末梢神経工学のためのグラフェンベースの3Dバイオハイブリッドヒドロゲルバイオインクの調製と特性評価

幹細胞系はその重要な構成要素の影響下にあります。幹細胞の保存と分化は、それらの微小環境の存在なしには考えられません。幹細胞ニッチと呼ばれるこの微小環境は、細胞と足場で構成されています。

末梢神経障害は、腕神経叢の損傷、種々の外傷、腫瘍、自律神経異常、免疫定義、および代謝性疾患などであり得る。幹細胞により良い、より自然なニッチを提供するために、さまざまな3D培養方法が開発されています。スフェロイド形成と3Dバイオプリンティングは、3D培養のための比較的新しく有望な方法です。

3Dバイオプリンティングは、神経工学研究にも使用できます。その結果、この研究では、グラフェンベースおよびアルギン酸塩/ゼラチンベースのバイオインクが開発され、それらの再生特性について研究されました。まず、ウォートンゼリー間葉系幹細胞またはWJMSCSを、10%ウシ胎児血清またはFBS、1%ペン/連鎖球菌、および1%L-グルタミンを含むDMEM F12培地で、室温の滅菌層流下で培養します。

培養細胞がフラスコ内で80%コンフルエントになったら、培地を注ぎ、5ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。次に、5ミリリットルの0.25%トリプシンと2.21ミリモルのナトリウムEDTAを加え、摂氏37度でインキュベートします。5分後、10%FBSを含む10ミリリットルのDMEM F12培地を細胞に加えます。

細胞を懸濁し、培地を集めて遠沈管に移します。次に、細胞を遠心分離し、上清を廃棄してから、10%FBSを含む新鮮な栄養培地を入れた新しいフラスコに細胞を再播種します。グラフェンなしで対照群のバイオインクを調製するには、4.5ミリグラムのアルギン酸塩と1.5ミリグラムのゼラチンを量り、それらを遠沈管に移します。

次に、10%FBSを含む50ミリリットルのDMEM F12培地をチューブに追加します。繰り返しますが、4.5ミリグラムのアルギン酸塩と1.5ミリグラムのゼラチンを量り、それらを遠沈管に移します。次に、50マイクロリットルの0.1%グラフェンをチューブに加え、10%FBSを含むDMEM F12培地で容量を50ミリリットルにします。

バイオインクをピペッティングとボルテックスで混合してから、摂氏121度、1.5度でオートクレーブ滅菌します。20分間大気圧。オートクレーブ処理後、溶液を遠心分離して形成された気泡を除去し、細胞が調製されるまでバイオインクを摂氏37度に置きます。

細胞バイオインク相互作用のために、バイオインクグループを作成します。グループ1には、バイオプリンティング用のバイオインクで印刷された3D-Bおよび3D-Gが含まれます。グループ2には、バイオプリンティング後にスフェロイドが形成された3D-BSおよび3D-GSバイオインクが含まれます。

グループ1の場合、0.5ミリリットルの培地で細胞を1つずつ10から7番目のセルまで数えます。次に、4.5ミリリットルのバイオインクを加えます。注射器を使用して混合物を滅菌キャビネット内のカートリッジに移します。

バイオプリンターの対応する押出機セクションにカートリッジを取り付けます。2番目のグループでは、各バイオインクグループから5ミリリットルのバイオインクを取り出し、インジェクターの助けを借りて滅菌カートリッジに移します。2つの同軸プリントヘッドと空気圧駆動の押出技術を備えたバイオプリンターを使用してください。

マイクロステップあたりのXYZ解像度を1.25マイクロメートル、押し出し幅を400マイクロメートル、押し出し高さを200マイクロメートルに設定します。20 x 20 x 5 mm のグリッドを使用して 3D モデルを作成します。オープンソースのWebベースのCADプログラムを使用して3Dモデルを作成します。

3Dバイオプリンティングプロセスでは、プリンタの平均圧力を7.5psiに設定します。次に、カートリッジとベッドの温度を摂氏37度に設定し、速度を60%に設定します。 書き込みフェーズ中は、システムをホームポジションに置きます。軸を自動的に配置し、バイオプリンティングプロセスを開始する前に押出機を選択して設定します。

印刷後、サンプルを取り出し、層流キャビネットの下に置きます。次に、バイオインクに0.1の通常の塩化カルシウム溶液をスプレーするか、室温でピペットで1ミリリットルの溶液を加え、10〜20秒待ちます。次に、印刷されたパターンをカルシウムとマグネシウムを含むPBSで2回洗浄します。

バイオインクグループを含む各細胞の上に10%FBSを含む2ミリリットルのDMEM F12培地を加え、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で30分間インキュベートします。次に、各群に6番目の細胞に1×10を含む2ミリリットルの懸濁液を加え、プレートをインキュベートする。24時間後、対照群を除くWJMSCsニューロン様細胞への分化のためのスフェロイド形成のためのバイオインクのすべてのバッチを倒立顕微鏡下で観察および写真撮影する。

ウェルあたり2ミリリットルの神経原性分化培地を追加し、2日ごとに更新します。神経分化を観察するために7日間追跡します。次に、タイムラプスイメージングを使用して、幹細胞に対するグラフェンの影響を調べ、バイオインク内の細胞相互作用を監視します。

細胞増殖に対するグラフェン濃度の影響はここで実証されています。対照と比較して、0.001%グラフェン濃度について有意な低下が認められた。他の群と対照との間に有意差はなかった。

細胞グラフェン相互作用は、グラフェンが2Dシステムで許容され、エンドサイトーシスを介して細胞によって取り込まれることを示しました。タイムラプスイメージングは、3Dグラフェン培地で生き残った細胞が、インキュベーションが終了するまでGFP輝度によって活力を維持することを示しました。3D-Bおよび3D-GバイオインクグループのSEM画像とFIIR分析を以下に示します。

バイオインク細胞の相互作用は、表面と内部の両方で実証されました。細胞は形態学的に丸く、材料に付着していた。3次元神経分化では、両群のスフェロイド細胞の境界は透明で生き生きとしており、グラフェン群のスフェロイドは比較的大きく、グラフェンを細胞内に閉じ込めていると考えられていました。

2Dおよび3D細胞の免疫染色をここに示します。緑色の画像はニューロン様構造を表す。2Dポジティブコントロールサンプルは、3Dサンプルよりも少ないニューロン様構造マーカーを発現しました。

グラフェンベースのバイオインクは、幹細胞のニューロン様細胞への分化に関してより成功していることを発見しました。我々は、グラフェンベースのバイオインクが、さらなる研究において末梢神経障害の治療のための優れたツールとなることを提案する。今日、幹細胞システムは、天然および合成生体材料を用いた組織工学によって作成することができ、これらの組織の再生に使用することができる生体組織を置き換えることができる人工組織の作成、損傷の除去、および機能の提供は、組織工学によって提供される。