Name: CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ CRISPR/Cas9を用いた渡りバッタのホモ接合変異体構築法と胚の凍結保存・復活法。ゲノム編集効率と変異体系統維持のプロトコルを解説し、昆虫遺伝学研究と農業害虫管理への応用を示す。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、中国国家自然科学財団(32070502、31601697、32072419および中国ポスドク科学基金会(2020M672205)の支援を受けました。

1. ターゲット部位の選択とsgRNAの設計
<ol><li>NCBIおよびイナゴデータベース24で文献調査および/または遺伝子のmRNAまたはコーディングDNA配列(CDS)の検索を通じて、目的の遺伝子について可能な限り多くの配列情報を収集します。</li>
	<li>関心のある遺伝子の配列をそのゲノムDNA配列と比較して、エクソン領域とイントロン領域を区別します。</li>
	<li>研究目的に応じて、対象地設計の候補地域を選定します。プライマーペアを設計して候補領域フラグメントを増幅し、PCR産物のシーケンシング解析によってその野生型配列を検証します。 注:候補ターゲットリージョンの選択にはさまざまな戦略があります。例えば、ほとんどの遺伝子/タンパク質機能研究では、ゲノム編集(すなわち、遺伝子ノックアウト)後にタンパク質/RNA機能全体が失われるように、開始コドンに近いエクソン断片を候補領域として使用します。特定のドメインの関数解析では、ドメインの先頭(または両端)の候補領域を選択します。</li>
	<li>E-CRISP Design25 などのオンラインリソースを使用して、ターゲット候補地域の潜在的なターゲットサイトを検索します。<ol><li>参照ゲノムのドロップダウンリストで「ショウジョウバエメラノガスターBDGP6」(またはその他の昆虫)を選択し、「入力はFASTA配列」を選択し、ターゲット領域の配列をテキストボックス(FASTA形式)に貼り付けます。</li>
		<li>「培地」と「単一デザイン」で「sgRNA検索を開始」を押してアプリケーションを起動し、可能なターゲット部位を取得します。予測スコアに基づいて結果から1〜3個の潜在的なターゲットを選択し、それに応じて対応するsgRNAを設計します。 注:CRISPR設計には、CRISPOR、CHOPCHOP、CRISPRdirect、ZiFiTなど、他にも多くのオンラインプラットフォームがあります( 材料表を参照)。それらのいくつかは、ゲノム配列データがデータベースにある種の特異性チェックの機能を持っています。ただし、イナゴのゲノム配列はオンラインWebサイトでは見つかりませんでした。イナゴのCRISPR設計には、複数のオンラインツールを使用することをお勧めします。包括的に、さまざまなWebサイトからの結果を考慮し、最高の特異性、最高の効率、および最小のミスマッチ率の原則に基づいて、結果からsgRNAを選択します(図1A、B)。</li>
	</ol></li>
</ol>2. インビトロでのsgRNAの合成と検証
<ol><li>sgRNA合成キットを使用して、製造元のマニュアル(材料表)に従ってsgRNAを合成します。この手順には通常、DNAテンプレート増幅、 インビトロ 転写、およびsgRNA精製の3つのステップが含まれます21。合成したsgRNAをヌクレアーゼフリー水で希釈して保存濃度300 ng/μLにし、さらに使用します。</li>
	<li>CRISPR/Cas9システムの in vitro 切断アッセイの基質として機能する標的遺伝子断片を増幅および精製します。製造元の指示に従って、次の手順を実行します。</li>
	<li>購入したCas9タンパク質をヌクレアーゼフリー水で300 ng/μLに希釈します。1 μLのsgRNA(300 ng/μL)および1 μLのCas9タンパク質(300 ng/μL)を200 ngの精製ターゲットフラグメントとともに切断バッファー中で37°Cで1時間インキュベートします(総容量10 μL; 表1を参照)。アガロースゲル電気泳動によるsgRNA誘導Cas9切断の効率を推定する(図1C)。以下のマイクロインジェクションに対して活性の高いsgRNAを選択します。 注:アガロースゲル電気泳動の結果は、画像処理ソフトウェアを使用してグレースケール画像に変換でき、切断効率は、推測されたサイズのバンドのグレースケールに従って推定されます。</li>
</ol>3.卵のマイクロインジェクションと培養
<ol><li>マイクロピペットプラーでガラス毛細血管を引っ張って注射針を準備します(材料表)。パラメーターを次のように設定します:加熱を588に、プルを90に、速度を60に、時間を40に設定します。注射針の先端をマイクログラインダーで粉砕します(材料表)。 注意: 理想的な針先は開いていて鋭利です(図2A)。注射中に針が詰まったり、誤って折れたりすることがあるため、実験用に追加の針を準備することを強くお勧めします。</li>
