簡単で費用対効果の高いDNA単離法を用いたループス発生マウスの糞便微生物叢動態の解析(英語)
2022年5月2日
このプロトコルは、自己免疫疾患の発症中のマウス腸内細菌叢の変化を分析するためのシンプルで費用効果の高いDNA単離方法を提供します。
提案されたDNA単離法は、自己免疫疾患マウスモデルにおける腸内細菌叢の動態を研究するのに役立ちます。市販のキットに匹敵する糞便サンプルからDNAを取得するために、より用途が広く、費用効果が高く、効率的な方法が提案されています。まず、各マウスをケージから個別に取り出し、肛門から直接糞便ペレットを収集し、処理されるまで摂氏マイナス80度で保管します。
滅菌済みの清潔な鉗子、チューブ、手袋でサンプルを処理します。冷凍ペレットを事前に計量した2ミリリットルのスクリューキャップチューブに追加し、糞便ペレットあたり0.02〜0.05グラムの糞便重量をグラム単位で記録します。ペレットに、0.1ミリメートルのガラスビーズ、500マイクロリットルの溶解バッファー、および200マイクロリットルの20%ドデシル硫酸ナトリウムの薄層を加える。
ビーズをホモジナイザーで4分間チューブを叩き、続いて3〜5分間ボルテックスします。チューブを短時間遠心分離して、気泡や泡を取り除きます。微生物叢サンプルからDNAを抽出するには、350マイクロリットルのサンプル上清を、破片のない新しい1.5ミリリットルのスナップキャップチューブに移します。
500マイクロリットルのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを25:24:1の比率で加え、1分間ボルテックスします。遠心分離後、180マイクロリットルの上部水相を新しい1.5ミリリットルのスナップキャップチューブに移します。180マイクロリットルのクロロホルムを加え、反転させて混合する。
これから、180マイクロリットルの水相を新しいスナップキャップチューブに移します。バイオセーフティキャビネットに、180マイクロリットルの冷たいイソプロパノールと36マイクロリットルの5モル酢酸アンモニウムを加えます。数回ひっくり返して混ぜ、チューブを氷の上に20分間置きます。
上清を捨て、500マイクロリットルの冷70%エタノールでペレットを数回洗浄した。上清を捨て、ペレットが透明になるまで、ティッシュペーパー上でチューブを逆さまにして20分間風乾します。ペレットを50マイクロリットルの分子グレードの水に懸濁し、液体を摂氏37度で10分間加熱して、大きなDNAペレットを完全に溶解します。
加熱後、これらのチューブを3、400倍Gで1分間遠心分離し、蓋から凝縮液滴を回収する。濃度を測定し、分光光度計を用いて260/280比を求めた。良質のDNAの比率は、一般的に1.8から2の間です。
調製したサンプルを室温で600倍Gで1分間遠心分離した後、マイナス80°Cで24時間凍結します。次に、1マイクロリットルあたり1〜50ナノグラムの濃度の20マイクロリットルのサンプルを、シーケンシングのためにアルゴンヌ国立研究所に送ります。受容体CX3CR1を欠くマウス系統は、野生型MRL/LPRと比較して異なる腸内細菌叢組成を有し、MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFPマウスは、特定の属において有意差を示し、プロテオバクテリア門におけるもののような潜在的に病原性細菌に関連する。
サンプルの汚染に注意してください。それは無菌である必要があります。また、上清を新しいチューブに移す際にも、正確にピペッティングすることが重要です。
この方法は、PCR、制限酵素消化、ゲノムライブラリ構築などの分子解析に適しています。狼瘡では、腸内細菌叢と狼瘡の進行との間に強い関係があることが証明されました。
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概要
本プロトコルでは、自己免疫疾患の発症過程におけるマウス腸内細菌叢の変化を解析するための、簡便かつ費用対効果の高いDNA分離法を提供します。この手法は、自己免疫疾患のマウスモデルにおける腸内細菌叢のダイナミクスを研究するために設計されています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 微生物学
- 自己免疫
背景
- 自己免疫疾患の研究において、腸内細菌叢を理解することは極めて重要です。
- 現在のDNA抽出法は、費用が高く複雑な場合があります。
- 本研究では、より効率的で費用対効果の高い代替法を提案します。
- 細菌叢の変化を分析するために、糞便サンプルを使用します。
研究目的
- 糞便検体からDNAを抽出するための信頼性の高い手法を提供すること。
- 自己免疫疾患モデルにおける腸内細菌叢の研究を促進すること。
- 新手法の効率を市販のキットと比較すること。
使用した手法
- マウスからの糞便ペレットの個別回収。
