Name: マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶマルチモーダル非線形光学顕微鏡法で、がん細胞内の金ナノ粒子を化学的特異的にイメージングする手法です。高速ハイパースペクトルイメージングにより生体分子コントラストを詳細に評価できます。

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この研究は、EPSRC Grants: Raman Notheranostics (EP/R020965/1) および CONTRASTファシリティ (EP/S009957/1) の支援を受けた。

1.レーザーシステムのスイッチを入れる
<ol><li>システムを起動する前に、インターロックシステムのスイッチを入れ、アームレーザーを選択してください。</li>
	<li>ソフトウェアを使用してPCの電源を入れ、デュアル出力フェムト秒レーザーを制御します。</li>
	<li>デュアル出力フェムト秒レーザーのソフトウェアをロードします。このソフトウェアにより、レーザーの電源のオンとオフが可能になり、ポンプビームの波長を直接制御できます。</li>
	<li>電源アイコンを3カウント押し続けて、レーザー放射をオンにします。</li>
	<li>レーザーがウォームアップし、ソフトウェアでレーザー対応ライトが緑色に点灯するまで待ちます。</li>
	<li>ポンプビームの波長は、ソフトウェアを介して直接制御されます。これは680〜1,300nmの範囲であり得る。C-Hラマン振動領域の細胞イメージングには、802 nmを選択します。</li>
	<li>調整可能なポンプビームと1,045nmのストークスビームのシャッターを、絞り画像を3秒間押し続けて開きます。 注意: レーザー安全ガイダンスデュアル出力フェムト秒レーザーはクラスIV赤外線パルスレーザーであり、視力に永久的な損傷を与える可能性があります。したがって、この手順を実行する際には、すべてのレーザー安全ローカルルールに従う必要があります:(i)レーザー安全トレーニングを受けた許可されたユーザーのみが手順を実行できます。(ii)ラボへの入場は、部屋のドアのインターロックを備えたスワイプカードアクセスを介して行われます。(iii)ほとんどの操作では、レーザービームは完全に密閉されています。(iv)レーザービームが露光されるときは、レーザー安全ゴーグルを着用する必要があります(ポンプとストークスビームの両方をOD 9+遮断するLG7レーザー安全ゴーグルを使用してください)。</li>
</ol>2. スペクトル集束タイミング再結合ユニット(SF-TRU)のスイッチを入れる
<ol><li>SF-TRUユニットの遅延段とレーザーアッテネータを制御するレーザーソフトウェアを使用して、同じPCにATMソフトウェアをロードします。 注意: このユニットは、ポンプとストークスビームが空間的に重なっていることを確認し、ポンプとストークスビームの分散を制御し、ポンプとストークスビームの間の時間遅延を制御する役割を果たします。ポンプビームとストークスビームの両方の偏光は垂直です。各ビームには、SF-TRUを出る前に偏光を個別に制御するための半波長プレートが装備されていることに注意してください。</li>
	<li>ポンプとストークスレーザーの両方が<10%(ポンプ)と<15%(ストークスビーム)に減衰していることを確認してください。ビームが減衰しない場合、レーザー出力はシステムに損傷を与え、生物学的サンプルを燃焼させる可能性があります。</li>
	<li>セルラーイメージングの場合、最適なレーザー設定を6%(ポンプ)と10%(ストークス)に設定し、サンプルの12 mWと30 mWに対応します。</li>
	<li>SF-TRUには、フェムト秒(fs)モードとピコ秒(ps)モードの2つの設定があります。</li>
	<li>fsモードの場合は、ボックスの両側にあるノブを押し込みます(これにより、ビームパスから分散格子が削除されます)。</li>
	<li>psモードの場合は、ボックスの両側にあるノブを引き出します(これにより、分散格子がビームパスに配置されます)。</li>
	<li>ハイパースペクトルイメージングの場合は、psモードを選択します。</li>
	<li>遅延容量を確認してくださいtageこのシステムでのCHイメージングのためにポンプとストークスビームが時間的に重なるように正しい位置にあります。</li>
	<li>ポンプとストークスビームの分散設定が正しいことを確認してください。802 nmポンプの場合、これはポンプビームの場合は5 mm、ストークスビームの場合は30 mmです。</li>
</ol>3. SRSイメージングのためのストークスビームの変調
<ol><li>SRS検出の場合は、ストークスビームの強度を変調します。</li>
	<li>ビーム変調の信号発生器をオンにします。</li>
	<li>次のような以前の設定を思い出してください。 出力1:矩形波:周波数= 19.5 MHz、振幅= 1.4 V。 出力2:矩形波:周波数= 19.5 MHz、振幅= 300 mV。</li>
	<li>出力1と2のスイッチを入れます。</li>
	<li>出力1をBNCケーブル を介して SF-TRUボックス内のEOM用のアンプに接続します。</li>
	<li>出力2をSRS検出に使用するロックインアンプにBNCケーブル で 接続します。</li>
	<li>ガントリーのアンプへの電源をオンにします。</li>
</ol>4.ロックインアンプのスイッチを入れる
<ol><li>SRSイメージングには、大面積フォトダイオードと専用のロックインアンプで構成されるSRS検出モジュールを使用します。</li>
	<li>ガントリーのロックインアンプへの電源をオンにします。</li>
	<li>ロックインアンプ「SRS検出モジュール」のソフトウェアをPCにロードします。</li>
	<li>ソフトウェアで、位相 = 0°、オフセット = -80 mW、ゲイン = 58 dB の設定を選択します。</li>
	<li>ソフトウェアでロックインアンプ積分時定数を選択します:細胞イメージングの場合、2μsの時定数は高品質の画像を提供します。</li>
