Name: 微胞子虫感染症の カエノラブディティス・エレガンス モデルにおける遺伝性免疫の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ微胞子虫Nematocida parisiiに対するCaenorhabditis elegansの遺伝性免疫メカニズム。親から子へ伝わる免疫の分子基盤を解明し、宿主病原体相互作用の理解に貢献する。

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ウィニー・ジャオとイン・チェン・ワンが原稿について有益なコメントをくれたことに感謝しています。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(Grant #522691522691)の支援を受けた。

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<li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+microsporidia%3A+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276(2020).</li>
<li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+host+cells+by+microsporidia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172(2020).</li>
<li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion%2C+proliferation+and+exit%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247(2020).</li>
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<li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+discreet+escape%3A+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li>
<li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li>
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<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li>
<li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458(2022).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496(2011).</li>
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<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093(2016).</li>
<li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724(2016).</li>
<li>Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309(2008).</li>
<li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved%2C+stress-specific%2C+and+have+deleterious+trade-offs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425(2021).</li>
<li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738(2020).</li>
<li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

本プロトコールは、単純で遺伝的に扱いやすいN. parisii-C. elegans感染モデルにおける微胞子虫および遺伝性免疫の研究を記載する。
胞子調製は、生産性に応じて、典型的には6ヶ月間の実験に十分な胞子を生じる集中的なプロトコールである24。重要なことに、感染力は、実験に使用する前に、新しい胞子「ロット」ごとに決定されなければならない。胞子調製物間の感染力のばらつきのために、単一のロットは、実験のすべての反復に対して一貫して使用されなければならない。個々のアリコートは、融解が胞子を発火させ、感染力を低下させる可能性があるため、解凍して再凍結すべきではありません。そのため、胞子は感染直前に-80°Cの冷凍庫から取り出し、ベンチにいる間は氷上で維持する必要があります。
ステップ5〜6において、感染アッセイを概説した。感染アッセイ中は、動物の汚染や飢餓を避けることが重要であり、これはF1の免疫を混乱させる追加の世代間効果をもたらす可能性がある...

遺伝性免疫はエピジェネティックな現象であり、それによって親が病原体にさらされ、感染抵抗性の子孫の産生を可能にすることができる。このタイプの免疫記憶は、適応免疫系を欠いており、ウイルス性、細菌性、および真菌性の疾患から保護することができる多くの無脊椎動物で示されている1。遺伝性免疫は健康と進化の両方を理解する上で重要な意味を持つが、この保護の根底にある分子メカニズムはほとんど知られていない。これは、遺伝性免疫が記載されている動物の多くが、研究のためのモデル生物として確立されていないことも一因である。対照的に、透明な線虫Caenorhabditis elegansにおける研究は、広範な遺伝的および生化学的ツールキット2,3、高度に注釈付きゲノム4,5、および短い生成時間から利益を得る。実際、C. elegansの研究は、エピジェネティクスと自然免疫6,7の分野における根本的な進歩を可能にし、現在は免疫記憶8,9を研究するための確立されたモデルです。
微胞子虫は、ほぼすべての動物に感染し、免疫不全のヒトに致死的な感染症を引き起こす真菌病原体です10。感染は、微胞子虫胞子が極性管と呼ばれる構造を使用して宿主細胞にその細胞内容物(スポロプラズム)を注入または「発火」したときに始まります。寄生虫の細胞内複製は、メロントの形成をもたらし、これは最終的に細胞11、12を出ることができる成熟胞子に分化する。これらの寄生虫は人間の健康と食料安全保障の両方に有害ですが、感染生物学についてはまだ学ぶべきことがたくさんあります12。線虫パリシイは、ワームの腸細胞内で排他的に複製する天然のマイクロスポリジウム寄生虫であり、繁殖力の低下、そして最終的には死をもたらす。N. parisii-C. elegans感染モデルは、(1)病原体クリアランスにおけるオートファジーの役割13、(2)微胞子虫が感染細胞から非溶解的にどのように出ることができるか14、(3)病原体が合胞体15を形成することによって細胞から細胞へとどのように広がることができるか、(4)N. parisiiが宿主16と界面するために用いるタンパク質、および(5)転写細胞内病原体応答(IPR)17の調節、18。
C. elegansの感染に関するプロトコルは、現在の研究に記載されており、ユニークな微胞子虫生物学を明らかにし、感染に対する宿主の応答を解剖するために使用することができる。キチン結合色素Direct Yellow 96(DY96)で染色された固定ワームの顕微鏡観察は、キチン含有微胞子虫胞子の腸全体に感染が広がることを示している。DY96染色はまた、宿主の適応度の読み出しとしてワームの重力(胚を産生する能力)の同時評価のために、キチン含有ワーム胚の視覚化を可能にする。
最近の研究により、N. parisiiに感染したC. elegansは、同じ感染に対して頑丈に耐性のある子孫を産むことが明らかになりました19。この遺伝性免疫は単一世代持続し、より重度に感染した両親からの子孫が微胞子虫に対してより耐性であるため、用量依存的である。興味深いことに、N. parisii-primedの子孫はまた、細菌の腸内病原体緑膿菌に対してより耐性があるが、天然の病原体オルセーウイルス19に対して保護されていない。本研究はまた、免疫プライムされた子孫が微胞子虫による宿主細胞の侵入を制限することを示している。この方法はまた、免疫プライミングされた子孫の収集と、FISHを使用して腸細胞中のN. parisii RNAを検出し、宿主細胞の侵入および胞子の発火をアッセイする方法についても説明しています20。
これらのプロトコルは、 C. elegansにおける微胞子虫および遺伝性免疫を研究するための強固な基盤を提供する。このモデルシステムにおける今後の研究により、遺伝性免疫の新生領域における重要な発見が可能になることが期待されます。これらの技術は、他の宿主生物における微胞子虫誘発遺伝性免疫を調査するための出発点となる可能性もある。

