Name: 馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶサイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞の分離法。培養細胞からEVを効率的に抽出し、CDマーカー解析で品質を確認。細胞間情報伝達メカニズムの研究に応用可能です。

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著者らは、ペンシルベニア州立大学ベーレンドとハモット健康財団の資金提供、およびペンシルバニア州ユニバーシティパークのペンシルベニア州立大学顕微鏡施設に感謝したいと思います。

<ol><li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li>
<li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).</li>
<li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li>
<li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+functionality%2C+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).</li>
<li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li>
<li>Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+heterogeneity%3A+Subpopulations%2C+isolation+techniques%2C+and+diverse+functions+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).</li>
<li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples%3A+Considerations+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Gámez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).</li>
<li>Williams, R. L., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).</li>
<li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications%2C+ultrafiltration%2C+and+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).</li>
<li>Onódi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

SECは、EVをコンディショニングCCMから適切に分離するためのユーザーフレンドリーな方法です。細胞由来EVを特異的に分離するためには、CCMの種類とそのサプリメントを慎重に検討する必要があります。多くの細胞培養培地には、血清を採取した動物由来のEVを含むFBSを補充する必要があります。これらの血清EVは、培養中の細胞に由来するEVによって産生される任意のシグナルを飽和させ、マスクし得る26。したがって、実験を行う際には、EV枯渇FBSを可能な限り使用して、見出されたEVがウシ由来ではなく細胞由来に起因することを確実にすべきであり、これは商業的に購入することも、他の場所でレビューされた様々な技術を通じて社内で製造することもできる26、27。
SEC 列を介してサンプルを実行する場合は、フィルター処理された PBS を使用することが不可欠です。そうしないと、各画分は、細胞由来のEVや細胞外タンパク質だけでなく、PBSから...

