Name: マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶマイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成法。ソフトハイドロゲル上に高忠実度のタンパク質微小パターンをワンステップで作成し、細胞クラスターの形状制御と牽引力測定の信頼性向上に貢献する革新的な細胞力学研究手法です。

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著者らは、ボストン大学機械工学科のPaul Barbone博士に、データ分析に関する有益な議論と支援に感謝したい。この研究は、NSF助成金CMMI-1910401によって支援された。

<ol><li>Pelham, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
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<li>Bhadriraju, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ROCK+by+RhoA+is+regulated+by+cell+adhesion%2C+shape%2C+and+cytoskeletal+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension.</a> Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).</li>
<li>Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+F-actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the F-actin cytoskeleton.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).</li>
<li>Ganz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+forces+exerted+through+N-cadherin+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Traction forces exerted through N-cadherin contacts.</a> Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).</li>
<li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cardiomyocyte+mechanosensing+by+crosstalk+between+integrins+and+hyaluronic+acid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors.</a> Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).</li>
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<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS One. 7 (2), 32572(2012).</li>
<li>Lavoie, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+actin-myosin-actin+connectivity+in+airway+smooth+muscle+as+a+treatment+for+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+traction+stresses+in+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying traction stresses in adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).</li>
<li>Halliday, N. L., Tomasek, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+extracellular+matrix+influence+fibronectin+fibril+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro.</a> Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).</li>
<li>Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+rubber+substrata%3A+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li>
<li>Aratyn-Schaus, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+complaint+matrices+for+quantifying+cellular+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173(2010).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+silicone+elastomeric+post+arrays+for+measuring+traction+forces+of+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).</li>
<li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li>
<li>Polio, S. R., Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li>
<li>Polio, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+control+of+multiple+cell+adhesion+molecules+for+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy.</a> Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
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<li>Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li>
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</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

PAAヒドロゲルを間接的にパターニングする改良された方法が、この論文に記載されている。このアプローチは、以前に20,35,36,37,38,39,40,41,42で使用されていた方法に基づいています。主な変化は、PDMSスタンプを使用してタンパク質を除去し、パターンを直接中間基板にスタンプするのではなく、中間基板上に所望のパターンを残すようになったことです。これにより、忠実度の高いマイクロパターンのより一貫した作成と、以前は2つの生産ステッ...