	<li>1 μLのCas9タンパク質(300 ng/μL)と1 μLの検証済みsgRNA(300 ng/μL)を混合して、注射用のRNPを取得します。8 μLのRNaseフリー滅菌水を加えて、混合物の最終容量を10 μLにします。 溶液を完全に混合し、氷の上に置いておきます。 注:Cas9タンパク質とsgRNAの最終濃度は、編集結果に応じて最適化することができます。調製したRNP溶液の繰り返し凍結融解を避け、すぐに使用することをお勧めします。</li>
	<li>オスとメスの成虫を30°Cで16(明):8(暗)の日長で飼育し、十分な新鮮なコムギの苗を餌として供給します。これらのイナゴを毎日観察し、産卵ポット(湿った滅菌砂で満たされたプラスチック製の植木鉢またはカップ)を飼育ケージに入れて、イナゴが交尾したら産卵します。 注:通常、飼育ケージ(40 cm x 40 cm x 40 cm)で飼育された100ペアの成虫バッタは、単一の遺伝子をノックアウトするための卵を生成するのに十分です。より多くの卵が必要な場合は、追加のイナゴペアを培養します。</li>
	<li>産卵ポットから産みたての卵のさやを回収し、卵の日焼けを約30分間待ちます。細かいブラシを使用して卵のさやから卵を水中でそっと隔離し、滅菌水で3回洗います。卵をペトリ皿に入れ、滅菌水を加えて湿らせます。 注:新しく産まれた卵の日焼けは、突然変異体の効率を大幅に改善することができます21。</li>
	<li>調製したRNP溶液を注射針に充填し、マイクロマニピュレーターにロードします(材料表)。<ol><li>マイクロインジェクションパラメータを、射出圧力(π)の300hPa、射出時間(ti)の0.5秒、補償圧力(pc)の25hPaに設定します。</li>
		<li>ペダルを押して、注入された溶液の量を評価します。射出圧力と射出時間を調整して、射出量が約50〜100nLになるようにします。 注意: 注射液を可能な限り連続的かつ制御可能にするために、針内の残留空気を排出します。針とマイクロマニピュレーターの接続はしっかりとする必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>滅菌卵を注射パッドに定期的に配置し(図2B、C)、顕微鏡のオブジェクトテーブルにパッドを置きます(図3A)。卵が観察されるまで顕微鏡の倍率を調整します。注射の先端が見えるまで顕微鏡下でマイクロ注射針を調整し、注入する卵の近くに配置します。</li>
	<li>適切な高さと30〜45度の角度で注射を開始します。卵のマイクロパイルの近くで先端を卵に注意深く挿入し(図3B)、ペダルを押して注射を行います。針をすばやく引っ込め、次の卵を注射するために注射パッドを動かします。 注:マイクロインジェクション中の卵のわずかな膨張が観察されるべきです。ピンホールでの少量の細胞質漏出は許容されます。注入針を新しいものと交換するか、液体の流出が多すぎる場合は射出角度を調整します。</li>
	<li>注入した卵を培養皿(湿ったろ紙を入れたシャーレ)に移し、30°Cのインキュベーターに入れます。 注:これらの注入された卵からニンフが孵化するまでに約13〜14日かかります(標的遺伝子の突然変異が胚の発生に影響を与えないことを条件として)(図3C)。特定の遺伝子をノックアウトするのに十分な孵化と閉鎖量を確保するために、少なくとも100個の卵を注入します。</li>
</ol>4. 変異率推定と変異体のスクリーニング
<ol><li>注射後毎日注射卵の発育を確認してください。注入した卵を最初の5日間は24時間ごとに新しい培養皿に移します。</li>
	<li>注射後6日目( またはそれ以降)に、10個の卵をランダムに摘み取ってチューブに移し、グラインダーを使用して60 Hzで6分間2つの鋼球で卵を適切に粉砕します( 材料の表を参照)。破片を1 mLのPBSで再懸濁します。5 μLの混合物を45 μLの50 mM NaOHに移し、95°Cで5分間溶解します。5 μLの1 M Tris-HCl(pH=8.0)を溶解システムに加え、アルカリ溶解反応を終了します。 注:最後の移植後の任意の日にアルカリ溶解のために卵を選ぶことができ、発生状況に応じて複数の卵を1つのサンプルとして使用できます(たとえば、5つの6日齢の胚を1つのサンプルとして使用し、2つの10日齢の胚を1つのサンプルとして使用できます)。アルカリ溶解法を使用して卵のゲノムDNAを取得することが不可能な場合があります。市販のゲノムDNA抽出キットは、卵からゲノムDNAを単離するための代替方法として使用できます。</li>