</ol>5.レーザー走査型顕微鏡での操作
<ol><li>リモコンボックスを除くすべての機器のプラグをオンにします。ガントリーの上部にあるコントロールボックスでスタンバイが点灯するまで待ちます。</li>
	<li>ガントリーのリモコンボックスのスイッチを入れ、ボックスの背面のスイッチを入れます。リモートライトが(コントロールボックスの)青色になるまで待ち、[ 操作の開始]を押します。</li>
	<li>レーザー走査型顕微鏡のPCの電源を入れます。</li>
	<li>共焦点顕微鏡ソフトウェアを実行します。</li>
	<li>コンピュータソフトウェア を介して 顕微鏡の光路を確認してください。 注:SRSイメージングに適したものにするために、顕微鏡にいくつかの変更が加えられました:(i)ビームパスでは、レーザービームがスキャンユニットに入るフィルターホイールに775nmのショートパスが追加されており、これはコンピュータソフトウェアのLightpathタブで選択できます。(ii)共焦点顕微鏡の内蔵PMTを検出に使用する代わりに、特注の検出器が透過光路に追加され、SRSとCARSの両方の検出が可能になりました。(iii)これらの検出器からの出力は、ガントリーのアナログボックスに接続されています。PMTからのCARS信号はBNCケーブルを介してCD1に接続され、ロックインアンプからのSRS信号はBNCケーブルを介してCD2に接続されます。</li>
	<li>タッチスクリーン、リモコンノブ、またはコンピューターソフトウェアを介してフォーカスを制御します。</li>
	<li>ソフトウェアで目的の画像設定を選択します。これには、ズーム、ピクセル単位の画像サイズ、ピクセル滞留時間が含まれます。</li>
	<li>イメージング速度(ピクセル滞留時間)がロックインアンプソフトウェアで設定された積分時間よりも大きいことを確認してください。 注:イメージングにはNA1.2水浸対物レンズを使用しました。</li>
</ol>6. 顕微鏡ステージへのサンプルの取り付け
<ol><li>以下のようにしてイメージング用の細胞サンプルを調製する。<ol><li>10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI-1640で4T1マウス乳癌細胞を培養する。2日ごとに培地を交換し、70%〜80%のコンフルエントで細胞を通過させます。 注:パッセージ8〜10は、ここで説明する実験の過程で使用されました。</li>
		<li>イメージング実験では、正方形のカバーガラス上で1 x 10 5細胞を37°C、5 %CO2で24時間インキュベートします。次に、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、金ナノ粒子(細胞培養培地で1:100希釈、ストック濃度:2.3 x 10 10粒子/mL、直径:60 nm)で4時間インキュベートします。</li>
		<li>イメージングの前に、細胞を氷冷PBSで洗浄し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で15分間固定します。細胞をPBS 3xで洗浄し、イメージングのために2つのカバーガラスの間に取り付けます。</li>
	</ol></li>
	<li>水浸対物レンズの上に蒸留水の液滴を置き、レーザービームを対物レンズとサンプルの間のサンプルに集束させます。次に、サンプルを顕微鏡ステージに置きます。</li>
	<li>NA 1.4のコンデンサーは、順方向に伝播した光を収集します。コンデンサーとサンプルの間に水滴を塗布してイメージングします。コンデンサーの高さをサンプルから約1mm上に調整して、最大量の光を収集します。</li>
	<li>SRS検出器は可動マウント上にあり、収集光路からスライドインおよびスライドアウトすることができます。白色光を使用してサンプルに焦点を合わせるには、SRS検出器をビームパスから外します。</li>
	<li>検出器をビームパスに戻し、SRSイメージングの準備をします。</li>
</ol>7. ラマンシフトの変更とハイパースペクトルデータスタックの収集
注意: イメージングが行われるラマンシフトは、SF-TRUボックスの遅延ステージの位置とレーザーシステムからのポンプビームの波長に依存します。
<ol><li>ラマンシフトが大きく変化する場合は、レーザーの波長を変更します。たとえば、2,800〜3,100 cm-1のCH振動をイメージングするには802 nmを選択し、アミドIピークの1,600 cm-1付近をイメージングするには、898 nmのポンプビームを選択します。ソフトウェアを介してこれを調整します。</li>
	<li>ラマンシフトを微調整するには、SF-TRUユニットの遅延段をスキャンします。</li>
	<li>SF-TRUは、遅延ステージ位置をミリメートル(mm)単位で提供します。遅延ステージの位置をmmからcm-1に変換するには、ポリスチレンビーズのサンプルを使用してキャリブレーションハイパースペクトルスキャンを実行し、キャリブレーションスキャンで見つかったピーク位置を自発ラマンセットアップで取得したピーク位置と比較します。これにより、mm単位の遅延段位置をcm-1単位のラマンシフトに変換する線形方程式が得られます。</li>
	<li>ハイパースペクトルスキャンを生成するには、さまざまな遅延ステージ位置で時系列の画像を撮影します。</li>
	<li>画像の取得と遅延ステージの移動を同期させるには、アナログユニットを使用してSF-TRUシステムとの間でTTL信号を送受信します。 注:これを行うために、アナログボックスには次の接続があります:(i)TRIG OUT VD1:これはBNC を介して SF-TRUに接続され、TTL信号を送信して遅延段に+1増分を移動するように指示します。(ii)TRIG1では、遅延ステージが移動を終了するとBNC を介して 信号を受信し、これを使用して時系列の次の画像をトリガーします。</li>