ほとんどの細胞表現型は、その環境に牽引力を発揮する。これらの牽引力は、アクチンおよびミオシンのネットワークである細胞の収縮性細胞骨格、ならびに他の糸状生体高分子および架橋タンパク質1、2、3、4によって生成される。細胞内で生成された力は、主にインテグリンおよびカドヘリンなどの膜貫通タンパク質を介して、細胞外環境または隣接する細胞に伝達され得る5、6。細胞がどのように広がり、収縮するか、およびそれらの動きに関連する牽引力の大きさは、その環境との親密な会話の結果であり、これは細胞外マトリックス(ECM)7,8に存在するタンパク質の種類と量、およびECMの剛性に大きく依存する。実際、牽引力顕微鏡は、基質の剛性、機械的応力やひずみ、または他の細胞との接触などの局所刺激に対する細胞の応答性を理解するための非常に貴重なツールとなっています。この情報は、癌や喘息などの疾患の理解に直接関連しています9,10,11,12。
既知の材料特性の基板の力誘起変形を測定するために使用できるシステムは、牽引力を計算するために必要とされる。これらの変化は時間の経過とともに追跡する必要があり、イメージング技術と画像処理技術の両方が必要です。細胞牽引力を決定するために使用された最初の方法の1つは、細胞を播種したコラーゲンヒドロゲルの収縮の観察および分析であったが、この方法は半定量的であった13。別の、より洗練された方法は、シリコーン14の薄いシートの変形から生じる力を決定することによって単一細胞によって加えられる牽引力を測定することであった。その後、より定量的な測定技術が開発され、これらの方法はポリアクリルアミド(PAA)12,15,16などの軟質ヒドロゲルの使用も可能になりました。これらの軟質材料を使用する場合、牽引力は、ヒドロゲルに埋め込まれたランダムに変位したビーズの力誘発変位とゲル16、17の機械的特性から決定することができた。別の進歩は、柔らかいポリジメチルシロキサン(PDMS)で作られたマイクロポストアレイの開発とともにもたらされ、それらのたわみを測定し、ビーム理論18を使用して力に変換することができる。
最後に、軟質ヒドロゲルをマイクロパターニングする方法が、これらのアプローチが細胞接着のための接触領域の制御を可能にするように開発された。細胞の接触領域内のマイクロパターンの変形を測定することにより、力のない基準画像を必要としないため、牽引力を容易に計算することができた19。この方法は、細胞牽引力20の測定のためにPAAゲル上にミクロンサイズの離散蛍光タンパク質接着点の規則的な配列の間接的なパターニングを可能にするため、広く採用されている。これらの力を計算するために、ユーザ入力を必要とせずに各マイクロパターンドットの動きを追跡できる画像処理アルゴリズムが開発された21。
この方法は、ドットパターンのグリッド全体を作成するのは簡単ですが、ドットの孤立したパッチ(またはアイランド)のパターンが必要な場合は、より複雑になります。マイクロパターンの島は、細胞のクラスターの形状やある程度の大きさの制御が必要な場合に便利です。これらの島を作成するために、前述のマイクロコンタクト印刷の方法は、2つの異なるステップを必要とする:i)カバースリップ上にドットの忠実度の高いパターンを作成するために1つのPDMSスタンプを使用し、次いでii)2番目の異なるPDMSスタンプを使用してそれらのドットのほとんどを除去し、ドット21の孤立した島を残す。この独自の方法で島を作成する難しさは、プロセスの最初のステップで一貫したグリッドパターンを作成すること自体が困難であるという事実によってさらに悪化します。マイクロプリントスタンプは、円形マイクロポストのアレイで構成され、その直径は所望のドットサイズに対応する。次に、これらのスタンプを均一なタンパク質層でコーティングし、処理されたカバースリップに正確な量の圧力でスタンプして、所望のパターンを作成します。一方では、スタンプに過度の圧力をかけると、ピラー間の座屈やたるみによる不均一なタンパク質転写やパターン忠実度の低下が生じ、ガラスとの接触につながる可能性があります。一方、圧力が少なすぎると、タンパク質の転写がほとんどまたはまったくなく、パターンの忠実度が低下します。これらの理由から、離島状のドットのマイクロパターンを1ステップで一貫して作成できる転写プロセスが望まれている。
本明細書では、以前に開発された方法よりも一貫性があり汎用性の高いPAAゲル上のミクロンサイズの蛍光タンパク質接着点の島の間接的なマイクロパターニングのための方法が記載されている。古い間接マイクロパターニング法は、PDMSスタンプから中間基板へのタンパク質パターンの転写に依存しているのに対し、ここで紹介する方法は、添加ではなくタンパク質除去のための容器として代わりにPDMSスタンプを使用する。これは、まず使用するPDMSスタンプの構造を根本的に変更することによって行われます。この方法では、等間隔の円形の柱のパターンで構成されるスタンプを作成するのではなく、スタンプは等間隔の円形の穴のパターンで構成されています。
この新しい構造により、これらのPDMSスタンプの表面は、前述のようにグルタルアルデヒドで処理することができ、20、29、30、スタンプをタンパク質と共有結合させることができる。蛍光タンパク質で均等にコーティングされたガラスカバースリップに使用する場合、これらのグルタルアルデヒド処理PDMSスタンプは、カバースリップの表面上のタンパク質の大部分を除去するために使用され、スタンプ上のミクロンサイズの穴の位置によって所定のドットの所望のパターンのみを残す。この変更により、ほぼ連続したドットのグリッドで構成されるパターンを生成し、1 つのステップで孤立したドットの島を作成するための成功率が向上します。