	<li>1 μLの溶解産物をPCRテンプレートとして取り、標的遺伝子断片を増幅し(表2 および 表3)、PCR産物をシーケンシングに送ります。シーケンシング結果を野生型配列と比較して、CRISPR/Cas9システムが in vivoで 標的遺伝子を切断したかどうかを事前に評価します(図4A)。インデルが胚期に検出されることを条件に、その後の発達のために残りの卵を許可します。 注:このようにして、胚段階で突然変異率を事前に推定することができます。このステップでインデルが見つからない場合は、ターゲット遺伝子用の新しいsgRNAをいくつか準備し、ステップ2.1のノックアウトプロトコルを繰り返します。</li>
	<li>孵化したニンフを飼育ケージに移し、ステップ3.3の説明に従って培養します。ニンフが5齢期に発達したら、プラスチック製の培養カップ(1ニンフ/カップ)でそれらを分離します。 注:ニンフが5齢に発達するのに通常約25〜35日かかり、最も明白な表現型は、翼芽が4番目または5番目の腹部に伸びることです。さらに、さらなる研究において、標的遺伝子と表現型との関係を予測するために、死んだニンフの表現型を記録することが推奨される。</li>
	<li>触角の長さ約2mmを解剖ハサミで切り取り、アルカリ溶解法を用いて溶解する(ステップ4.2)。上記のようにこれらのニンフの標的遺伝子断片配列を解析し(ステップ4.3)、G0 変異体を同定する(図4B)。 注:溶解のためにカットされたアンテナは少し長くなる可能性があり、アンテナを直接消化することができますが、アンテナを粉砕またはミンチすることは溶解に役立ちます。シーケンシング結果で標的部位の近くに複数のピークを持つ個体は、陽性変異体として識別され、その後の発生と交配が可能になります。</li>
</ol>5. 変異株の確立と継代
<ol><li>G0変異体と野生型バッタを用いて交雑育種を行う(図4B)。オーシストを収集し、これらのオーシストを30°Cで別々にインキュベートします。 各オーシストに3〜6個の発育卵を使用して、手順4.2および4.3で説明されているように突然変異を検出します。その後の開発のために突然変異陽性オーシストを保持し、突然変異陰性オーシストを放棄する。 注:胚期での突然変異率の推定は、G1 変異体のスクリーニングを大幅に加速することができます。通常、3〜6個の発育卵は、上記のようにPCR媒介ジェノタイピングのための1つのサンプルとして混合することができる。</li>
	<li>手順4.4の説明に従って、G1 ニンフを後方にします。G1 ヘテロ接合体を検出するためのステップ4.5に記載されるようにPCRベースのジェノタイピングを実行するために、アンテナの長さ約2mmを切り取る。製造元の指示に従ってTAクローニングを実行し( 材料表を参照)、それらの変異を特定します。同じ変異を有するG1 ヘテロ接合体を用いてインクロスを行い、G2 ニンフを得る。 注:PCR産物のサンガーシーケンシングは、ヘテロ接合体を見つけるための情報しか提供できず、正確な変異を特定するための十分な情報を提供しません。したがって、PCR産物を用いたTAクローニングは、変異を明確に同定し、安定な変異株の樹立を促進するために必要である。</li>
	<li>G2 ニンフを5齢まで後押しします。ステップ5.2で説明されているPCRベースのジェノタイピングを使用して、さらなる研究と安定した継代に適したホモ接合体および/またはヘテロ接合体を特定します(図4B)。 注:ホモ接合体とヘテロ接合体の混合を避けるように注意してください。各集団のホモ接合性および/またはヘテロ接合性を確認するために、すべての世代でPCRベースのジェノタイピングを実行することをお勧めします。このチェックに使用されるイナゴの数は、個体群のサイズによって異なります。さらに、イナゴの個体数は、インクロス戦略によって拡大することができます。</li>
</ol>6.卵の凍結保存と蘇生
<ol><li>凍結保存する卵を滅菌水で洗浄し、上記の培養皿で5〜6日間インキュベートします(ステップ3.8)。これらの卵を培養皿に集め、ろ紙の破片で覆います。培養皿全体をパラフィンフィルムで包みます。</li>
	<li>皿を25°Cで2日間保ち、その後さらに2日間比較的低い温度(13〜16°C)で保ちます。その後、皿を6°Cの冷蔵庫に移します。卵に湿った環境を提供するために、2週間ごとに水を追加します(図5A)。 注:胚は、30°Cで5〜6日間発生した後、カタトレプシス段階にあると推測されています26。勾配冷却は卵の凍結保存に役立ちます(表5)。</li>
	<li>凍結保存された卵を蘇生させるには、冷蔵庫からシャーレを取り出し、25°Cで2日間保管します。これらの卵をニンフが孵化するまで30°Cのインキュベーターに入れます(図5B)。 注:凍結保存された卵を25°Cに入れてから、30°Cのインキュベーターに移す必要があります。胚は少なくとも5ヶ月間凍結保存することができますが、凍結保存のために孵化率と閉鎖率が低下する可能性があります(表5)。</li>
</ol>