	<li>ハイパースペクトルデータセットの場合は、共焦点顕微鏡ソフトウェアで次の設定を選択します。<ol><li>[トリガー] タブで、[TTL トリガーで開始 (オン)] と [トリガー (フレームごと)] を選択します。</li>
		<li>[ 系列 ] タブで、時系列を [ オン ] に設定し、z 系列を [オフ] に設定します。</li>
		<li>ATMソフトウェアのステップ数と一致するように時系列のフレーム数を設定します(ここでは101ステップを使用します)。</li>
	</ol></li>
	<li>ATMソフトウェアで、[ 実行 ]タブに移動します。<ol><li>ハイパースペクトルスキャンの開始と停止の遅延ステージ位置をミリメートル単位で設定します。CH高波数領域の場合は、開始位置= 90.25 mm、停止位置= 92.25 mmを使用します。</li>
		<li>ステップ数が共焦点顕微鏡ソフトウェアのフレーム数と一致していることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>正しい設定を確認した後、最初に共焦点顕微鏡ソフトウェアでハイパースペクトルスタックを起動します。 [取得 ]に移動し、[ スキャンの開始]をクリックします。次に、ATMソフトウェアで[ 開始]をクリックします。これにより、一連の画像の収集が開始され、選択した開始位置と停止位置の間の遅延ステージ位置が徐々に増加します。</li>
	<li>ハイパースペクトル画像シリーズをマルチフレーム.tifファイルとしてエクスポートし、適切なソフトウェアパッケージを使用してキャリブレーションを実行します。</li>
	<li>キャリブレーションが完了したら、線形キャリブレーション式を使用して、遅延ステージの位置をラマンシフトに変換します。</li>
	<li>CH振動領域(2,800〜3,100 cm-1)のイメージングをアミドI振動領域1,500〜1,700 cm-1)に切り替えるには、次の手順を実行します。<ol><li>レーザーソフトウェアのポンプ波長を802nmから898nmに変更します。</li>
		<li>ATM ソフトウェアのストークス分散設定を 30 mm から 5 mm に変更します。</li>
		<li>SF-TRUボックス内のポンプビーム分散経路のミラーを少し調整します。これは、ミラーマウントの下部ノブを調整することで行われ、ミラー角度が段階的に変更されます。</li>
		<li>アミドI領域でハイパースペクトルスキャンを実行する場合は、ATMソフトウェアの開始位置と停止位置をそれぞれ89mmと91mmに設定します。 注意: レーザービームが露出するため、この手順ではレーザー安全ゴーグルを着用する必要があります。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tabish, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+gold+nanostructures+for+light+mediated+cancer+theranostics%3A+Combining+optical+diagnostics+with+photothermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy.</a> Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441(2020).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanostars+for+efficient+in+vitro+and+in+vivo+real-time+SERS+detection+and+drug+delivery+via+plasmonic-tunable+Raman%2FFTIR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging.</a> Biomaterials. 106, 87-97 (2016).</li>
<li>Jenkins, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+photothermal+treatment+efficacy+and+normal+tissue+protection+via+vascular+targeted+gold+nanocages%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotheranostics%22%5BJournal%5D)">Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages.</a> Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+gammaFe2+O3+%40Au+magnetic+gold+nanoflowers+for+efficient+cancer+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics.</a> Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).</li>
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<li>Chrabaszcz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+and+HD+FT-IR+with+multimodal+CARS%2FTPEF%2FSHG%2FFLIMS+imaging+in+the+detection+of+the+early+stage+of+pulmonary+metastasis+of+murine+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer.</a> The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+radiofrequency-skin+interaction+using+multiphoton+microscopy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).</li>