<table><tbody><tr><td>(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#281778</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>N/A</td><td>カスタムデザインマスク</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#07-200-83</td><td></td></tr>アセ<tr><td>トン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック #A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド溶液、40%</td><td>シグマアルドリッチ</td> <td>#A4058</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルオア488サー</td><td>モフィッシャー</td> <td>#A20000</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アミノニウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td><td>ック #BP179-25</td><td></td></tr><tr><td>ビサアクリルアミド</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td><td>ック #PR-V3141</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>グリーンフィールドグローバル</td> <td>#111000200C1GL</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ、25 mm丸</td><td>Fisher Scientifc</td><td>#12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ、30 mm丸</td><td>Warner</td><td>#64-1499</td><td></td></tr><tr><td>浜松 ORCA-R2 カメラ</td><td>浜松</td> <td>#C10600-10B</td><td></td></tr><tr><td>ヒューマンプラズマ</td><td>バレーバイオメディカル</td> <td>#HP1051P</td><td>分離に使用fibronectin</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid, 1.0 N</td><td>Millipore Sigma</td><td>#1.09057</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Wayne Rasband</td><td>#1.53n</td><td></td></tr><tr><td>Interchangeable Coverslip Dish Set</td><td>Bioptechs</td><td>#190310-35</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>#06-666-11C</td><td></td></tr><tr><td>Mask Alinger</td><td>Karl Suss</td> <td>#MA6</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 2021</td><td>Mathworks</td> <td>#R2021a</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Basic</td><td>Molecular Devices</td> <td>#v7.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスクシンイミド エステル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#130672-5G</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Cell Stain</td><td>Thermo Fisher</td> <td>#R37605</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-ZDC 倒立顕微鏡</td><td>Olympus</td> <td>#IX81</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱塩カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>#52-1308-00</td><td></td></tr><tr><td>フォトレジストスピナーフード</td><td>ヘッドウェイ研究</td> <td>#PWM32</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick</td> <td>#PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>プラズマエッチング</td><td>TePla</td> <td>#M4L</td><td></td></tr><tr><td>Prior Lumen 200Pro 光源</td><td>Prior Scientific</td> <td>#L200</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafers, 100 mm</td><td>University Wafers</td><td>#809</td><td></td></tr><tr><td>SU-82005</td>年 <td>化薬アドバンスドマテリアルズ(株)</td><td></td><td></td>#NC9463827</tr><tr><td>SU-8開発元</td><td>株式会社化薬</td><td></td><td></td>#NC9901158</tr><tr><td>シルガード 184 シリコーン エラストマー</td><td>エセックス ブラウネル</td> <td>#DC-184-1.1</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>#BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ (1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル) シラン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>#448931</td><td></td></tr><tr><td>UAPON-40XW340 対物レンズ</td><td>オリンパス</td> <td>#N2709300</td><td></td></tr><tr><td>紫外線フラッド エクスポージャー</td><td>Newport</td><td>#69910</td><td></td></tr><tr><td>ウェーハキャリアトレイ、110 x 11 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>#19395から40</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

マイクロパターン牽引顕微鏡は、単一細胞および細胞集塊の形状の制御を可能にする。さらに、マイクロメートルの長さスケールでパターニングする能力は、各マイクロパターン化されたドットが、次に柔らかい、下層のヒドロゲルを変形させる単一焦点接着の形成を可能にするので、牽引力の測定のためにこれらのパターン化された接触ゾーンの使用を可能にする。このアプローチは、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、血小板、および上皮細胞を含む広範囲の細胞型に使用されている。 
このレビューは、細胞外マトリックスタンパク質を、予め指定されたサイズおよび間隔のドットの規則的な配列でポリアクリルアミドヒドロゲルに印刷することを可能にする技術の進化を説明する。マイクロメートルスケールのパターンは柔らかい基板に直接印刷することは困難であるため、最初に硬いガラスカバースリップ上にパターンが生成され、次いでゲル化中にパターンをヒドロゲルに転写するために使用される。まず、カバースリップ上に小さなドットの配列を生成するためのオリジナルのマイクロコンタクト印刷アプローチについて説明する。パターンの大部分を削除して小さなドットの島を残す 2 番目のステップは、このようなパターン化されたドットの配列上のセルとセル クラスターの形状を制御するために必要です。 
次に、単一の減法パターニングステップを使用してドットの島を生成することを可能にするこのアプローチの進化について説明する。このアプローチは、ユーザーにとっては非常に単純化されていますが、パターンの作成に必要なマスターモールドの寿命が短くなるという欠点があります。最後に、変位ドットの画像とその後の細胞生成牽引場の解析のために開発された計算アプローチが説明され、これらの解析パッケージの更新バージョンが提供されます。