<ol><li>Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+therapeutic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of therapeutic genome editing.</a> Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).</li>
<li>van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delivery+challenge%3A+fulfilling+the+promise+of+therapeutic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).</li>
<li>McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+CRISPR+technologies+for+gene+editing+and+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation.</a> Nature Communications. 11 (1), 1281(2020).</li>
<li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas+systems+in+genome+editing%3A+Methodologies+and+tools+for+sgRNA+design%2C+off-target+evaluation%2C+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312(2020).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+editing%3A+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li>
<li>Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+iap+gene%2C+responsible+for+alkaline+phosphatase+isozyme+conversion+in+Escherichia+coli%2C+and+identification+of+the+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.</a> Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, 00471(2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+microinjection+and+knockout+mutant+identification+of+CRISPR%2FCas9+genome-edited+Helicoverpa+Armigera+%28Hubner%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE1%22%5BJournal%5D)">Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068(2021).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+knockout+of+the+abdominal-A+homeotic+gene+in+the+global+pest%2C+diamondback+moth+%28Plutella+xylostella%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+and+efficient+CRISPR%2FCas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+locusts%3A+Successful+establishment+of+an+olfactory+deficiency+line+by+targeting+the+mutagenesis+of+an+odorant+receptor+co-receptor+%28Orco%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BmHpo+mutation+induces+smaller+body+size+and+late+stage+larval+lethality+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 60(2018).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+tanning+improves+the+efficiency+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutant+locust+production+by+enhancing+defense+ability+after+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Vinylanisole+is+an+aggregation+pheromone+in+locusts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts.</a> Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).</li>
<li>Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locust+and+grasshopper+management%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Locust and grasshopper management.</a> Annual Review of Entomology. 64, 15-34 (2019).</li>
<li>Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.locustmine.org:8080/locustmine">http://www.locustmine.org:8080/locustmine</a> (2019).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.e-crisp.org/E-CRISP/">http://www.e-crisp.org/E-CRISP/</a> (2014).</li>
<li>Pétavy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+development+of+the+vitellophags+during+embryogenesis+of+the+migratory+locust%2C+Locusta+migratoria+L.+%28Orthoptera+%3A+Acrididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Insect+Morphology+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae).</a> International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).</li>
<li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injecting+Gryllus+bimaculatus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Injecting Gryllus bimaculatus eggs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59726(2019).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).</li>
<li>Du, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Laccase+2+severely+impairs+cuticle+tanning+and+pathogen+resistance+during+the+pupal+metamorphosis+of+Anopheles+sinensis+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae).</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 171(2017).</li>
<li>Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tanning+of+grasshopper+eggs+by+an+exocrine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion.</a> Science. 152 (3718), 95-97 (1966).</li>
<li>Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularization+in+locust+embryos+occurs+before+blastoderm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation.</a> Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effect+of+photoperiod+and+temperature+on+the+induction+and+termination+of+embryonic+diapause+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Managment+Science%22%5BJournal%5D)">Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust.</a> Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).</li>
<li>Jarwar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomic+analysis+reveals+molecular+profiles+of+central+nervous+system+in+maternal+diapause+induction+of+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).</li>
</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

