Name: 哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶ哺乳類細胞からのユビキチン化タンパク質精製法。p53をモデルとして、タンパク質機能調節におけるユビキチン化の役割を研究するための効率的な手法を解説します。

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この研究は、中国国家自然科学財団(81972624)からD.L.への助成金によって支援されました。

注:H1299細胞は、中国科学院の幹細胞バンクから親切に提供され、マイコプラズマ汚染に対して陰性であることが証明されました。
1. 細胞培養
<ol><li>最初の培養では、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%グルタミン添加剤、1%ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質(100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を添加した10-12 mLのRPMI 1640培地を入れた10 cmペトリ皿に、ヒト肺腺癌細胞株H1299の1 x 106 細胞を入れます。細胞を5%CO2を含む加湿インキュベーター内で37°Cに維持する。細胞が2%〜3%のコンフルエントに達したときに応じて、90〜90日ごとに細胞を分割します。</li>
	<li>トランスフェクションの1日前に、3つのペトリ皿用に6-9 x 10 6細胞を準備し、10-12 mLの培地を含む単一の10 cmペトリ皿に2-3 x 106細胞をプレートして、トランスフェクション中に70%-90%のコンフルエンスを達成します。 注:HEK293T細胞は、トランスフェクション効率が高く、タンパク質発現レベルが高いため、ユビキチン化タンパク質の精製にも使用できます。</li>
</ol>2. プラスミドトランスフェクション
<ol><li>3本の15 mL遠沈管に1.5 mLの還元血清培地を加えます。</li>
	<li>トランスフェクション可能なプラスミドDNAを各チューブに加え、以下のように希釈します。チューブ1:1μgのFlag-p53プラスミド、12μgの空のベクター;チューブ2:1 μgのFlag-p53プラスミド、3 μgのHis-HA-Ub(HH-Ub)プラスミド、および9 μgの空のベクター。チューブ3:1 μgのFlag-p53プラスミド、3 μgのHH-Ubプラスミド、および9 μgのMdm2プラスミド。合計0.2 μgの緑色蛍光タンパク質(GFP)プラスミドを各チューブに追加して、トランスフェクション効率をモニタリングします。 注:細胞内で効率的な標的タンパク質発現を達成するために必要なプラスミドの最適量を決定するために、パイロット実験を実施する必要があります。</li>
	<li>78 μLのリポソームトランスフェクション試薬を別の遠沈管内の4.5 mLの還元血清培地に加え、リポソームを希釈します。チューブをフリックして完全に混合し、室温(RT)で5分間放置します。</li>
	<li>1.5 mLの希釈DNA溶液を含むステップ2.2から、1.5 mLの希釈リポソーム溶液を各チューブに追加します。プラスミドをリポソームと完全に混合し、RTで少なくとも20分間架橋します。 各トランスフェクションにプラスミドDNA:リポソーム比1:2(μg:μL)を使用します。</li>
	<li>ペトリ皿から元の培地を廃棄し、9 mLの還元血清培地を各皿に加えます。各ディッシュに3 mLのリポソーム-DNA混合物を加え、プレートを前後に3倍、次に左右に3倍に穏やかに振って溶液を混合し、プレート内の混合物を均等に分配します。</li>
	<li>細胞を加湿インキュベーター内で5%CO2と共に37°Cで培養する。4〜6時間後に培地を交換し、24〜36時間細胞を培養し続けます。</li>
</ol>3.細胞採取
<ol><li>24〜36時間後、細胞をMG132で最終濃度10μMで4〜6時間処理します。 注:MG132は、26Sプロテアソーム複合体のタンパク質分解活性を効率的にブロックするペプチドアルデヒドです。リジン-48(K48)結合ポリユビキチン鎖でユビキチン化されたタンパク質の量は、細胞をMG132または他のプロテアソーム阻害剤で処理した後に増やすことができます。</li>
	<li>培地を廃棄し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回洗浄し(細胞を洗い流さないように注意)、血清学的ピペットで細胞を吸引します。</li>
	<li>1 mLのPBSをディッシュに加え、きれいなスクレーパーでこすって細胞を取り除き、細胞懸濁液を微量遠心チューブに移します。700 x g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを収集します。</li>
</ol>4. ユビキチン化タンパク質の非変性条件下での精製
<ol><li>使用前に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを新たに補充したフラグ溶解バッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7.9)、137 mM NaCl、10 mM NaF、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1% Triton X-100、0.2% サルコシル、および10% グリセロール)を準備します。</li>