<li>Wang, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+cutaneous+cancer+revealed+by+intravital+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (11), 113702(2010).</li>
<li>Li, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+skin+fold+chamber+for+high+resolution+multiphoton+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+and+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging.</a> Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).</li>
<li>Chong, S., Min, W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ground-state+depletion+microscopy%3A+Detection+sensitivity+of+single-molecule+optical+absorption+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+absorption+microscopy+of+gold+nanorods+as+spectrally+orthogonal+labels+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells.</a> Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).</li>
<li>Liu, J., Irudayaraj, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fluorescent+quantification+of+single+mRNA+with+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy.</a> Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li>
<li>Wang, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chemically+specific+mapping+of+agrochemical+seed+coatings+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108(2018).</li>
<li>Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+active+ingredients+uptake+in+seed+coats+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE+10069%2C+Multiphoton+Microscopy+the+Biomedical+Sciences+XVII%22%5BJournal%5D)">Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928(2017).</li>
<li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li>
<li>Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Module+for+multiphoton+high-resolution+hyperspectral+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE+10498%2C+Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences+XVIII%22%5BJournal%5D)">Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy.</a> Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980(2018).</li>
<li>Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+discrimination+of+normal+and+pulmonary+cancer+tissues+using+multiphoton+fluorescence+ratiometric+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (4), 043706(2010).</li>
<li>Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lipid+accumulation+in+the+green+microalga+botryococcus+braunii+with+frequency-modulated+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE+9329%2C+Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences+XV%22%5BJournal%5D)">Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering.</a> Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329(2015).</li>