イナゴは、人間の文明以来、農業にとって最も壊滅的な害虫の1つです23。CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集技術は、バッタの生物学的メカニズムに関するより良い知識と有望な害虫駆除戦略を提供するための強力なツールです。したがって、ホモ接合型ローカスト変異体のCRISPR/Cas9を介した構築の効率的で使いやすい方法を開発することは大きな利益です。いくつかの素晴らしい研究が報告され、バッタのゲノム編集のためのいくつかの基本的なワークフローが提供されましたが18,20,21,22、手順全体の体系的な最適化はまだ不足しています。一般に、CRISPR / Cas9システムの胚注入によって生成されたホモ接合型イナゴ変異体は、3つの主要なステップに分けることができます:a)in vitroでのsgRNAの設計、合成、およびスクリー...

遺伝子編集技術を使用して、特定のゲノム遺伝子座に挿入または欠失を導入し、目的1で標的遺伝子を人為的に改変することができます。過去数年間で、CRISPR / Cas9技術は急速に発展し、ライフサイエンスのさまざまな分野での適用範囲を拡大しています2,3,4,5,6。CRISPR / Cas9システムは1987年に発見され7、細菌や古細菌に広く見られます。さらなる研究は、ファージ8と戦うためにRNA誘導ヌクレアーゼCas9に依存する原核生物の適応免疫系であることを示しました。人工的に改変されたCRISPR/Cas9システムは、主に単一のガイドRNA(sgRNA)とCas9タンパク質の2つのコンポーネントで構成されています。sgRNAは、標的配列に相補的なCRISPR RNA(crRNA)と、比較的保存されている補助トランス活性化crRNA(tracrRNA)で構成されています。CRISPR/Cas9システムが活性化されると、sgRNAはCas9タンパク質とリボ核タンパク質(RNP)を形成し、RNA-DNA相互作用の塩基対を介してCas9を標的部位に誘導します。次に、二本鎖DNAはCas9タンパク質によって切断され、その結果、標的部位9,10,11,12のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の近くに二本鎖切断(DSB)が出現する。DSBによって引き起こされる損傷を軽減するために、細胞は包括的なDNA損傷応答を活性化して、ゲノム損傷を効率的に検出し、修復手順を開始します。細胞には、非相同末端結合(NHEJ)と相同性指向修復(HDR)の2つの異なる修復メカニズムがあります。NHEJは、DNA二本鎖切断を迅速に修復し、細胞のアポトーシスを防ぐことができる最も一般的な修復経路です。ただし、DSBの近くに挿入と欠失(インデル)の小さな断片が残るため、エラーが発生しやすく、通常は読み取りフレームがオープンになり、遺伝子ノックアウトにつながる可能性があります。対照的に、相同修復は非常にまれなイベントです。DSBのコンテキストに相同な配列を有する修復テンプレートが存在することを条件として、細胞は時折、近くのテンプレートに従ってゲノム切断を修復するであろう。HDRの結果、DSBは正確に修復されます。特に、テンプレート内の相同配列間に付加配列がある場合、それらはHDRを介してゲノムに組み込まれ、このようにして、特定の遺伝子挿入を実現することができた13。
sgRNA構造とCas9タンパク質変異体の最適化と開発により、CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集システムは、ショウジョウバエメラノガスター、ネッタイシマカ、ボンビクスモリ、ヘリカバーパアルミゲラ、プルテラキシロステラ、イナゴの渡り鳥などの昆虫の研究にもうまく適用されています14,15,16,17,18 、19。著者らの知る限り、Cas9タンパク質とin vitro転写sgRNAからなるRNPはイナゴゲノム編集に使用されていますが20,21,22、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼを介した移動性イナゴのホモ接合変異体の構築のための体系的かつ詳細なプロトコルはまだ不足しています。
渡りバッタは、世界的に分布し、食料生産に大きな脅威をもたらす重要な農業害虫であり、小麦、トウモロコシ、米、キビなどのイネ科植物に特に有害です23。ゲノム編集技術に基づく遺伝子機能解析は、渡りバッタの新たな標的と新たな戦略を提供する可能性があります。本研究では、標的部位の選択とsgRNAの設計、sgRNAのin vitro合成と検証、卵のマイクロインジェクションと培養、胚期における突然変異率の推定、変異体の検出、変異体の継代と保存など、CRISPR/Cas9システムを介して渡りバッタ遺伝子をノックアウトするための詳細な方法を提案します。このプロトコルは、バッタ遺伝子の大部分を操作するための基礎参照として使用でき、他の昆虫のゲノム編集に貴重な参照を提供できます。