	<li>800 μLの氷冷フラッグ溶解バッファーを各チューブの細胞に加え、ボルテックスオシレーターまたはピペットガンを使用して細胞を混合し、ローテーター上で4°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>超音波の5-10短いパルスに混合物をさらす。20 kHZの超音波処理周波数と80%の振幅で氷上で超音波処理を実行し、各パルスは1秒間持続します。混合物をローテーター上で毎分40回転(rpm)で4°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>超音波処理されたサンプルを8,000 x g で4°Cで20〜30分間遠心分離します。 上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>細胞抽出液80 μL(1/10)を分注し、20 μLの5xドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ローディングバッファーと混合します。サンプルを98°Cで5分間煮沸し、氷上で2分間冷却し、使用するまで-20°Cで保存します。これらのサンプルを入力グループとして使用して、タンパク質発現をモニターします。</li>
	<li>残りの細胞抽出液に30 μLの抗Flag M2抗体結合(Flag/M2)ビーズを加え、ローテーター上で4°Cで少なくとも4時間または一晩インキュベートします。</li>
	<li>1,500 x g で4°Cで2分間遠心分離し、ビーズを回収します。1 mLの氷冷フラッグ溶解バッファーをビーズに加え、チューブを数回反転させて混合します。</li>
	<li>1,500 x g で4°Cで2分間遠心分離し、ビーズを回収します。手順4.7を4〜6回繰り返します。</li>
	<li>最終濃度200 ng/μLのFlagペプチド40 μLをビーズに加え、ローテーター上で4°Cで2時間インキュベートして、結合したタンパク質を溶出します。</li>
	<li>1,500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>10 μLの5x SDSローディングバッファーを加え、混合物を98°Cで5分間煮沸し、氷上で2分間冷却し、ウェスタンブロッティング用に-20°Cで保存します。あるいは、ステップ4.10の溶出液を、他の下流実験のために-80°Cで直接保存します。 注:精製されたユビキチン化タンパク質の量は、トランスフェクトされる細胞数とプラスミドの量を増やすことでスケールアップできます。エピトープタグ付け戦略は、天然の精製条件下でユビキチン化p53に特異的に結合する細胞複合体を精製するために適応させることができる。Flag-p53、mdm2、およびHA-ユビキチンを共発現させることにより、ユビキチン化p53タンパク質複合体を、哺乳類細胞からのシーケンシャルFlagおよびHA抗体結合アガロースによって免疫沈降することができる。ユビキチン化p53タンパク質の結合パートナーを維持するには、精製プロセス中に、より厳密でないBC100溶解バッファー(20 mM Tris-HCl(pH 7.9)、100 mM NaCl、10% グリセロール、0.2 mM EDTA、0.2% Triton X-100、および1xプロテアーゼ阻害剤)を使用する必要があります。HAペプチドからの溶出液を質量分析にかけ、ユビキチン化されたp53に特異的に結合するすべてのパートナーを同定します。</li>
</ol>5. 変性条件下でのユビキチン化タンパク質の精製
<ol><li>ステップ3.3で得られたセルペレットに1 mLの氷冷PBSを加え、均一に混合します。細胞懸濁液100 μL(1/10容量)を投入サンプルとして微量遠心チューブに分注します。</li>
	<li>700 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収します。80 μLのFlag溶解バッファーを投入サンプルに加え、ボルテックスオシレーターまたはピペットガンを使用して細胞を混合し、氷上で細胞を1時間溶解します。</li>
	<li>8,000 x g で4°Cで20〜30分間遠心分離します。 上清80 μLを新しいマイクロ遠心チューブに分注します。</li>
	<li>上清に20 μLの5x SDSローディングバッファーを加え、98°Cで5〜10分間煮沸し、氷上で2分間冷却し、使用するまで-20°Cで保存します。</li>
	<li>残りの900 μLの細胞懸濁液を700 x gで4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。1 mLのユビキチンバッファー1(UBバッファー1;6 M グアニジン-HCI、0.1 M Na 2 HPO4、6.8 mM NaH 2 PO4、10 mM Tris-HCI(pH 8.0)、および0.2% Triton X-100、新たに10 mM β-メルカプトエタノールと5 mMイミダゾールを添加した)を細胞ペレットに加え、ピペッティングで数回混合して細胞を均等に分配します。 注:イミダゾールの濃度は、ニッケル荷電樹脂への非特異的タンパク質結合を減少させるために、5 mMから20 mMまで変化し得る。ユビキチンバッファーには、リガーゼとDUBの両方を不活性化する塩酸グアニジンが含まれています。β-メルカプトエタノールは、腐った卵に似た強く不快な臭いを持つ無色透明の液体です。高濃度の溶液は、粘膜、上気道、皮膚、および目に深刻な損傷を引き起こします。手袋とゴーグルを着用し、ドラフト内で操作してください。</li>
