シグマのエキス- N - Ampの組織PCRキットを使用してマウス組織の急速なジェノタイピング

こんにちは。私はリンダです。カリフォルニア大学アーバイン校のEdwin Niki博士の研究室に所属しています。今日は、SigmaのCyber Greenを用いたTissue PCRキットを使用して、トランスジェニックマウスのジェノタイプを迅速に判定する方法をご紹介します。通常、私は急性解離細胞培養を行う際に、マウスのジェノタイプを迅速に特定する必要があるため、このキットを用いて胚マウスのジェノタイピングを行っています。

本日の目的として、このキットの使用方法を示すために成マウスの尾を用意しました。このプロトコルでは、迅速なアルカリ消化とDNA抽出を行い、続いて迅速な中和ステップを行います。そして、抽出したDNAをリアルタイムPCRに使用し、PCRアンプリコンをモニタリングします。

それでは、準備が整いましたら始めていきましょう。開始する前に、ヒートブロックが 95 °C に設定されていること、SYBR Green が解凍され、使用時まで氷上で保持されていること、そしてその他の試薬が室温で解凍されていることを確認してください。氷上のバケットには、ジェノタイピングに使用する2種類のプライマーを用意しています。これらは目的遺伝子に対して特異的に設計され、qPCR で検証済みです。

また、目的遺伝子のポジティブコントロール、ネガティブコントロール、および既に採取済みの成体マウスの組織サンプルを用意しています。組織サンプルを採取する際は、極めて厳格に行うことが非常に重要です。マウス胚の尾を採取する場合、組織を採取する前および各採取の間に、必ずピンセットを70% ethanolで洗浄します。

まず、常にテールサンプルをTBSで洗浄します。次に、各テールについて組織調製およびDNA抽出用のマスターミックスを作成します。抽出液 100 µLと組織調製液 25 µLが必要です。P200およびフィルターピペットチップを用いて、抽出液 100 µLと組織調製液 25 µLを新しいエッペンドルフチューブに分注します。ピペッティングにより、マスターミックス溶液を混合してください。

次に、目的のサンプルに125 µLのマスターミックスを加えます。成マウスの尾を用いる場合は、切断端がマスターミックス溶液に完全に浸かっていることを確認してください。その後、フィンガーボルテックスで撹拌し、室温で10分間インキュベートします。この10分間のインキュベーションの間に、好みのグリーンマスターミックスを調製します。これには、キットに付属のcider greenマスターミックス、Milli-Q水またはPCRグレードの水、およびフォワードおよびリバースプライマーを使用します。以上で完了です。

10分間のインキュベーションが完了しましたので、95℃で3分間加熱し、反応を活性化させます。3分間の不活性化処理が終わりましたので、キットに付属の中和溶液を1反応あたり100 µL加え、ボルテックスミキサーで混合します。中和バッファーを加えた後、DNAサンプルは使用時まで4℃で保存することが可能です。

迅速に遺伝子型を判定したいため、すぐにqPCRに移行します。まず、テール（尾）部分を中和させ、準備を整えます。次に、Cyber Green PCRマスターミックスを用意し、PCRチューブをコールドブロック上にセットします。

次に、各ウェルにマスターミックスを16 µLずつ加え、その後、中和済み抽出液を4 µL、またはポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールを4 µLずつ加えます。つまり、各ウェルに16 µLのマスターミックスを加え、さらにそこに中和済み抽出液4 µLを加えることで、反応全量を20 µLとします。

陽性対照および陰性対照についても同様の手順で行います。PPRマスターミックス16 µLに4 µLを添加します。すべて添加したら、光学的に透明な8連キャップストリップで蓋をします。

サンプルの上のキャップの光学的に透明な部分に触れないように注意してください。ここでは、キャップが確実に密閉されているか確認するため、キムワイプを使用して上から押さえています。PCR用DNAミックスを軽くボルテックスして遠心分離したので、これでqPCR装置に入れる準備が整いました。

まず、サンプルをOpticon PCR機にロードします。次に、新しいプレートセットアップを作成します。1つ目のウェルをサンプル、2つ目のウェルを陽性対照、3つ目のウェルを陰性対照とします。また、反応全量を20 µLに指定してください。次に、Personas Rapid Genotyping用に設計されたプロトコルをロードします。

このプロトコールでは、3分間の変性ステップの後、15秒間の変性、15秒間の一次アニール、そして20秒間の一次伸長のサイクルを行います。なお、一次伸延時間は実際には約10秒まで短縮でき、その場合の1サイクルは合計でわずか40秒となります。通常のPCRと同様に、これらの3つのステップを約40サイクル繰り返し、最後に融解曲線分析を行います。

プレートの準備が整い、プロトコルのロードも完了しました。あとはqPCRを実行するだけです。まずは3分間の変性ステップから開始されます。私が使用しているプライマー、テイルサンプル、および目的遺伝子の経験から、陽性サンプルは25サイクル付近で有意なサイクル閾値（Ct値）に達し始めると予想されます。

この交差（クロスオーバー）が起こるタイミングは、組織サンプルや目的の標的、および初期のDNA量に大きく依存します。すでにポジティブコントロールが上昇しており、サンプルも陽性であることがわかります。ご覧の通り、ポジティブコントロールに続いて、サンプルの上昇も始まっています。

現在はまだ27サイクルであるため、しばらく待つ必要がありますが、あと数サイクル進めば、サンプルが陽性であることを確認でき、実験を続行できるはずです。現時点では、陰性コントロールが上がり始めているのが分かりますが、これはテール部分を過剰に添加したためです。これにより、この過剰な陰性テールが現れる前に検出されたものはすべて陽性であると判断できます。

したがって、この時点でネガティブコントロールよりも前に現れるものはすべてポジティブとみなし、実験を続行します。PCRのサイクリングが終了すると、装置が融解曲線分析を行います。これにより、生成物の組成と純度を判断することができます。

これにより、ポジティブサンプルとネガティブサンプルが正しく選択されたかを確認できます。例えば、ポジティブサンプルでは、増幅された特定のPCR産物に対応する、特有の鋭い融解温度ピークが認められます。一方、ネガティブサンプルでは、PCR中に増幅された非特異的なDNAに対応する、非特異的な幅広の融解温度ピークが認められます。

これまで、Sigma社のCyber Green抽出用アンプを用いて、成マウスの尾を迅速にジェノタイピングする方法を説明しました。しかし、このキットはさまざまな動物組織や毛、唾液に使用することができ、私はマウス胚の尾のジェノタイピングにも使用しています。迅速に処理できるため、私たちはこのキットを好んで使用しています。

1時間以内にジェノタイプを確認することができ、非常に便利で簡単です。それでは、ご視聴ありがとうございました。成功をお祈りしています。