細胞外小胞(EV)の研究への関心の爆発は、これらのナノサイズの不均一な粒子を分離して研究するために使用される技術と技術の大きな進歩を伴っています。約40年前の発見以来1,2、これらの小さな膜構造は生理活性脂質、核酸、タンパク質を含み、細胞間コミュニケーションにおいて主要な役割を果たしていることがわかっています3,4。EVはすべての細胞型から放出されるため、血漿や血清、唾液、尿など、すべての体液に存在します。これらの液体中のEVは、神経炎症性疾患や神経変性疾患、癌、自己免疫疾患など、さまざまな疾患の非侵襲的バイオマーカーとして機能することが大いに期待されています5,6,7。さらに、インビトロ機構研究は、培養培地3、8、9に放出されたEVを分離することによって細胞培養技術を通じて行うことができる。
疾患の病態生理におけるEVの役割を理解するには、EVが見つかった液体から適切に分離することが最も重要です。EV分離のゴールドスタンダードは長い間示差超遠心(dUC)10でしたが、EVを他の細胞外成分からよりよく分離するために、より洗練された技術が生まれています。これらの手法には、密度勾配、非対称フローフィールドフローフラクション(A4F)、フローサイトメトリー、イムノキャプチャー、ポリエチレングリコール沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などがあります11,12,13。各手法には、独自の長所と短所があります。しかし、特にSECは、生体液と細胞培養上清の両方からEVを非常に効果的に分離することが示されています8,14,15。SECには、比較的簡単でユーザーフレンドリーであるという追加のボーナスもあります。
SECは、サイズに基づいて流体の成分を分離する方法です。この技術では、樹脂のカラム(社内で製造されたもの、または市販品で購入されたもの)を使用してサンプルを分画します。サンプル中の小さな粒子は樹脂内のビーズの間に閉じ込められますが、大きな粒子は樹脂をより自由に通過できるため、プロセスの早い段階で溶出します。EVは多くの細胞外タンパク質やタンパク質凝集体よりもサイズが大きいため、EVは細胞外タンパク質よりも速くカラムを通過し、早い画分で溶出します14。
この方法の論文では、コントロールおよび小胞体(ER)ストレス条件の両方の下で、ヒト希突起膠細胞から細胞培養培地(CCM)からEVを分離するためのSECの使用について概説しています。このプロトコルを使用すると、この手法で分離されたEVは、一緒にプールして下流の特性評価のために濃縮できる特定の画分内に見られ、分離されたEVは細胞に由来し、CCMを補完するために使用されるウシ胎児血清(FBS)などの外因性源からではないことが示されています。EV画分における標準的なEVマーカーCD63、CD81、およびCD916、17、18、19の存在、およびタンパク質画分におけるそれらの不在は、ウェスタンブロッティングで実証されています。透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して、EVは視覚化され、期待される形態を示し、EV分画でのみ観察されます。粒子は、対照およびERストレス条件の両方のEVおよびタンパク質画分でもカウントされ、EVサンプルでは直径50〜200nmの予想されるサイズ範囲内の多数の粒子が観察されます。これらのデータを組み合わせることで、SECが細胞培養培地からEVを分離するための効率的かつ効果的な方法であるという考えが裏付けられています。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>VWR</td><td>97064-588</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli サンプルバッファー</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット、ウルトラセル、3 KDa、15mL</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>UFC900308</td><td>3 kDa カットオフ</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-2 遠心フィルターユニット、ウルトラセル-3 メンブレン付き</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>UFC200324</td><td>3 kDa カットオフ</td></tr><tr><td>アンモニウム過硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ IgG、HRP リンク抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>7074V</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>希釈抗カルネキシン抗体</td><td>Abcam</td><td>&nbsp;ab22595</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>抗 CD9 マウスモノクローナル抗体</td><td>BioLegend</td><td>312102</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>抗 GM130 抗体 [EP892Y] - シスゴルジマーカー</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>抗マウス IgG、HRPリンク抗体</td><td>細胞シグナル技術</td><td>7076V</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>希釈自動フラクションコレクター</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA アッセイキット</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD カメラ</td><td>Gatan Orius SC200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd63 マウス 抗ヒト</td><td>BD</td><td>556019</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>CD81 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23962</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>Cellstar フィルターキャップ 細胞培養フラスコ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MPイメージャー</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>BioRad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium</td><td>Cytiva</td><td>SH300022.</td><td></td>FS</tr><tr><td>ウシ胎児血清 プレミアムグレード</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、エキソソーム枯渇型</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>BioRad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>お得な 無脂肪粉ミルク</td><td>アマゾン</td><td>B076NRD2TZ</td><td></td></tr><tr><td>HOG ヒト乏突起膠腫細胞株</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC163</td><td></td></tr><tr><td>Izon Science USA Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol >99.8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN ガラスプレート</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td>0.75mm スペーサー付き</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN ショートプレート</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン、溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100mL</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 PBS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP66150</td><td></td></tr><tr><td>ピアス BCA タンパク質アッセイキットおよび試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>ピアス PVDF 転写膜</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>ピアス ウェスタンブロッティングフィルターペーパー</td><td>サーモScientific</td><td>84783</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL</td><td>Bio Basic</td><td>TB0560</td><td></td></tr><tr><td>Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]</td><td>ABCam</td><td>ab125011</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>水酸化スロジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SX0603</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム、&ge;99.0% (GC)、ダストフリーペレット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TGX Stain-Free FastCast アクリルアミドキット、10%</td><td>BioRad</td><td>1610183</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン0.25%プロテアーゼとブタトリプシン、HBSS、EDTA;カルシウム、マグネシウム</td>なし、<td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr>、<tr><td>Tunicamycin</td><td>Tocris</td><td>3516</td><td></td></tr>、<tr><td>Zeta Viewソフトウェア</td><td>、Analytik</td><td></td><td>NTAソフトウェア</td></tr></tbody></table>

馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

細胞外小胞(EV)は、すべての細胞から放出され、すべての生体液に存在し、それらが由来する親細胞を反映するタンパク質、核酸、および脂質を含むナノサイズの脂質膜結合構造です。サンプル中の他の成分からEVを適切に分離することで、関連する貨物の特性評価が可能になり、多くの疾患の細胞間コミュニケーターおよび非侵襲的バイオマーカーとしての可能性についての洞察が得られます。現在の研究では、希突起膠細胞由来のEVを、限外ろ過やサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などの最先端技術を組み合わせて細胞培養培地から単離し、EVを他の細胞外タンパク質やタンパク質複合体から分離しました。市販のSECカラムを用いて、コントロールおよび小胞体(ER)ストレス条件下の両方でヒト希突起膠腫細胞から放出された細胞外タンパク質からEVを分離しました。標準的なEVマーカーCD9、CD63、およびCD81は、画分1〜4では観察されましたが、画分5〜8では観察されませんでした。ゴルジ体のタンパク質であるGM130とERの内在性タンパク質であるカルネキシンを陰性のEVマーカーとして使用し、どの画分にも観察されませんでした。また、EV画分として画分1〜4、タンパク質画分として画分5〜8をプール濃縮した場合、EV画分におけるCD63、CD81、およびCD9の発現は認められなかった。GM130またはカルネキシンの発現は、いずれの画分タイプにおいても観察されなかった。対照およびERストレス条件の両方からのプールされた画分を透過型電子顕微鏡で視覚化し、小胞はEV画分で観察されたが、タンパク質画分では観察されなかった。両方の条件からのEVおよびタンパク質画分中の粒子も、ナノ粒子追跡分析で定量化されました。まとめると、これらのデータは、SECが馴化細胞培養培地からEVを分離するための効果的な方法であることを示しています。

