の断片を枯渇させることによってヒト血小板溶解物の大規模なプールを準備するプロセスを示します。...

動物の無血清ヒト幹細胞培養のための効率的なサプリメントとしてプールしたヒト血小板可溶化物（pHPL）の調製

学ぶ涙腺幹細胞の3次元無血清培養法。BALB/cマウスから細胞を分離し、長期増殖と腺房・管状細胞への分化を実現。涙腺再生医療と組織修復研究に応用可能な革新的プロトコルです。

涙腺幹細胞のための3次元、無血清培養システム

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