Name: エクソソームベースのドーパミンキャリアシステムの定式化と特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 学ぶドーパミン負荷エクソソームの調製法と特性評価。ワートンジェリー由来間葉系幹細胞からエクソソームを分離し、ドーパミンを封入して細胞毒性を評価する神経科学における創薬デリバリーシステムの新たなアプローチです。

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この研究は、主にユルドゥズ工科大学科学研究プロジェクト(TSA-2021-4713)から提供された研究資金によって支援されました。

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料および機器に関連する詳細については、 部品表 を参照してください。
1. ウォートンゼリー間葉系幹細胞の培養・凍結保存
<ol><li>WJ-MSC(ATCC製)を-80°Cの冷凍庫から取り出します。10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM-F12培地を含むフラスコに細胞を播種します。5%CO2を含むインキュベーターで37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>培地は2日ごとに交換してください。細胞が80%のコンフルエントに達したら継代します。継代する細胞を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。 注:トリプシンを添加する前にPBSで洗浄すると、フラスコ表面から細胞を簡単に分離できます。</li>
	<li>PBSを除去し、フラスコに5 mLのトリプシン-EDTA溶液を加えます。フラスコを5%CO2を含むインキュベーターで37°Cで5分間インキュベートします。</li>
	<li>上清をチューブに集め、1,500 x g で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより1mLのDMEM-F12 + 10% FBSをチューブに加えます。</li>
	<li> </li></ol><ol><li> </li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63624/63624fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63624/63624fig01large.jpg" target="_blank"></a><ol><li> <ol><li><li><li><li></li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li><li> </li><li> </li></ol><ol><li> <ol><li></ol></li><li> <ol><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li></li><li></li></ol><ol><li> <ol><li> </li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63624/63624eq01.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li><li> <ol><li><li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63624/63624eq02.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li></li><li><ol><li></li></ol></li><li><li></li></ol></li><li> <ol><li><li> </li></ol></li></ol>

著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

エキソソームは、ほとんどの細胞タイプ(MSC1など)から分泌される40〜200nmの寸法の小さな膜小胞です。細胞間のコミュニケーションを可能にすることができるエクソソームは、エンドサイトーシス、食作用、ミクロピノサイトーシス、脂質媒介性内在化、融合など、さまざまな方法で細胞に侵入することができます33,44。他のナノキャリア系と比較して、エクソソーム表面に見られる脂質とコレステロールは、親水性と疎水性の両方の分子を運ぶ能力を与え、コレステロール末端の水素結合により、タイトなパッケージングが可能になります45。
本研究では、MSC由来のエクソソームの単離、薬物負荷実験、および細胞毒性アッセイを実施しました。エクソソームは、細胞間のカーゴやコミュニケーションなどの重要な機能に加えて、神経新生、特に脳において重要な役割を担っていることが知られている<sup class="xre...