	<li>溶液がもはや粘性でなくなるまで、細胞溶解物を超音波の10〜20ラウンドに供する。20 kHZの超音波処理周波数と80%の振幅で氷上で超音波処理を実行し、各パルスは1秒間持続します。8,000 x g でRTで20〜30分間遠心分離し、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>30 μLのニッケルチャージ樹脂を上清に加え、15 rpmに設定したローテーターで4時間またはRTで一晩インキュベートします。 1,500 x g でRTで2分間遠心分離し、ビーズを回収します。</li>
	<li>1 mLのUBバッファー1を加え、振とう機でRTで10分間回転インキュベートし、1,500 x g でRTで2分間遠心分離してビーズを回収します。</li>
	<li>1 mLのユビキチンバッファー2(UBバッファー2;8 M尿素、0.1 M Na 2 HPO 4、6.8 mM NaH 2 PO4、10 mM Tris-HCI(pH 8.0)、および0.2% Triton X-100)をビーズに加え、振とう機でRTで10分間回転させてインキュベートし、1,500 x gで2分間遠心分離してビーズを回収します。これをもう一度繰り返します。</li>
	<li>ビーズに1 mLのPBSを加え、振とう機でRTで10分間回転インキュベートし、RTで1,500 x g で2分間遠心分離してビーズを回収します。これをもう一度繰り返します。</li>
	<li>ビーズを最終濃度0.5 Mのイミダゾール40 μLでRTで1時間インキュベートすることにより、結合タンパク質を溶出します。 1,500 x g でRTで2分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を清潔な微量遠心チューブに移し、10 μLの5x SDSローディングバッファーを加え、98°Cで5分間煮沸し、氷上で2分間冷却し、ウェスタンブロッティング用に-20°Cで保存します。あるいは、未処理の溶出液を-80°Cで保存して、他の下流実験に役立ててください。</li>
</ol>6. ウェスタンブロッティングによる精製ユビキチン化タンパク質の検出
<ol><li>ステップ4.11および5.12のサンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、次にウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜に移し、18に記載されている対応する抗体を使用して標的タンパク質を検出します。</li>
	<li>簡単に説明すると、TBSTバッファー(15 mM Tris-HCI、pH = 7.6、4.6 mM Tris-Base、150 mM NaCI、使用前に0.1%Tween-20を新たに補充した)中の5%脱脂粉乳を含むブロッキング溶液20 mLにRTで1時間浸漬してメンブレンをインキュベートします。次に、メンブレンを一次抗体とともにRTで2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 各セットに以下の抗体を使用する。全ての一次抗体を1:1000の希釈率で使用した。<ol><li>Flag/M2アガロースビーズによる免疫沈降後に抗p53モノクローナル抗体を用いて、ユビキチン化p53を含む総p53タンパク質を検出します。</li>
		<li>Flag/M2アガロースビーズによる免疫沈降後に、抗HA抗体または抗ユビキチン抗体でユビキチン化p53タンパク質を検出します。</li>
		<li>ニッケル荷電樹脂プルダウン後の抗p53モノクローナル抗体でユビキチン化p53タンパク質を検出します。</li>
		<li>ニッケル荷電樹脂プルダウン後の抗HA抗体または抗ユビキチン抗体で総ユビキチン化タンパク質を検出します。</li>
	</ol></li>
	<li>西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体を用いてメンブレンをRTで1時間インキュベートし、TBSTバッファーで3回洗浄した後、それぞれ5分間インキュベートします。全ての二次抗体を1:3000の希釈率で使用した。次に、膜をTBST緩衝液3倍で5分間ずつ穏やかに撹拌しながら洗浄する。</li>
	<li>化学発光イメージングシステムを開始し、ウェスタンブロッティングからのシグナルを検出します。溶液Aと溶液Bを1:1の比率で混合することにより、HRP用の基質溶液を調製します。</li>
	<li>ニトロセルロースメンブレンをカメラオブスクラに上向きに置き、ピペッティングガンを使用してメンブレン上に基質溶液を均一にコーティングします。化学発光シグナルをキャプチャするには自動露光手順を選択し、理想的な信号が得られるまで露光時間を手動で調整します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