- サンプルを-80 degrees Celsiusで保存。
- サンプル処理への滅菌器具の使用。
- 溶解バッファーおよびガラスビーズを用いたサンプルの調製。
主な結果
- 提案された手法は、市販のキットに匹敵するDNA品質を実現します。
- 微生物叢解析において、費用対効果が高く効率的です。
- 自己免疫疾患のメカニズムに関するさらなる研究を促進します。
結論
- このDNA抽出法は、研究者にとって有用なツールとなります。
- 疾患における腸内細菌叢の解析を支援します。
- 自己免疫分野における、よりアクセシブルな研究を促進します。
よくある質問
業界における実用的な関連性
自己免疫疾患モデルにおける腸内細菌叢ダイナミクスの信頼性の高い解析は、疾患の進行に対する環境的および遺伝的寄与を理解するために極めて重要です。この費用対効果の高いDNA抽出プロトコルにより、マウスの糞便検体から微生物DNAをスケーラブルかつ再現性高く抽出することが可能となり、前臨床研究におけるハイスループットなマイクロバイオーム研究を支援します。本手法は、細菌叢の変化と自己免疫表現型を関連付ける予測の信頼性を高め、早期発見およびトランスレーショナル戦略に寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 疾患に関連するマウスモデルにおいて、微生物叢と免疫系の相互作用の解析を可能にする。
- 腸内細菌叢の組成に影響を受ける候補経路の機能的な検証をサポートする。
- 微生物叢の変化と自己免疫疾患の進行を関連付けることで、メカニズム面でのリスク低減を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 後続のシーケンシングおよび分子アッセイに向けた、標準化され再現性のあるDNAサンプルを提供します。
- PCRおよび次世代シーケンシングワークフローに適した、定量的で高品質なDNAを確保します。
- 実験コホート間での比較マイクロバイオーム研究に向けた、拡張可能なサンプル処理を可能にします。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 前臨床段階の微生物相プロファイリングを、疾患の進行およびバイオマーカー探索の取り組みと整合させます。
- 探索段階での知見から、自己免疫モデルにおけるトランスレーショナルな検証までの連続性をサポートします。
- 環境的トリガーと疾患表現型を関連付ける際の生物学的な曖昧さを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このDNA抽出プロトコルは、初期探索から前臨床段階までの連続的なプロセスに適合しており、ループス好発マウスモデルにおける堅牢なマイクロバイオーム解析を可能にし、リード化合物の特定やメカニズム研究を支援します。
- 探索生物学：自己免疫疾患における微生物叢主導の免疫調節に関する仮説検証を促進します。
- スクリーニング：シーケンシングベースのマイクロバイオームプロファイリングに不可欠な、再現性のある定量的なDNA出力を提供します。
- 分析：遺伝子型間または治療間の微生物コミュニティの変化を統計的に比較するための高品質な入力データを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床段階のマイクロバイオーム研究の結果を、自己免疫疾患における潜在的なバイオマーカー開発へとつなげます。
- 企業の再利用：多様なマウスモデルや実験計画に適応可能な、スケーラブルで費用対効果の高いプロトコルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：微生物叢と疾患の関連性およびターゲット検証における予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：DNA抽出を標準化し、研究間での再現性と拡張性を向上させます。
- 戦略的価値：疾患メカニズムに対するマイクロバイオームの寄与を明確にすることで、根拠に基づいたゴー/ノーゴー判断を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：自己免疫疾患のパイプラインにおいて、リスク調整後のマイクロバイオーム調節介入の優先順位付けを支援します。
実施上の留意点
- 無菌的なサンプルハンドリングおよび分子生物学的なワークフローに関する専門的な技術知識が必要です。
- 品質管理のために、ホモジナイザー、遠心分離機、および分光光度計へのアクセスが必要です。
- コンタミネーションおよびばらつきを最小限に抑えるため、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- さまざまなマウスモデルに適応可能ですが、サンプルタイプによって最適化が必要な場合があります。
- データの完全性を確保するため、正確なピペッティングおよび無菌操作に依存します。