ウェスタンブロッティングにより、EVとCCMの適切な分離が明らかになりました 細胞培養培地からEVを分離するためのSECの有効性を評価するために、対照サンプルからの個々の画分を使用してウェスタンブロットを実行し、ネガティブコントロールとして使用された3つの標準的なEVマーカー、CD9、CD63、CD81、およびGM130およびカルネキシン18の発現を調べました(図3)。アルブミン発現18 も、CCM中の細胞外タンパク質がEVから適切に分離できることを確認するためにプローブされました。CD9、CD63、およびCD81の強い発現は画分1〜4で観察され、画分5〜8ではほとんどまたはまったく発現が見られませんでした。GM130もカルネキシンもどの画分でも観察されなかった。アルブミンは画分6〜8にのみ存在した。まとめると、これらのデータは、小胞が主に画分1〜4に溶出し、画分5〜8に細胞外タンパク質が含まれていることを示しています。このため、画分1〜4を結...

ここでのプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を馴化細胞培養培地から適切に分離できることを示しています。

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

細胞外小胞をコンディション細胞培養培地のような液体から分離することで、研究者は小胞貨物の特性評価を行い、細胞内コミュニケーションメカニズムを探索することができます。この技術により、馴化細胞培養培地からEVと細胞外タンパク質を十分に分離することができ、簡単で使いやすいものになります。まず、PBSを摂氏37度の水浴に入れます。コントロールおよびツニカマイシン処理された細胞培養フラスコを、10 xおよび100 x対物レンズを備えた複合顕微鏡で観察します。フラスコ間の違いをメモします。フラスコから培地を取り出し、50ミリリットルのチューブに入れます。次に、チューブを摂氏4度で5分間500Gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。チューブを2000Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。4つの15ミリリットル3キロダルトンカットオフ限外ろ過ユニットを取り、各チューブに5ミリリットルのPBSを追加します。ユニットを4, 000 Gで摂氏4度で10分間遠心分離して、フィルターをプライミングします。ユニットからPBSを除去した後、対照および処理条件からの上清を、それぞれ約12.5ミリリットルの培地を含む2つの限外ろ過ユニットに分割します。チューブを摂氏4度で1時間45分間、または各ユニットの濃縮培地または保持液が250マイクロリットル以下に濃縮されるまで、チューブを4, 000 Gで遠心分離します。両方のコントロールユニットからラベルの付いた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに保持液を移し、処理されたユニットから別のチューブに移します。各マイクロ遠心チューブ内の保持液の総容量を測定します。容量が500マイクロリットル未満の場合は、最終容量が500マイクロリットルになるまで0.22ミクロンのろ過PBSを追加します。チューブをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。自動フラクションコレクターまたはAFCをオンにします。カラムを摂氏4度から取り外し、カラムを室温まで温めます。マイナス80°Cの冷凍庫から保持液サンプルを取り出し、氷の上に置いて解凍し、待っている間、蓋を内側に向けてAFCカルーセルにラベルの付いた1.5ミリリットルのチューブを8本セットします。バーコードをリーダーに向けてカラムをAFCに挿入し、設定を調整して、それぞれ500マイクロリットルの8つの画分を収集し、バッファー量をデフォルトにします。次に、画面の指示に従ってコレクションを開始します。貯蔵バッファがカラムマトリックスの上部に完全に吸収された後。カラムに15ミリリットルのPBSを加えて、カラムのフラッシュを開始します。PBSを追加するのは早すぎます。保存バッファが希釈され、適切なフラッシングが妨げられるためです。15ミリリットルのPBSがすべてマトリックスに吸収される直前に、[OK]をクリックしてフラッシングを停止し、マイクロピペットでカラムマトリックスの上部から残留PBSを取り除きます。マトリックスには触れないでください。カラムの中央に500マイクロリットルのサンプルを追加し、[OK]をクリックして実行を開始します。サンプルがマトリックスに完全に吸収されたら、すぐに8ミリリットルのPBSをカラムに加えます。AFCは、それぞれ500マイクロリットルの8つの画分をすべて収集する前に、ボイドボリュームをカルーセルの中心に自動的に払いのけます。実行後、カルーセルからフラクションを取り出し、氷の上に置きます。次に、カルーセルの中心からボイドボリュームを削除します。次に、10ミリリットルのPBSをカラムに追加して、カラムから残っているサンプルを洗い流します。そして、悔い改めたサンプルが完全に洗い流されたら、15ミリリットルのPBSをカラムに加えます。最終的なPBSがマトリックスに吸収されるので、カラムのマトリックスの中心に500マイクロリットルの0.5モル水酸化ナトリウムを加えます。次に、水酸化ナトリウムが吸収されたら、30ミリリットルのPBSをカラムに加え、洗い流します。すべてのサンプルが終わったら、15ミリリットルの0.05%アジ化ナトリウムをカラムに追加して、後で使用するためにカラムを保存します。カラムマトリックスの上部に約5ミリリットルのアジ化ナトリウムを残します。