<table><tbody><tr><td>10回;NEBuffer r3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7030S</td><td>のバッファ &nbsp;in vitro Cas9切断アッセイ</td></tr><tr><td>2xEs Taq MasterMix (Dye)</td><td>Cwbio</td><td>CW0690</td><td>遺伝子増幅用</td></tr><tr><td>2xPfu MasterMix (Dye)</td><td>Cwbio</td><td>CW0686</td><td>遺伝子増幅用</td></tr><tr><td>CHOPCHOP</td><td></td><td></td><td>sgRNAsを設計するためのオンラインウェブサイト、http://chopchop.cbu.uib.no/.</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>sgRNAを設計するためのオンラインウェブサイト、http://crispor.org.</td></tr><tr><td>CRISPRdirect</td><td></td><td></td><td>sgRNAを設計するためのオンラインウェブサイト、http://crispr.dbcls.jp/.</td></tr><tr><td>電気泳動電源</td><td>LIUYI BIOLOGY</td><td>DYY-6D</td><td>異なるサイズの核酸分子の分離</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30125177</td><td>サンプル収集などに。</td></tr><tr><td>細かいブラシ</td><td>Annigoni</td><td>1235</td>卵<td>の洗浄と隔離用。オンラインで購入しました。</td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>P97</td><td>マイクロインジェクション針作成用</td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>Cwbio</td><td>CW2302</td><td>DNA回収・精製</td></tr><tr><td>ゲルイメージング解析システム</td><td>OLYMPUS</td><td>Gel Doc XR</td><td>電気泳動結果の観察</td></tr><tr><td>GeneTouch Plus</td><td>Bioer</td><td>B-48DA</td><td>遺伝子増幅用</td></tr><tr><td>ガラス電極キャピラリー</td><td>ガードナー</td><td>GD-102</td><td>製作用&nbsp;注射針付き&nbsp;a&nbsp;マイクロピペット プーラー</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>MEMMERT</td><td>INplus55</td><td>渡りバッタ胚培養用</td></tr><tr><td>メタルバス</td><td>TIANGEN</td><td>AJ-800</td><td>サンプル加熱用</td></tr><tr><td>マイクロオートインジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td>5253000068</td><td>開発初期の胚のマイクロインジェクション</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>Allsheng</td><td>MTV-1</td><td>試薬の混合に使用</td></tr><tr><td>マイクログラインダー</td><td>ナリシゲ</td><td>EG-401</td><td>注射針の先端を接地する</td></tr><tr><td>マイクロローダー エ</td><td>ッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td>注射針に溶液を装填します。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーションシステム</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td>マイクロインジェクション用アルチネーションマニピュレーションシステム</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>cnoptec</td><td>SZ780</td><td>マイクロインジェクション用</td></tr><tr><td>モータードライブマニピュレーター</td><td>ナリシゲ</td><td>MM-94</td><td>マイクロインジェクション先行時のマイクロピペットの位置制御用</td></tr><tr><td>マルチサンプルティッシュグラインダー</td><td>jingxin</td><td>Tissuelyser-64</td><td>卵を挽いて均質化</td></tr>します <tr>卵<td>卵ポット</td><td>ChangShengYuanYi</td><td>CS-11</td><td>イナゴの産卵のための湿った滅菌砂で満たされています。オーシストはこの容器から採取されます。オンラインで購入しました。</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>パラフィルムM</td><td>PM996</td><td>シャーレのラッピングに。</td></tr><tr><td>pEASY-T3クローニングキット</td><td>TransGen Biotech</td><td>CT301-01</td><td>TAクローニング用</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>NEST</td><td>752001</td><td>卵子の培養と保存用。</td></tr><tr><td>ピペッター</td><td>・エッペンドルフ</td><td>・リサーチ・プラス</td><td>サンプルローディング用</td></tr><tr><td>プラスチック培養カップ</td><td></td><td></td><td>イナゴを別々に飼育し、十分な大きさ(容量1000mL以上)のプラスチックカップであれば何でも構いません。</td></tr><tr><td>精密gRNA合成キット</td><td>Thermo</td><td>A29377</td><td>for sgRNA合成</td></tr><tr><td>Primer Premier</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>Primer Premier 5.00</td><td>プライマーデザイン用</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Insightful Science</td><td>SnapGene&reg;4.2.4</td><td>分析用&nbsp; シーケンス</td></tr><tr><td>鋼球</td><td>HuaXinGangQiu</td><td>HXGQ60</td><td>サンプル研削用。オンラインで購入しました。</td></tr><tr><td>ヒント</td><td>バイオリーフ</td><td>D781349</td><td>サンプルローディング用</td></tr><tr><td>Trans DNA マーカー II</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM411-01</td><td>遺伝子サイズの決定に使用</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 タンパク質 v2</td><td>サーモ</td><td>A36496</td><td>Cas9 タンパク質</td></tr><tr><td>UniversalGen DNA キット</td><td>Cwbio</td><td>CWY004</td><td>ゲノムDNA抽出用</td></tr><tr><td>VANNAS はさみ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72932-01</td><td>触角を切断するための</td></tr><tr><td>小麦</td><td></td><td></td><td>イナゴの餌として小麦の苗を生成します。地元の農家から購入</td></tr>。<tr><td>ZiFiT</td><td></td><td></td>オンライン<td>のウェブサイト sgRNAを設計するため、http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