<table><tbody><tr><td>2.0 mmジルコニアビーズ</td><td>Biospec Products Inc.</td><td>11079124ZX</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482613</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu;mフィルター</td><td>ミリポア シグ</td><td>マ SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>アクシオイメージャー 2</td><td>ツァイス</td> - <td></td><td>顕微鏡スライド上のDY96-およびFISH-染色されたワームのイメージングのための蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>アクシオズーム V.16 蛍光ステレオズーム顕微鏡</td><td>ツァイス</td> <td>-</td><td>IPRを視覚化するための蛍光トランスジェニック動物のライブイメージングに</td></tr><tr><td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td><td>Baker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ビーズディスラプター、Genie SI-D238 アナログディスラプター Genie Cell Disruptor、120 V</td><td>Global Industrial</td><td>T9FB893150</td><td></td></tr><tr><td>Cell-VU スライド、Millennium Sciences ディスポーザブル精子カウントサイトメーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>DRM600</td><td></td></tr><tr><td>Direct Yellow 96</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S472409-1G</td><td></td></tr><tr><td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td><td>Biotium</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td><td>Biotium</td><td>23002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ software</td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>メカニカルローター</td><td>Thermo Sceintific</td><td>415110 / 1834090806873</td> 一<td>晩孵化するための漂白胚のチューブを回転させるために使用されます</td></tr><tr><td>MicroB FISHプローブ</td><td>Biosearch Technologies Inc.</td><td>-</td><td>クエーサー570(Cy3)5'修飾およびHPLC精製、CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td></tr><tr><td>N2</td><td>野生型、ブリストル株</td><td>と合成 デフォルト株</td><td>Caenorhabditis Genetics Center(CGC)</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液(5 N)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>FLSS256500</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム溶液(6%)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 508 実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td> <td>-</td> <td>ワームの日常的なメンテナンスとアッセイセットアップのための L1 ワームのカウント用</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield + A16</td><td>Biolynx</td><td>VECTH1500</td><td></td></tr></tbody></table>

微胞子虫感染症の カエノラブディティス・エレガンス モデルにおける遺伝性免疫の研究

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

遺伝性免疫は、いくつかの動物が以前の感染の「記憶」を子孫にどのように渡すことができるかを表しています。これは、子孫の病原体耐性を高め、生存を促進することができる。遺伝性免疫は多くの無脊椎動物で報告されているが、このエピジェネティック現象の根底にあるメカニズムはほとんど知られていない。天然の微胞子虫病原体ネマトシダ・パリシイによるカエノラブディティス・エレガンスの感染は、微胞子虫に対して頑丈に耐性のある子孫を産生するワームをもたらす。本プロトコールは、単純かつ遺伝的に扱いやすいN. parisii-C. elegans感染モデルにおける世代間免疫の研究を記載する。現在の記事では、C. elegansに感染し、免疫プライムされた子孫を生成する方法について説明します。微胞子虫の染色および顕微鏡による感染の可視化による微胞子虫感染に対する耐性をアッセイするための方法も与えられる。特に、遺伝性免疫は微胞子虫による宿主細胞の侵入を防ぎ、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いて浸潤事象を定量化することができる。免疫プライミングされた子孫において産生される微胞子虫胞子の相対量は、胞子をキチン結合色素で染色することによって定量することができる。今日まで、これらの方法は、遺伝性免疫の動態および病原体特異性、ならびにその根底にある分子メカニズムに光を当ててきた。これらの技術は、C. elegansの研究に利用可能な広範なツールとともに、遺伝性免疫の分野における重要な発見を可能にするでしょう。