重要な特徴を持つ生理活性小胞であるエクソソームは、40nmから200nmまでの大きさです。エクソソームは細胞膜に由来し、エンドソーム1の放出によって形成される。これらの構造は、細胞間コミュニケーターとして機能し、隣接する細胞と相互作用して活性分子の移動を促進します。エクソソームは、多くの異なる供給源から単離することができます。これらには、血漿、尿、脳脊髄液、唾液などの体液、および in vitro 条件下で培養された細胞株が含まれます。エクソソームは、脂質、タンパク質、核酸などの生体高分子を含むため、神経損傷の除去に重要な役割を果たします2。神経系の支持細胞であるグリアは3、エクソソーム を介して タンパク質やマイクロRNAをニューロンの軸索に伝達します4。
神経伝導の特徴であるミエリン鞘を形成する脂質も、エクソソームを介してオリゴデンドロサイトから放出される4,5。エクソソームは、シナプス可塑性、ニューロンストレス応答、細胞間コミュニケーション、脳内のニューロン新生などのプロセスにも関与しています6,7。エクソソームはナノ次元を持っているため、BBBを通過することができます。この膜8を貫通した後、間質液から脳脊髄液への特別な移行経路がある。エクソソームは、その表面特性により、薬物送達システムとして標的細胞と効率的に相互作用し、負荷された薬物を能動的に送達することができます。
エクソソームの表面には様々な接着性タンパク質(テトラスパニンおよびインテグリン)が発現しているため、これらの細胞外小胞は宿主細胞膜と容易に相互作用し、融合することができる9。エクソソームは、BBBに浸透する能力とその表面特性により、特に中枢神経系疾患の治療において、薬物送達システムとして使用できると考えられています。間葉系幹細胞(MSC)由来のエクソソームは、同種細胞療法と比較して免疫拒絶反応のリスクが低く、この点で、無細胞治療アプリケーションの重要な要素となり得る10。
ドーパミンは、脳内の欠乏がパーキンソン病(PD)の特徴である分子であり、日々悪化します11,12,13。PDは、中脳の黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの変性および運動ニューロン機能の喪失と関連していることが知られている14,15。ドーパミン作動性ニューロンの死は、神経伝達物質ドーパミンの脳線条体への供給を妨げる。その結果、PD特異的な症状が出現する16。PDのこれらの症状は、運動緩慢、姿勢の不安定性、硬直、特に安静時の振戦です12,13。パーキンソン病は2世紀以上前に初めて記述されたが、この疾患の病理学と病因を理解するための研究はまだ進行中であり、現在、パーキンソン病は複雑な全身性疾患であることが認められている17。ドーパミン欠乏症が起こり、神経細胞の80%以上が変性すると臨床的PD症状がみられると予測されている18。この疾患の治療では、運動症状を軽減するために不完全なドーパミン補給が好まれます。In vivo研究では、ドーパミンを脳に直接注入すると、動物の症状が大幅に軽減されることが示されています19。L-DOPA(L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン)やドーパミン受容体薬などのドーパミン前駆体は、ヒトでは脳へのドーパミンの直接注入が不可能であり、体内に入るドーパミンがBBB20を通過できないため、診療所で使用されています。これらのタイプの薬は、時間の経過とともに効果を失います。したがって、疾患の病態生理を明らかにし、PDの患者への影響を軽減するために、新しい治療戦略と治療法を開発することが非常に必要です。
近年、エクソソームを用いた研究は、神経系疾患の治療法と病態の双方に関する情報収集として注目されています。MSC由来のエクソソームは、神経損傷の炎症を軽減し、神経細胞の再生に寄与することが示されています21,22,23。さらに、MSC由来のエクソソームセクレトームは、特にドーパミン作動性ニューロンに対して神経栄養作用および神経保護作用を示すことにより、アポトーシスを減少させることが報告されています24,25。近年、エクソソームを治療用薬物送達システムとして用いるプラットフォームの研究が加速しています。多くの研究において、関連する薬物はエキソソームに容易にカプセル化され、標的細胞、組織、および臓器に安全に送達できることが観察されています26,27。インキュベーション、凍結/融解サイクル、超音波処理、および押出成形などのさまざまな方法を、エキソソームへの薬物ローディングに用いることができる28。
エキソソームまたはエキソソーム様小胞とのコインキュベーションにより、親油性小分子をこれらの送達システムに受動的にカプセル化することができます28,29,30。特に、クルクミン31、カタラーゼ30、ドキソルビシン32、パクリタキセル33などの様々な分子がエクソソームに効果的にロードされました。抗酸化活性を持つカタラーゼ含有エクソソームは、脳内の神経細胞やミクログリア細胞に効率よく蓄積し、強い神経保護活性を示すことが観察されている30。同じ研究では、ローディング効率を高めるために複合体に添加されたサポニンは、インキュベーション中の薬物ローディング率を増加させることがわかりました30,34。しかし、エクソソームへの薬物負荷の基準を確立するには、さらなる研究が必要です。
本稿では、WJ-MSCから単離したエクソソームにドーパミンをカプセル化することで、ナノキャリアシステムを開発した。WJ-MSCの培養、エクソソームの単離と特性評価、薬物ローディング実験、さまざまな技術によるドーパミン負荷エクソソームの特性評価、 in vitro 細胞毒性分析など、すべてのステップが詳細に説明されています。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上mメンブレン</td><td>フィルターAisimo</td><td></td>滅菌<td>プロセス</td></tr><tr><td>0.45&microに使用されます。