ユビキチン化は、ほとんどすべての生理学的および病理学的細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします2。近年、シグナル伝達経路におけるユビキチンの分子的役割と、ユビキチン系の変化がどのようにしてさまざまなヒト疾患につながるかを理解する上で大きな進歩が見られました2。ユビキチン化タンパク質の精製は、これらのプロセスにおけるユビキチン化の正確な役割についての洞察を提供することに貢献します。ユビキチン結合タンパク質の混合物は、非変性および変性条件下で細胞から精製することができる。ニッケル樹脂を使用したIMACは、変性条件下でポリHisタグ付きタンパク質を精製するために使用できます。変性条件下でユビキチン化タンパク質を精製する目的は、標的タンパク質から相互作用パートナーを廃棄することです。標的タンパク質に結合するすべての細胞成分は、変性条件下で溶出から削除されます。対照的に、標的タンパク質に結合する一部の細胞タンパク質は、天然条件下で溶出中に保持される可能性があり、下流の実験を妨げる可能性があります。ユビキチン化タンパク質は、ニッケル樹脂への非特異的タン...

ユビキチンは、76個のアミノ酸1,2,3の進化的に保存されたタンパク質です。ユビキチンは、活性化(E1)、結合(E2)、およびリガーゼ(E3)酵素を含むカスケードを介して、標的タンパク質上のリジン残基に共有結合します。ユビキチンは最初にE1酵素によって活性化され、次にE2結合酵素に移されます。続いて、E3ユビキチンリガーゼは、ユビキチン負荷E2酵素および基質タンパク質の両方と相互作用し、ユビキチンのC末端と基質1,2,3,4,5中のリジン残基との間のイソペプチド結合の形成を媒介する。ユビキチン化は、ユビキチン部分の基質タンパク質上のリジン残基またはそれ自体への結合を含み、タンパク質モノユビキチン化またはポリユビキチン化をもたらす。このユビキチン化プロセスは真核生物の細胞内で起こり、多種多様な生物学的プロセスを調節します。ユビキチン化は、ユビキチン・プロテアソーム系を介して基質タンパク質の分解をもたらす1,2,3,4,5。さらに、ユビキチン化は、細胞におけるタンパク質細胞内局在、タンパク質複合体形成、およびタンパク質輸送を調節する3,5。基質タンパク質にライゲーションされたユビキチン部分は、脱ユビキチン化酵素(DUB)によって除去することができる6,7。特に、ユビキチン鎖が組み立てられるさまざまな方法は、さまざまな生物学的プロセスを調節するための無数の手段を提供します1,5。基質タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の正確な役割は、これまで完全には理解されていません。ユビキチン化タンパク質の精製は、タンパク質ユビキチン化が様々な細胞プロセスに及ぼす影響の解明に貢献します。
p53タンパク質は最も重要な腫瘍抑制タンパク質の1つであり、ほとんどすべてのヒト癌において遺伝子変異または不活性化を示す8,9,10,11。p53の安定性と活性は、ユビキチン化、リン酸化、アセチル化、メチル化などの翻訳後修飾によってin vivoで微妙に調節されています12,13。p53タンパク質は、様々な細胞において6分から40分の範囲の短い半減期を有し、これは主にそのポリユビキチン化およびその後のプロテアソーム分解に起因する10,12。マウスダブルミニッツ2(Mdm2)は、p53のE3ユビキチンリガーゼであり、p53のN末端に結合してその転写活性を阻害する12、14、15。Mdm2は、p53のポリユビキチン化とプロテアソーム分解を促進してその安定性を制御し、p53のモノユビキチン化を誘導して核輸送を促進します12,14,15,16。ここでは、Mdm2を介したp53ユビキチン化を例に、哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製する方法を詳細に紹介する。標的タンパク質のユビキチン化状態に影響を与える調節因子は、哺乳類細胞で過剰発現またはノックダウン/ノックアウトされた場合に、このin vivoユビキチン化アッセイを使用して同定できます。さらに、ユビキチン化タンパク質は、in vitroデユビキチン化アッセイの基質として使用できます。ハイスループットスクリーニングを実行して、ユビキチン化基質を個々のDUBとインキュベートすることにより、標的タンパク質の特定のDUBを同定できます。ユビキチン化タンパク質は、細胞内の下流のシグナル伝達タンパク質を動員するための足場として機能する可能性があります。ユビキチン化された標的タンパク質複合体は、天然の精製条件下での逐次免疫沈降によって精製し、質量分析によって同定することができる。現在のプロトコルは、ユビキチン化によって調節される細胞タンパク質を調査するために広く使用することができる。
ユビキチン化タンパク質を精製するには、アフィニティータグ付きユビキチン、ユビキチン抗体、ユビキチン結合タンパク質、単離されたユビキチン結合ドメイン(UBD)の使用など、いくつかの方法が確立されています17。ここでは、アフィニティタグ付きユビキチンをメディエーターとして使用して、哺乳類細胞内のユビキチン化タンパク質を精製するプロトコルを提供します。ポリHisタグ付きユビキチンの使用は、他の方法よりも優れています。ユビキチン化タンパク質は、強力な変性剤の存在下で精製され、細胞タンパク質を線形化し、タンパク質間相互作用を破壊することにより、ニッケル荷電樹脂への非特異的結合を低減します。対照的に、ユビキチン抗体、ユビキチン結合タンパク質、および単離されたUBDをメディエーターとして使用すると、精製はそれほど厳しくない条件下で行う必要があるため、結合パートナーを標的タンパク質から効果的に排除することはできません。さらに、精製は、これらのメディエーターを使用した無関係タンパク質の結合の増加にもつながる可能性があります。さらに、様々なユビキチン結合型ならびにユビキチン結合タンパク質または単離されたUBDによるモノおよびポリユビキチン化に対する結合傾向がある17。ポリHisタグ付きユビキチンの使用は、すべての細胞ユビキチン化タンパク質を引き下げることに寄与する。あるいは、市販の抗Flagまたは抗HA抗体結合アガロースを使用することで、非変性条件下で大規模なFlagまたはHAタグ付き標的タンパク質の免疫沈降が容易になります。第2の精製工程は、例えば、ポリHisタグ付きユビキチンを標的とするニッケル荷電樹脂によって、ダウンストリーム実験のために高純度でユビキチン化標的タンパク質を取得するために使用することができる。特に、エピトープタグ付け精製戦略は、特異的抗体を取得できない場合に、標的タンパク質を効果的に免疫沈降させることができます。最後に、哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質の精製は、インビ トロでの精製と比較して、より生理学的条件下で標的タンパク質のユビキチン結合様式を保持する。