渡りバッタである Locusta migratoriaは、人類に莫大な経済的損失をもたらした世界的なペストバッタの1つであるだけでなく、昆虫の変態の重要な研究モデルでもあります。CRISPR/Cas9システムは、特定のDNA遺伝子座を正確に特定し、標的部位内で切断し、二本鎖切断を効率的に導入して標的遺伝子ノックアウトを誘導したり、新しい遺伝子断片を特定の遺伝子座に組み込んだりすることができます。CRISPR/Cas9を介したゲノム編集は、イナゴの研究で遭遇する問題に対処するための強力なツールであり、バッタ防除のための有望な技術です。この研究は、移動性バッタにおけるCas9タンパク質とシングルガイドRNA(sgRNA)の複合体を使用したCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウトの系統的プロトコルを提供します。標的部位の選択とsgRNAの設計について詳細に説明し、その後、 in vitro 合成とsgRNAの検証を行います。その後の手順には、卵いかだの収集と日焼け卵の分離が含まれ、死亡率の低いマイクロインジェクションの成功、卵の培養、突然変異率の予備推定、イナゴの繁殖、および編集されたイナゴの個体群の安定性を確保するための突然変異体の検出、保存、および通過が含まれます。この方法は、渡りバッタや他の昆虫におけるCRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集アプリケーションのリファレンスとして使用できます。

このプロトコルには、Cas9タンパク質と in vitro で合成されたsgRNAからなるRNPを持つ移動性イナゴのホモ接合変異体を生成するための詳細な手順が含まれています。以下は、標的選択、sgRNA合成と検証(図1A)、採卵と注射、変異体スクリーニングと継代、凍結保存、ホモ接合卵の蘇生など、イナゴにおけるCRISPR/Cas9を介した標的遺伝子ノックアウトの代表的な結果です。
本研究では、3つのオンラインプログラム(E-CRISP、CRISPOR、およびZiFit)の結果に従って、CRISPR/Cas9システムのターゲットサイトを選択し、最初のエクソンに配置します(図1B)。 in vitro でのCas9切断アッセイ(表1)によると、CRISPR/Cas9 RNPはPCRフラグメント(標的部位を含む)を約55%の切断率で消化することができました(図...

この研究は、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼベースのホモ接合型ローカスト変異体の構築の体系的に最適化された手順と、イナゴ卵の凍結保存と蘇生のための詳細な方法を提供します。

CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

渡りバッタは重要な農業テストです。この方法は、の遺伝子圧法のための効率的で容易な収量プロトコルを提供します これは、卵の収集、変異体のスクリーニング、およびホモ接合の維持を含む、ホモ接合型イナゴ変異体のCRISPR/CAS9構築の体系的かつ詳細な方法です。はじめに、マイクロピペットプラーでガラス毛細血管を引っ張って注射針を準備します。テキスト原稿に記載されているようにパラメータを設定し、注射針の先端をマイクログラインダーで研削します。1マイクロリットルのCas9タンパク質と1マイクロリットルの検証済みシングルガイドRNAを混合して、注射用のリボ核タンパク質を準備します。次に、8マイクロリットルのRNAの遊離滅菌水を加えて、混合物の最終容量を10マイクロリットルにします。溶液を完全に混合し、氷の上に置きます。次に、卵子位のさやから産みたての卵のさやを集め、卵の日焼けを待ちます。30分後、細かいブラシを使用して卵を卵のさやから水中で隔離し、滅菌水で卵を3回洗います。次に、卵をペトリ皿に入れ、滅菌水を加えて湿らせます。調製したリボヌクレオタンパク質溶液を注射針に充填し、マイクロマニピュレーターに注入液をロードします。マイクロインジェクションパラメータを、射出圧力300ヘクトパスカル、射出時間0.5秒、補正圧力25ヘクトパスカルに設定します。パラメータが設定されたら、ペダルを押して注入された溶液の量を評価します。射出圧力と射出時間を調整して、射出量が約50〜100ナノリットルになるようにします。滅菌卵を注射パッドに定期的に配置した後、パッドを顕微鏡のオブジェクトテーブルに置き、卵が観察されるまで顕微鏡の倍率を調整します。次に、注射の先端が見えるまで顕微鏡下でマイクロ注射針を調整し、注射する卵の近くに先端を配置します。適切な高さと30〜45度の角度で注射を開始します。卵のマイクロパイル近くの卵に先端を挿入し、ペダルを押して注射を行います。次に、針をすばやく引っ込めて、次の卵を注入するために注射パッドを動かします。注入した卵を湿ったろ紙の入った培養皿に移します。摂氏30度のインキュベーターに入れます。注射後、注射した卵の発育を毎日確認してください。注入した卵を最初の5日間は24時間ごとに新しい培養皿に移します。注射後6日目に、10個の卵をランダムに摘んでチューブに移し、グラインダーを使用して60ヘルツで6分間2つの鋼球で卵を適切に粉砕します。粉砕後、破片を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、再懸濁した混合物5マイクロリットルを45マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムに移し、摂氏95度で5分間溶解します。アルカリ溶解反応を終了するには、5マイクロリットルの1モルの塩酸トリス溶液を溶解システムに加えます。1マイクロリットルの溶解産物をPCRテンプレートとして取り、標的遺伝子断片を増幅します。PCRとシーケンシングの後、シーケンシング結果を野生型配列と比較して、CRISPR/Cas9システムがin vivoで標的遺伝子を切断したかどうかを評価します。胚の段階でインデルが検出されるため、残りの卵子をその後の開発に任せます。発育後、孵化したニンフを原稿に記載されているように飼育ケージに移して培養します。ニンフが5齢期に発達したら、プラスチック製の培養カップでそれらを分離します。G0変異体と野生型バッタを用いた交雑育種を行う。オアシストを集めた後、各オアシストに3〜6個の発育卵を使用して、前述のように突然変異を検出します。その後の開発のために突然変異陽性のオアシストを保持し、突然変異陰性オアシストを放棄します。凍結保存のために、卵を滅菌水で洗い、前に説明したように培養皿でインキュベートします。5〜6日後、卵を培養皿に集め、ろ紙の破片で覆います。次に、培養皿全体をパラフィンフィルムで包みます。皿を摂氏25度で2日間置き、続いて摂氏13〜16度の低温でさらに2日間置きます。次に、皿を摂氏6度の冷蔵庫に移します。卵のための湿った環境を提供するために2週間ごとに皿に水を追加します。最後に、凍結保存された卵を蘇生させるために、ペトリ皿を摂氏25度で2日間置きます。その後、ニンフが孵化するまで卵を摂氏30度のインキュベーターに入れます。本研究では、CRISPR/Cas9系の標的部位は第1エクソンに位置していました。Cas9切断アッセイでは、CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質は、約55%の切断率で標的部位を含むPCR断片を消化することができ、胚期突然変異率推定のためのシーケンシング結果は、標的部位での効率的なゲノム編集を示唆した。編集効率の結果、ニンフの孵化率は52.73%で、G0成体の66.67%がモザイク変異体でした。変異株の継代戦略をここに示す。余剰のホモ接合卵を凍結保存し、ホモ接合体の利用率を向上させた。凍結保存卵の孵化率は凍結保存時間の延長に伴って低下したが,ろ紙片を塗布し,温度上昇勾配で回収するなどの改善措置が蘇生に役立った。最も重要なことは、マイクロインジェクションによって引き起こされる機械的損傷を制限しようとすることです。この手順は、他の昆虫を達成するための参照として使用できます。採卵方法、注射方法、作物などの詳細の一部を変更する必要があります。この技術は、昆虫の変態と環境適応の研究にも役立ち、ホモ接合型のイナゴ変異体の構築がこの分野の研究を加速させました。

construction-homozygous-mutants-migratory-locust-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null...

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア...

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9は、非モデル生物の遺伝子機能を特徴付けるためにますます使用されています。このプロトコルは、注射ミックスの調製から蚊の胚の取得と注入に、および必要な突然変異のために注入された蚊とその子孫を飼育、横断、およびスクリーニングする方法に 、Culex...

CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電...

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

ここでは、 ナソニアビトリペンシス での効率的なプパルおよび成人注射を胚微小注射の代替手段として説明し、RNA干渉(RNAi)またはCRISPR/Cas9ゲノム編集によるRNAサイレンシングまたは遺伝子ノックアウトのいずれかを使用して目的の遺伝子の機能解析を可能にする。...

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

このプロトコルは、胚の採取、注射、昆虫飼育、同定、および目的の突然変異の選択など、砂ハエにおけるCRISPR/Cas9標的突然変異のステップを詳述する。...

CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。...

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera...

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

ここには、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集を介してゲノムを改変する目的で、または生殖系列形質転換を介して顕著な転移性要素を追加する目的で、前細胞トウモロコシウンカ胚を収集してマイクロ注入するためのプロトコルがあります。...

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

この論文は、オリエンタルショウジョウバエBactrocera dorsalisのCRISPR/Cas9突然変異誘発のための段階的なプロトコルを提示します。この標準化されたプロトコルによって提供される詳細な手順は、B.

オリエンタルショウジョウバエバクトセラ背側のCRISPR/Cas9変異誘発のためのプロトコル

学ぶ CRISPR/Cas9を用いた渡りバッタのホモ接合変異体構築法と胚の凍結保存・復活法。ゲノム編集効率と変異体系統維持のプロトコルを解説し、昆虫遺伝学研究と農業害虫管理への応用を示す。

CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

さらに動画を探す