m シリンジフィルター</td><td>アイシモ</td><td></td><td>滅菌工程に使用</td></tr><tr><td>15mL ファルコンチューブ</td><td>ネスト</td><td></td><td>細胞培養工程に使用</td></tr><tr><td>25cm2 細胞培養フラスコ(ファルコン、TPP組織培養フラスコ</td><td>ネスト</td><td></td><td>細胞培養工程に使用</td></tr><tr><td>50mL ファルコンチューブ</td><td>ネスト</td><td></td><td>細胞培養工程</td></tr><tr><td>に使用75 cm2細胞培養フラスコ(ファルコン、TPP組織培養フラスコ</td><td>ネスト</td><td></td><td>細胞培養ステップで使用</td></tr><tr><td>96ウェルプレート(ファルコン、TPPマイクロプレート)メル</td><td>クミリポア</td><td></td><td>細胞培養ステップで使用</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>シグマ</td><td>271004-1L</td><td>HPLC分析に使用</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>NUVE-OT 90L</td><td></td><td>滅菌プロセスに使用</td></tr><tr><td>セル培養キャビン</td><td>Hera Safe KS</td><td></td><td>細胞培養プロセスに使用</td></tr><tr><td>遠心</td><td>日立</td><td>CF16RN</td><td>エクソソーム分離ステップに使用</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター Safe Cell UV付き</td><td>パナソニック</td><td></td><td>細胞培養プロセスに使用</td></tr><tr><td>ドーパミン塩酸塩 H8502-10G</td><td>Sigma</td><td>H8502-10G</td><td>エクソソームドーパミンローディング</td></tr><tr><td>に使用ダルベッコ改変イーグルス培地/栄養混合物-F12</td><td>シグ</td>マ<td>RNBJ7249</td><td>細胞培養培地として用いた</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清-FBS</td><td>カプリコーン</td><td>FBS-16A</td><td>細胞培養培地に添加して使用しました。</td></tr><tr><td>冷凍庫-80°;C</td><td>パナソニック</td><td>MDF-U5386S-PE</td><td>細胞および得られたエクソソームの保存に</td></tr><tr><td>パナソニック 冷蔵庫</td><td></td><td>パナソニック MPR-215-PE</td><td>細胞培養物および他の材料の保存に使用</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー-HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>得られた製剤の含有量からドーパミンの存在を調査した。</td></tr><tr><td>顕微鏡 - Primovert</td><td>Zeiss</td><td></td><td>細胞培養中の細胞を観察するために使用されます。</td></tr><tr><td>MTTアッセイ</td><td>Biomatik</td><td></td><td>細胞生存率の測定に使用</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern panalytical</td><td>マルバーンpanalytical</td><td>エキソソームの特性評価に使用</td></tr><tr><td>Optima XPN-100 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>エキソソーム分離ステップに使用</td></tr><tr><td>PBS錠剤</td><td>Biomatik</td><td>43602</td><td>PBS溶液の調製に</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>Capricorn</td><td>PB-S</td><td>細胞培養における汚染を防ぐために培地に添加しました。</td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>Isolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision balance-Kern</td><td>Kern-ABJ220-4NM</td><td></td><td>溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td>Qsonica, LLC</td><td></td><td>HPLC分析でエキソソームを消化するために使用</td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ</td><td>47036-50G-F</td><td>エキソソームドーパミンローディングプロセスで全溶液に添加して使用しました。</td></tr><tr><td>Spectrostar-Nano-Spectrophotomettry</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td>MTTおよび薬物放出分析に使用</td></tr><tr><td>SPSS 22</td><td></td><td></td><td>統計パッケージプログラム</td></tr><tr><td>Vorteks-FinePCR</td><td>FinePCR-FineVortex</td><td></td><td>溶液を均一に混合するために使用される</td></tr><tr><td>ウォーターバス 37 >C-Senova</td><td>Senova</td><td></td> 細胞<td>培養ステップで使用される</td></tr><tr><td>Wharton'ゼリー間葉系幹細胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼータサイザー</td><td>Malvern Nano ZS</td><td>Malvern Nano ZS</td><td>エクソソームの特性評価に使用</td></tr></tbody></table>