ヤング率がE=3.6kPaでポアソン比がν=0.445のPAAヒドロゲルが、この減法マイクロパターニング法によって使用されるように作製された。ヒドロゲルの厚さは約100μmに作られており、ここで使用したイメージング設定で画像化できると同時に、細胞がゲルの下の硬いカバースリップを感知するのを防ぎ、細胞の剛性感知に焦点を当てた研究で問題を引き起こす23,33。他の多くの剛性レベル(最大30kPa)のゲルが、間接マイクロパターニング法34を用いて首尾よく作成され、画像化されているので、この方法は、3.6kPaヒドロゲルのみの使用に限定されない。カバースリップは、上部のパターン化されたカバースリップを取り外したときにゲルが下部カバースリップに固定されたままになるように、グルタルアルデヒドで事前に処理されます(図2C、D)。
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我々は、軟質ヒドロゲル上の細胞外マトリックスタンパク質のドットアレイの単一の減法パターニングステップによるマイクロコンタクト印刷に基づく、細胞牽引力を測定するための標準的な方法の改善を説明する。この方法は、細胞クラスター形状を制御するために不可欠な島パターンのより簡単でより一貫した作製を可能にする。

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

このプロトコルは、どのような形状の忠実度の高いタンパク質マイクロパターン、特に細胞クラスターの研究のための孤立した島のパターンの一貫した作成を可能にする。この技術は、任意の形状とサイズの孤立島のマイクロパターンを1つのステップで作成するために使用できますが、以前はそのようなパターンを作るには2つの別々のステップが必要でした。まず、製造元の説明書に記載されているように、PDMSを正しい硬化剤対塩基比で混合することから始めます。室温および圧力で15分間インキュベートし、次いで混合物を真空下で15分間脱気する。PDMSをマスターモールドに注ぎ、摂氏37度に設定したインキュベーターに移して一晩硬化させます。マスターモールドをインキュベーターから取り外し、室温まで冷却します。マスターモールドが冷却されている間、25ミリメートルのカバースリップをエタノール中で10分間超音波処理します。準備する切手の数だけカバースリップを使用してください。カバースリップをDI水で十分にすすぎ、ろ過されたエアガンを使用して乾燥させます。カバースリップをプラズマで1分間処理し、プラズマクリーナーを高真空下で処理します。カバースリップがチャンバー内で移動するのを防ぐために、処理後にゆっくりと真空を解除します。直射日光や頭上の照明のない部屋で、各カバースリップを100マイクロリットルの蛍光標識タンパク質溶液でコーティングします。光からさらに保護するためにサンプルを覆い、室温で20分間インキュベートします。各カバースリップをDI水で十分にすすいでください。各カバースリップの側面をペーパータオルまたは同様の吸収材に軽く叩いて、表面から余分な水分を取り除きます。カバースリップを少なくとも30分間暗闇の中で覆い隠したままにして、完全に乾かします。タンパク質コーティングされたカバースリップが乾いたら、メスまたは鋭い刃で切断して、PDMSスタンプをマスターモールドから取り外します。PDMSスタンプをプラズマで高真空下で2分間処理します。ヒュームフードの下に蓋をした容器にスタンプを入れ、各スタンプを100%エタノールで希釈した10%3-APTMSの薄層でコーティングします。容器をスタンプで覆い、室温で5分間インキュベートする。両面の各スタンプをDI水で十分にすすいでください。スタンプを清潔な容器に入れ、DI水で調製した2.5%グルタルアルデヒドでコーティングします。スタンプを覆い、室温で30分間インキュベートします。スタンプをDI水で十分にすすいでください。前述のように表面から余分な水分を取り除き、スタンプを30分間乾燥させます。30分経過してもタンパク質コーティングされたカバースリップまたはスタンプが完全に乾燥しない場合は、ろ過されたエアガンを使用して完全に乾燥させます。スタンプのパターン側をカバースリップに押し込み、完全に接触するのに十分な圧力をかけます。15分間邪魔されずに放置してください。