<table><tbody><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked entire Ab (from sheep)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>Secondary antibdoy</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked entire Ab (from rodkey)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>Secondary antibdoy</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 beads</td></tr><tr><td>抗GFPモノコロン抗体</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>アンチHA High Affinity</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>アンチ-Mdm2 モノコロン抗体 (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>アンチ-p53モノコロン抗体 (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAGペプチド</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>溶出バッファーを調製</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>サプリメント</td></tr><tr><td>グアニジン-HCI</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A100287-0500</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>H1299</td><td>幹細胞バンク、中国科学院Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Immidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagents</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>プロテアソーム阻害剤</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A501727-0500</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A610476-0005</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A501726-0500</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>Ni-NTA アガロース</td><td>QIAGEN</td><td>30230</td><td>ニッケルチャージ樹脂</td></tr><tr><td>ニトロセルロースブロッティングメンブレン</td><td>GEヘルスケア</td><td>10600002</td><td>0.45 &micro;m孔径</td></tr><tr><td>Opti-MEM 還元血清中</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>トランスフェクション培地</td></tr><tr><td>PBS</td><td>コーニング</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン 溶液</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>生物産業</td><td>01-100-1ACS</td><td>中</td></tr><tr><td>サルコシル</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>SDS ローディング バッファー</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>サプリメント</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>サンゴン バイオテック</td><td>A501492-0005</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>トリス-HCI</td><td>サンゴン バイオテック</td><td>A610103-0250</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A110694-0500</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A100777-0500</td><td>サプリメント</td></tr><tr><td>超高感度化学発光イメージングシステム</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>ケミドック XRS+</td></tr><tr><td>尿素</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A510907-0500</td><td>溶媒</td></tr></tbody></table>