エクソソームベースのドーパミンキャリアシステムの定式化と特性評価

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

サイズが40〜200nmのエクソソームは、細胞外小胞の最小サブグループを構成します。細胞から分泌されるこれらの生理活性小胞は、細胞間のカーゴやコミュニケーションに積極的な役割を果たしています。エクソソームは、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、初乳、母乳、関節液、精液、胸膜などの体液に多く含まれています。エクソソームは、その大きさから、血液脳関門(BBB)を通過できることから、中枢神経系疾患において重要な役割を担っているのではないかと考えられます。そこで本研究では、ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC)から単離したエクソソームにドーパミンを内包することで、エクソソームを用いたナノキャリアシステムの開発を目指しました。特性評価プロセスに合格したエクソソームをドーパミンとインキュベートしました。ドーパミンをロードしたエクソソームは、インキュベーションの最後に再特徴付けされました。ドーパミンをロードしたエクソソームを、薬物放出および細胞毒性アッセイで調査しました。その結果、ドーパミンがエクソソーム内にうまくカプセル化され、ドーパミンをロードしたエクソソームが線維芽細胞の生存率に影響を与えないことが示されました。

エクソソームの単離と特性評価 ウォートンゼリー幹細胞を培養し、培養が十分な密度に達したら、無血清培地中で48時間インキュベートします。インキュベーション終了後、上清を-20°Cで保存します。 回収した上清をPBSで希釈し、超遠心分離を行います(図1)。得られた溶液は、NTAおよびDLS分析によって分析されます。エクソソームは、0.22μmのフィルターを通すことで滅菌されます。得られたエクソソームの平均サイズは98nmと判定された(動画 1)。遠心分離終了時に約100億個のエクソソーム粒子が得られました。NTA分析とDLS分析で明らかになったナノ粒子の数は、互いに一致しています。さらに、WJ-MSCに由来するエクソソームのゼータ電位は-15.7mVと測定されました(図2 および 図3)。
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ここでは、ウォートンゼリー間葉系幹細胞から幹細胞の単離エクソソームをドーパミン負荷することで製剤を得ることを目指しました。エキソソームの単離と特性評価、得られたエクソソームへの薬物負荷、および開発された製剤の細胞毒性活性は、このプロトコルで説明されています。

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

エクソソームは、14〜200ナノメートルの大きさの細胞から分泌され、細胞内カーゴとコミュニケーションで分裂した小胞に反応し、細胞外小胞の最小のサブグループに到達します。エンドソームの分化の結果として形成されるエクソソームは、細胞膜に由来します。幹細胞は、骨髄や脂肪組織などのさまざまなソースから単離できます。しかし、成体組織乾燥幹細胞は免疫原性が高く、エクソソームの大きさから、血液脳関門を通過できるため、中枢神経系疾患において重要な役割を担っていると言われています。まず、播種したウォートンゼリー間葉系幹細胞を5ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、フラスコをインキュベーターに入れる前に、5ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を加えます。インキュベーション後、細胞を回収し、1, 500 Gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、10%FBSを含む1ミリリットルのDMEM-F12をチューブに加えます。培養細胞をPBSで洗浄します。洗浄後、無血清DMEM-F12培地を細胞に添加し、インキュベーターに入れます。エクソソームを単離するには、無血清培地を回収し、300 G、摂氏4度、10分間遠心分離します。上清を別のチューブに移し、より高速で連続遠心分離して処理します。最後の遠心分離後、上清をゆっくりと除去し、ペレットを1ミリリットルのPBSに溶解します。ボルテックスで混合し、110, 000 G で 4 °C で 70 分間超遠心分離を進めます。先ほど超遠心分離で採取したエクソソーム懸濁液に3ミリリットルのPBSを加え、希釈した懸濁液を0.22ミクロンのフィルターでろ過して滅菌します。次に、滅菌したエキソソーム懸濁液500マイクロリットルを別のチューブに移します。次に、500マイクロリットルの0.5ミリグラム/ミリリットルのドーパミン溶液とサポニンを滅菌懸濁液に加えます。インキュベーション後、懸濁液を超遠心分離します。このサンプルは、ドーパミンをロードしたエクソソームの特性評価のためにNTAおよびDLS分析に使用するか、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保存することができます。NTAの解析では、ウォートンゼリー由来のエクソソームの平均サイズは98ナノメートル、ドーパミンを充填したエクソソームの平均サイズは110ナノメートルと判定されました。NTA分析とDLS分析で明らかになったナノ粒子の数は、互いに一致していました。ウォートンゼリー由来のエクソソームのゼータ電位はマイナス15.7、ドーパミンをロードしたエクソソームのゼータ電位はマイナス17.6ミリボルトと測定されました。ドーパミンをロードしたエクソソームのHPLC分析により、6.45分にドーパミンのピークが検出されました。累積薬物放出プロファイルにより、カプセル化されたドーパミンの74.8%が最初の8時間以内にエクソソームから放出されたことが明らかになりました。線維芽細胞上のドーパミン負荷および遊離エクソソームの細胞毒性が調査されました。ドーパミンをロードしたエクソソームは細胞毒性効果を示さなかったが、サポニンは線維芽細胞の生存率を低下させた。MTTアッセイでは、線維芽細胞をドーパミンをロードしたエキソソームで処理すると、細胞生存率の向上が示されました。結果の統計的有意性は、一元配置分散分析を実行することによって評価されました。さらに、線維芽細胞に対するさまざまな濃度の遊離エクソソームの細胞毒性効果を調査しました。線維芽細胞の生存率は、25マイクロリットル/ミリリットルの濃度の遊離エキソソームで高かった。中枢神経系にとって本当に重要なのは、患者のサイズ、可塑性、神経反応、左右のコミュニケーション、脳内の神経新生などのプロセスにおける役割です。また、エクソソームの表面のおかげで、薬物中に送達された薬物や活性を標的細胞と相互作用させることが観察されているとのことです。本研究では初めて、幹細胞由来のエクソソームにドーパミンを内包した新薬製剤を開発しました。彼は、この製剤がパーキンソン病の治療に非常に有望であると提案しました。

formulating-characterizing-an-exosome-based-dopamine-carrier

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な...

同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

出典: Yavuz, B., et al.エクソソームベースのドーパミンキャリアシステムの定式化と特性化J. Vis.

ドーパミン負荷エクソソームキャリアシステムの定式化

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