CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

渡りバッタは重要な農業テストです。この方法は、の遺伝子圧法のための効率的で容易な収量プロトコルを提供します これは、卵の収集、変異体のスクリーニング、およびホモ接合の維持を含む、ホモ接合型イナゴ変異体のCRISPR/CAS9構築の体系的かつ詳細な方法です。はじめに、マイクロピペットプラーでガラス毛細血管を引っ張って注射針を準備します。

テキスト原稿に記載されているようにパラメータを設定し、注射針の先端をマイクログラインダーで研削します。1マイクロリットルのCas9タンパク質と1マイクロリットルの検証済みシングルガイドRNAを混合して、注射用のリボ核タンパク質を準備します。次に、8マイクロリットルのRNAの遊離滅菌水を加えて、混合物の最終容量を10マイクロリットルにします。

溶液を完全に混合し、氷の上に置きます。次に、卵子位のさやから産みたての卵のさやを集め、卵の日焼けを待ちます。30分後、細かいブラシを使用して卵を卵のさやから水中で隔離し、滅菌水で卵を3回洗います。

次に、卵をペトリ皿に入れ、滅菌水を加えて湿らせます。調製したリボヌクレオタンパク質溶液を注射針に充填し、マイクロマニピュレーターに注入液をロードします。マイクロインジェクションパラメータを、射出圧力300ヘクトパスカル、射出時間0.5秒、補正圧力25ヘクトパスカルに設定します。

パラメータが設定されたら、ペダルを押して注入された溶液の量を評価します。射出圧力と射出時間を調整して、射出量が約50〜100ナノリットルになるようにします。滅菌卵を注射パッドに定期的に配置した後、パッドを顕微鏡のオブジェクトテーブルに置き、卵が観察されるまで顕微鏡の倍率を調整します。

次に、注射の先端が見えるまで顕微鏡下でマイクロ注射針を調整し、注射する卵の近くに先端を配置します。適切な高さと30〜45度の角度で注射を開始します。卵のマイクロパイル近くの卵に先端を挿入し、ペダルを押して注射を行います。

次に、針をすばやく引っ込めて、次の卵を注入するために注射パッドを動かします。注入した卵を湿ったろ紙の入った培養皿に移します。摂氏30度のインキュベーターに入れます。

注射後、注射した卵の発育を毎日確認してください。注入した卵を最初の5日間は24時間ごとに新しい培養皿に移します。注射後6日目に、10個の卵をランダムに摘んでチューブに移し、グラインダーを使用して60ヘルツで6分間2つの鋼球で卵を適切に粉砕します。

粉砕後、破片を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、再懸濁した混合物5マイクロリットルを45マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムに移し、摂氏95度で5分間溶解します。アルカリ溶解反応を終了するには、5マイクロリットルの1モルの塩酸トリス溶液を溶解システムに加えます。

1マイクロリットルの溶解産物をPCRテンプレートとして取り、標的遺伝子断片を増幅します。PCRとシーケンシングの後、シーケンシング結果を野生型配列と比較して、CRISPR/Cas9システムがin vivoで標的遺伝子を切断したかどうかを評価します。胚の段階でインデルが検出されるため、残りの卵子をその後の開発に任せます。

発育後、孵化したニンフを原稿に記載されているように飼育ケージに移して培養します。ニンフが5齢期に発達したら、プラスチック製の培養カップでそれらを分離します。G0変異体と野生型バッタを用いた交雑育種を行う。

オアシストを集めた後、各オアシストに3〜6個の発育卵を使用して、前述のように突然変異を検出します。その後の開発のために突然変異陽性のオアシストを保持し、突然変異陰性オアシストを放棄します。凍結保存のために、卵を滅菌水で洗い、前に説明したように培養皿でインキュベートします。

5〜6日後、卵を培養皿に集め、ろ紙の破片で覆います。次に、培養皿全体をパラフィンフィルムで包みます。皿を摂氏25度で2日間置き、続いて摂氏13〜16度の低温でさらに2日間置きます。

次に、皿を摂氏6度の冷蔵庫に移します。卵のための湿った環境を提供するために2週間ごとに皿に水を追加します。最後に、凍結保存された卵を蘇生させるために、ペトリ皿を摂氏25度で2日間置きます。

その後、ニンフが孵化するまで卵を摂氏30度のインキュベーターに入れます。本研究では、CRISPR/Cas9系の標的部位は第1エクソンに位置していました。Cas9切断アッセイでは、CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質は、約55%の切断率で標的部位を含むPCR断片を消化することができ、胚期突然変異率推定のためのシーケンシング結果は、標的部位での効率的なゲノム編集を示唆した。

編集効率の結果、ニンフの孵化率は52.73%で、G0成体の66.67%がモザイク変異体でした。変異株の継代戦略をここに示す。余剰のホモ接合卵を凍結保存し、ホモ接合体の利用率を向上させた。

凍結保存卵の孵化率は凍結保存時間の延長に伴って低下したが,ろ紙片を塗布し,温度上昇勾配で回収するなどの改善措置が蘇生に役立った。最も重要なことは、マイクロインジェクションによって引き起こされる機械的損傷を制限しようとすることです。この手順は、他の昆虫を達成するための参照として使用できます。

採卵方法、注射方法、作物などの詳細の一部を変更する必要があります。この技術は、昆虫の変態と環境適応の研究にも役立ち、ホモ接合型のイナゴ変異体の構築がこの分野の研究を加速させました。