AFCからカラムを取り外し、上部と下部のキャップを取り付けてから、カラムを摂氏4度に配置して保管します。限外ろ過ユニットを構築します。サンプルあたり2ミリリットル、3キロダルトンのカットオフウルトラフィルトレーションユニットを入手してください。各ユニットは、コーン、フィルター、フロースルーシリンダーの3つの部分で構成されています。各パーツに適切なラベルを付けます。フィルター部分に1ミリリットルのPBSを追加し、コーンピースでキャップします。限外ろ過ユニットコーン側を3, 500Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、ろ過されたPBSをフロースルーシリンダーから取り出します。限外ろ過ユニットを逆さまにし、摂氏4度で1000 Gで2分間遠心分離して、残っているPBSを取り除きます。各画分の4つの500マイクロリットルを混ぜ合わせ、それらを限外濾過装置に加える。次に、遠心分離機カラムを摂氏4度で3, 500 Gで1時間45分、または保持液レベルが100マイクロリットルになるまで一致させます。シリンダーを通る流れを取り除き、流れを捨てます。限外ろ過ユニットを逆さまにし、摂氏4度で1000XGで2分間遠心分離します。コーン内の保持液を1.5ミリリットルのチューブに移し、0.22ミクロンのろ過PBSでサンプル量を150マイクロリットルにしてから、チューブを摂氏マイナス80度の冷凍庫に入れます。個々の画分の代表的な西部ブロックは、CD9、CD63、およびCD81の強い発現を示した。1 から 4 の違反 式がほとんどまたはまったくない 5 から 8 の違反。GM130またはカルネキシンの発現は、いずれの画分においても観察されなかった。アルブミンはフラクション6〜8にのみ存在していました。EVおよびタンパク質画分を濃縮することの有効性も評価した。CD9およびCD63の発現は、細胞溶解物において観察された。3つのCDタンパク質はすべて、コントロールおよびツニカマイシン処理サンプルのEV画分には存在していましたが、タンパク質画分には存在しませんでした。腫瘍感受性遺伝子101は細胞溶解物中に存在したが、EVまたはタンパク質画分には存在しなかった。GM130とカルネキシンは細胞溶解物でのみ観察されました。エキソソーム枯渇細胞培養培地のウェスタンブロットでは、EVマーカーは細胞溶解液には存在しましたが、培地サンプルには存在しませんでした。アルブミン発現はタンパク質画分において観察され、細胞溶解物では最小限の発現が観察された。TEM観察は、対照およびツニカマイシン処理サンプルのEV画分に球状構造を示しました。これらの構造は、いずれのサンプルタイプのタンパク質画分においても観察されなかった。ナノ粒子追跡分析は、対照と比較してEV画分における対照および処理画分の粒子濃度の違いを明らかにし、わずかに多くの粒子がツニカマイシン処理中に存在した。しかし、タンパク質画分では、EVに比べて検出される粒子が少なかった。異なる処理からのEVを簡単に比較できるように、対照条件と処理条件のサンプル量を同じにすることが重要です。コンディション細胞培養培地からEVを分離した後、プロテオミクスRNAシーケンシングとリピドミクスを使用して、小胞のタンパク質、RNA、脂質含有量を特徴付けることができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: ワトソン、DC 他。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。...

サイズ排除クロマトグラフィーを用いた細菌の細胞外小胞の単離 

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SEC法によるミクログリア由来の細胞外小胞の単離:ミクログリア馴化培養培地から細胞外小胞を単離する技術

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サイズ排除クロマトグラフィーに基づく細菌細胞外小胞の分離:グラム陰性細菌外膜小胞の不均一集団をそのサイズに基づいて分離する技術

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細菌性小胞は病因において重要な役割を果たし、有望なバイオテクノロジーの応用を有する。小胞の不均一性は分析と使用を複雑にします。したがって、小胞の様々なサイズを分離する簡単で再現可能な方法が必要です。ここでは、...

細菌外膜小胞ヘテロジネミティーを分析するサイズ排除クロマトグラフィー

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二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

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細胞外小胞単離のための適切なソーティングの設定

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学ぶサイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞の分離法。培養細胞からEVを効率的に抽出し、CDマーカー解析で品質を確認。細胞間情報伝達メカニズムの研究に応用可能です。

馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

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