次に、PDMSスタンプをカバースリップから慎重に剥がします。適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して、パターン化されたカバースリップの忠実度を確認します。パターン化されたカバースリップはすぐに使用するか、さらに使用するまで直接光から遠ざけて保管してください。PAAヒドロゲル前駆体を調製する前に、アクリル酸NHSエステルを冷蔵庫から取り出して、開放される前に室温に達する。交換可能なカバースリップ皿セットを70%エタノールで滅菌して準備し、使用前にバイオセーフティキャビネット内のUV光の下で少なくとも30分間インキュベートする。ヒュームフードの下で、DI水中で調製した1.25ミリリットルの40%アクリルアミドを15ミリリットルの円錐管に加える。同じチューブに、DI水中で調製した175マイクロリットルのビスアクリルアミド溶液を加える。次に、500マイクロリットルの10X PBSを加え、続いて2.915ミリリットルのDI水を加える。この前駆体の969マイクロリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットし、残りを摂氏4度で最大2週間保存します。新鮮な微量遠心チューブで50〜100ミリグラムのAPSを測定し、DI水で1ミリリットルあたり100ミリグラムに希釈します。フード内のNHSエステルを開き、微量遠心チューブで最大3ミリグラムのNHSを慎重に測定します。NHSエステルを1倍PBSで1ミリリットルあたり1ミリグラムに希釈する。ヒュームフードの下で、2マイクロリットルのTEMEDを、PAA前駆体の969マイクロリットルアリコートを含むマイクロ遠心管に加える。1モルのHCLを15マイクロリットル加えて、ヒドロゲル溶液のpHを低下させ、NHSエステルの加水分解を避ける。10マイクロリットルのNHSエステル溶液をチューブに加える。バイオセーフティキャビネットで次の手順を実行します。3-APTMSとグルタルアルデヒド処理された側面を上にしてセットされたカバースリップ皿の中央部に30ミリメートルのカバースリップを慎重に置き、プラスチックリングを上にねじ込みます。パターン化されたカバースリップを最小限の光露光でセットアップして、次のステップに備えます。5マイクロリットルのAPS溶液をPAA前駆体アリコートチューブにピペットし、次いで反転させて混合する。直ちにこの溶液35マイクロリットルを30ミリメートルのカバースリップ上にピペットする。パターン化されたカバースリップを、タンパク質側を下にして溶液の上に置きます。ヒドロゲル中に気泡を生じさせないように注意してください。ヒドロゲルを光から保護し、90分間重合させる。ヒドロゲルが重合したら、カミソリの刃またはメスを使用して上部カバースリップを取り外し、一度取り外したカバースリップがゲルから落ちたり滑り落ちたりしないようにして、ゲル表面のパターンを台無しにしないようにします。ヒドロゲル中の残りのNHSエステルを不動態化するために、2ミリリットルの滅菌PBSをゲルに加え、摂氏37度で45分間インキュベートする。直ちに実験用のゲルを準備するか、さらに使用するまで摂氏4度の滅菌PBSに一晩保存してください。ヒドロゲルを蛍光フィブロネクチンで間接的にパターン化して、クラスター内の細胞牽引力を視覚化および測定し、所定のサイズおよび形状の島パターンを作成した。パターンの品質は、PDMSスタンプが鋳造されたマスターモールドの忠実度に直接関係していました。この方法は、所定の形状の孤立した、明確に定義された島パターンを作製することができる。フィブロネクチン接着ドットは、島の所望の領域内にのみ存在していた。これらの孤立した島状の接着ドットは、さらに、クラスター形状のより良好な制御を可能にした。PDMSスタンプを2つの小さな3-APTMSでコーティングすると、除去方法の有効性が制限され、多すぎるとスタンプ表面にオレンジ色の残留物が作成されるため、非常に重要です。ここで作成されたパターンは、個々の細胞とクラスターの両方における細胞牽引力を決定するために使用でき、機械的恒常性を維持する能力についての洞察を与える。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