本研究では、 C. elegans (P0)の親集団は、低用量の N. parisii 胞子でL1段階で感染した。これらの感染状態は、典型的には、両親の漂白を通じて多数の微胞子虫耐性F1子孫を得るために使用される。感染した親集団および非感染対照を72hpiで固定し、DY96で染色して、ワーム胚および微胞子虫胞子を視覚化した(図1A)。感染した動物は小さく、多くの微胞子虫胞子を含み、健康な非感染対照よりも少ない胚を産生する。ワームの重力の評価は、感染していない動物の〜95%が子孫を産んだのに対し、感染した動物の80%未満であることを示した(図1B)。定量は、DY96染色胞子を含むワームの数によって決定されるように、微胞子虫処理集団の約90%が感染していることを明らかにした(図1C)。免疫プライムF1子孫を得るためには、ほとんどの親が感染していることを保証するのに十分高いが、集団がまだ子孫を産生できることを保証するのに十分低い微...

微胞子虫寄生虫ネマトシダ・パリシイによるCaenorhabditis elegansの感染は、ワームが同じ病原体に対して非常に耐性のある子孫を産むことを可能にする。これは遺伝性免疫の一例であり、り理解されていないエピジェネティック現象である。本プロトコールは、遺伝的に扱いやすいワームモデルにおける遺伝性免疫の研究を記述している。

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

これらのプロトコルは、微胞子虫に対する遺伝性免疫の研究を可能にする。ここで説明する技術は、免疫が世代を超えてどのように伝達されるか、および子孫の微胞子虫に対する免疫を決定する分子を理解するのに役立ちます。C.elegansは、遺伝をアッセイするための短い生成時間を持つシンプルで遺伝的に扱いやすいモデルです。ワームに利用可能な多くのツールは、世代間免疫の分子メカニズムを明らかにするために使用することができます。P0動物に感染するときは、親の子孫の能力に有意に影響を及ぼさない低胞子用量を使用してください。これにより、漂白により下流の実験に十分なF1動物が得られることが保証されます 開始するには、計画された感染の1日前に、必要な数の10センチメートルの播種されていない線虫増殖培地プレートを摂氏4度から室温に移動します。感染の直前に、マイクロフュージチューブ内の約2,500匹の同期L1ワームを1,400倍のGで30秒間ペレットダウンした。上清をピペットチップで取り除き、50マイクロリットルのM9培地にワームを残します。10倍大腸菌OP50株を1ミリリットルを1段階のワームに加え、N.parisii胞子を所望の濃度にする。非感染対照として、使用した胞子調製物の体積と同等の量のM9培地を有するL1sおよびOP50の同等のチューブを調製する。L1ワームサンプルを短時間ボルテックスして混合し、1ミリリットル以上のワームを10センチメートルの播種されていない線虫増殖培地プレート上にプレートします。液体がプレート全体に広がるように渦巻きます。蓋を外した状態でプレートを清潔なキャビネットで10〜20分間乾燥させるか、完全に乾くまで乾燥させてから、摂氏21度で72時間インキュベートします。感染後72時間で、解剖顕微鏡下でプレートを調べる。感染したワームのプレートは、感染していないワームのプレートよりも胚が少ないはずです。その後、1ミリリットルのM9培地を使用して、プレートからワームをマイクロ遠心チューブに洗い流します。プレート上に多くのワームが残っている場合は、1400倍Gで30秒間遠心分離してワームをペレット化する。上清を除去し、追加のプレート洗浄を行う。1400倍Gで室温で30秒間遠心分離してワームをペレット化し、1ミリリットルのM9培地で、または上清が透明になるまで2回洗浄する。1ミリリットルのM9メディアの最終容量に再懸濁し、ピでよく混ぜる。100マイクロリットルの懸濁したワームを新鮮なチューブに移し、残りの900マイクロリットルを漂白して成虫を分解し、試験のためにF1胚を放出する。変更を加えて感染を実行します。原稿で述べたように。感染後72時間で、解剖顕微鏡下でプレートを検査する。素朴な虫のプレートは、プライミングされたワームのプレートよりも小さく、胚が少ないはずです。次

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Immunology and Infection

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微胞子虫感染症のカエノラブディティス・エレガンスモデルにおける遺伝性免疫の研究

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