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

ユビキチン化は、基質タンパク質の安定性だけでなく局在や機能も調節する翻訳後修飾の一種です。ユビキチン化プロセスは真核生物の細胞内で起こり、ほとんどすべての基本的な細胞生物学的プロセスを調節します。ユビキチン化タンパク質の精製は、基質タンパク質の機能制御におけるユビキチン化の役割の研究に役立ちます。ここでは、哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な手順を、p53腫瘍抑制タンパク質を例に説明する。ユビキチン化p53タンパク質は、ストリンジェントな非変性および変性条件下で精製した。全細胞Flagタグ付きp53タンパク質を、非変性条件下で抗Flag抗体結合アガロースで精製しました。あるいは、全細胞Hisタグユビキチン化タンパク質を、変性条件下でニッケル荷電樹脂を用いて精製した。溶出液中のユビキチン化p53タンパク質は、特異的抗体で検出することに成功しました。この手順を使用すると、特定のタンパク質のユビキチン化形態を哺乳類細胞から効率的に精製することができ、タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の役割に関する研究が容易になります。

この模式図は、フラグタグ付きp53(Flag-p53)およびHis/HA二重タグ付きユビキチン(HH-Ub)タンパク質を示しています(図1A)。ユビキチン化タンパク質を精製するために利用される手順を 図1Bに要約する。ポリHisタグ付きユビキチンは、哺乳類細胞の標的タンパク質にライゲーションすることができます。ユビキチン化タンパク質は、非変性条件下でFlag/M2ビーズで精製するか、変性条件下で固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって精製することができます(図1B)。ユビキチン化p53を含む総p53タンパク質を、非変性条件下でH1299細胞由来のFlag/M2ビーズで免疫沈降しました。これらの細胞でMdm2を異所的に発現させると、低分子から高分子に塗抹したバンドとして現れるユビキチン化p53タンパク質からのシグナルが著しく増加し、ユビキチン化p53タンパク質が細胞から効果的に精製されていることが示唆されました(<strong cla...