金の長鎖アルカンチオールから形成された自己組織化単分子層（SAM）は、蛋白質のパターンとセルの閉じ込めを形成するための明確に定義された基質を提供しています。ポリジメチルシロキサン（PDMS）グリコール終端アルカンチオールの単量体との埋め戻しに続いてスタンプを使用してhexadecanethiolのマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質や細胞の吸着のみスタンプhexadecanethiol地域にパターンを生成します。...

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

micropunchingリソグラフィのアプローチは、上、側壁およびポリマー基板の底面にマイクロおよびサブミクロンのパターンを生成するために開発されています。それはパターニングが導電性ポリマー及び側壁パターンを生成する障害を克服しています。このメソッドは、複数の機能の迅速な製造を可能にし、積極的な化学の自由です。...

ポリマー基板上へのマイクロ·サブミクロンのパターンを生成するためのリソグラフィMicropunching

このビデオでは、細胞の表現型仕様を研究するためのマイクロパターン基質の調製について説明しています。タンパク質被覆マイクロパターンPDMSスタンプは、PDMS被覆カバースリップ上のマイクロパターンを転写するために使用されます。次に、カバーガラスを界面活性剤で処理して、不要な表面での細胞接着を防ぎます。次に、細胞を添加してパターンに沈殿させ、さらなる分析のためにインキュベートします。...

シュワン細胞表現型を研究するためのマイクロパターン基質の調製

この原稿は、単方向ストレッチを使用して接着細胞または組織に力を適用したり、解放する手法を提示します。...

PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ベースのヒドロゲルに埋め込まれた蛍光線マーカーの3次元配列を製造するための多光子リソグラフィーを実装するための指示を提供し、参照フリー、トラクション力顕微鏡として使用します。プラットフォーム。これらの指示を使用して、3D材料ひずみの測定および細胞牽引の計算は高スループット牽引力の測定を促進するために簡単にされる。...

リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装

発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。...

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

ここで示すプロトコルは、哺乳類細胞内の細胞骨格構造を研究するために細胞形状を標準化するマイクロパターンの自動製作を可能にする。このユーザーフレンドリーな技術は市販のイメージ投射システムと設定することができ、標準的な細胞生物学の実験室にアクセスできない専門の装置を要求しない。...

赤外線レーザー支援マイクロパターンによる細胞形状の制御

このプロトコルの目的は、細胞接着と成長を、クライオ電子顕微鏡用のグリッドの標的領域に向け出す方法です。これは、細胞播種前のパターン化領域に細胞外マトリックスタンパク質を堆積させた後、ユーザー指定のパターンで脱退された反ファリング層を適用することによって達成される。...

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

近紫外線リソグラフィーとトラクションフォース顕微鏡を組み合わせて、マイクロパターン化されたヒドロゲル上の細胞力を測定します。単一細胞のターゲット光誘導放出により、同じサンプル上で多数の測定が可能になります。...

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

マイクロ流体プラットフォーム内の毛細管現象支援アセンブリを用いて、細菌やコロイドなどの液体中に浮遊するマイクロサイズの物体をポリジメチルシロキサン基板上の所定のアレイにパターニングする技術を提示する。...

シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

学ぶマイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成法。ソフトハイドロゲル上に高忠実度のタンパク質微小パターンをワンステップで作成し、細胞クラスターの形状制御と牽引力測定の信頼性向上に貢献する革新的な細胞力学研究手法です。

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

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