このプロトコルは、例としてp53腫瘍抑制タンパク質を使用して哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な方法を記載している。ユビキチン化p53タンパク質を、ストリンジェントな非変性および変性条件下で細胞から精製した。

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

このプロトコルを使用すると、特定のタンパク質のユビキチン化形態を哺乳類細胞から効率的に精製することができ、タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の役割に関する研究が容易になります。哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質の精製は、in vitroでの精製と比較して、より多くの放射線条件下で標的タンパク質のユビキチン結合様式を保持する。まず、15ミリリットルの遠心分離管3本に1.5ミリリットルの還元血清培地を加えます。トランスフェクション可能なプラスミドDNAを各チューブに加え、0.2マイクログラムの緑色蛍光タンパク質プラスミドを加えてトランスフェクション効率をモニタリングします。78マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を別の遠沈管の4.5ミリリットルの還元血清培地に加え、リポソームを希釈します。チューブをフリックして完全に混合し、室温で5分間放置します。1.5ミリリットルの希釈DNA溶液を含む各チューブに1.5ミリリットルの希釈リポソーム溶液を追加します。プラスミドを室温で少なくとも20分間完全に混合し、リポソームと架橋します。ペトリ皿から元の培地を廃棄し、9ミリリットルの還元血清培地を各皿に加えます。3ミリリットルのリポソームDNA混合物を加え、プレートを前後に3回、次に左右に3回穏やかに振って溶液を混合し、プレート上に混合物を均等に分配します。加湿インキュベーター内の細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で培養します。4〜6時間後に培地を交換し、24〜36時間細胞培養を続けます。24〜36時間後、細胞を最終濃度10マイクロモルのMG132で4〜6時間処理します。培地を廃棄し、氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。皿に1ミリリットルのPBSを加えます。きれいなスクレーパーで細胞をこすって細胞を取り除き、細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移します。700Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した800マイクロリットルの氷冷FLAG溶解バッファーを各チューブの細胞に加えます。ボルテックスオシレーターまたはピペットガンを使用して細胞を混合し、ローテーター上で摂氏4度で30分間インキュベートします。各パルスが1秒間続く氷上で混合物を超音波処理し、混合物を5〜10回の短いパルスにさらします。混合物をローテーター上で40 RPMで摂氏4度で30分間インキュベートします。次に、8, 000 Gで超音波処理されたサンプルを摂氏4度で20〜30分間遠心分離します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。80マイクロリットルの細胞抽出物を分注し、20マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーと混合します。サンプルを摂氏98度で5分間煮沸します。氷上で2分間冷やし、使用するまでマイナス20°Cで保管してください。こ

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

このビデオでは、複雑なペプチド混合物から残留ジグリシンペプチドを含むユビキチン化ペプチドを抽出し精製する方法について説明しています。提示された方法は、タンパク質中の元のユビキチン化部位を同定するのに役立つ可能性があります。...

ユビキチン化ペプチドの免疫親和性ベースの抽出:精製ペプチド画分からユビキチンタグ付きペプチドを選択的に抽出する技術

ここで説明する方法は、外因性の抗原クロス...

外因性の抗原クロス プレゼンテーション内の小胞体関連分解膜コンパートメントの精製

ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3...

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。...

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

本プロトコルは、哺乳類細胞溶解液または純粋なユビキチン酵素複合体を用いて肺炎 連鎖...

体外受精 細菌のユビキチン化の再構築とVCP/p97媒介の除去

学ぶ哺乳類細胞からのユビキチン化タンパク質精製法。p53をモデルとして、タンパク質機能調節におけるユビキチン化の役割を研究するための効率的な手法を解説します。

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

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