<li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+plasmon-enhanced+CARS+and+TPEF+for+Gram+staining+identification+of+non-fluorescent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+A%3A+Molecular+and+Biomolecular+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria.</a> Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283(2022).</li>
<li>Ma, J., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopies+%28NOMs%29+and+plasmon-enhanced+NOMs+for+biology+and+2D+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nanophotonics%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials.</a> Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).</li>
<li>Sun, L., Chen, Y., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+nonemissive+excited-state+intramolecular+proton+transfer+by+plasmon-enhanced+hyper-Raman+scattering+and+two-photon+excitation+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

本研究では、SF-TRUモジュールと超高速デュアル出力レーザーシステムの組み合わせにより、マルチモーダル顕微分光法への応用を実証しました。マルチモーダルイメージングプラットフォームは、がん細胞による金ナノ粒子(AuNP)の取り込みを調査する機能により、レーザービームがAuNPに吸収された場合の温熱がん治療に対する細胞の応答を視覚化できます。
さらに、2組の格子対を使用して各レーザービームのチャープを制御するスペクトルフォーカシング技術を採用することにより、迅速な化学的に特異的なイメージングと高いスペクトル分解能が達成されます。チャープ用の固定長ガラス棒の使用と比較して、格子ペアは、関心のあるラマン線のスペクトル分解能と線幅を一致させることができます19。
さらに、このシステムは、顕微鏡内のアライメントに影響を与えることなく、特別に設計された手動スライダーを利用してビームパスから格子を除去することにより、フェムト秒からチャープピコ秒レジームに簡単に切り替えることができます。高感度と...

金ナノ粒子(AuNP)は、生体適合性イメージングプローブとして、例えば、さまざまな生物医学的用途における効果的な表面増強ラマン分光法(SERS)基板として大きな可能性を示しています。主な用途としては、バイオセンシング、バイオイメージング、表面増強分光、がん治療のための光熱療法などの分野が挙げられます1。さらに、生命系におけるAuNPの調査は、AuNPと生体系との相互作用を評価および理解するために重要です。フーリエ変換赤外(FTIR)分光法2、レーザーアブレーション誘導結合質量分析法(LA-ICP-MS)3、磁気共鳴画像法(MRI)4など、さまざまな分析技術を使用して組織内のAuNPの分布を調べることに成功しています。それにもかかわらず、これらの方法は、時間がかかり、複雑なサンプル調製を伴う3、長い取得時間を必要とする、またはサブミクロンの空間分解能の欠如2,4など、いくつかの欠点を抱いています。
従来のイメージング技術と比較して、非線形光学顕微鏡は生細胞とAuNPをプロービングするためのいくつかの利点を提供します:非線形光学顕微鏡は、より深いイメージング深度を達成し、近赤外超高速レーザーを使用して固有の3D光学セクショニング機能を提供します。イメージング速度と検出感度の大幅な向上により、2光子励起蛍光(TPEF)5,6,7および第2高調波発生(SHG)8,9,10顕微鏡法は、生細胞および組織における内因性生体分子の非侵襲的イメージングをさらに改善することが実証されています。さらに、過渡吸収(TA)11,12,13,14や誘導ラマン散乱(SRS)15,16,17,18などの新しいポンププローブ非線形光学技術を利用して、細胞構造とAuNPのラベルフリー生化学的コントラストを導き出すことができます。ナノ粒子の化学的摂動がそれらの物理的特性を変化させ、したがって細胞内での取り込みを変化させるため、外因性標識を使用せずにAuNPを視覚化することは非常に重要です。
このプロトコルは、AuNPと癌細胞の高速マルチモーダルイメージングを可能にする、2波長パルスレーザー用のスペクトル集束タイミングおよび再結合ユニット(SF-TRU)モジュールの実装を提示します。この研究は、レーザー走査型顕微鏡で統合されたTPEF、TA、およびSRS技術の詳細を実証することを目的としています。

<table><tbody><tr><td>APE SRS検出ユニット</td><td>APE(Angewandte Physik &Elektronik GmbH)</td><td>APEロックインモジュール</td><td>ポンプビームを検出するための大面積Siフォトダイオードと、ビーム変調を検出するためのロックインアンプを含む複合システム</td></tr><tr><td>共焦点スキャニングユニット</td><td>オリンパス</td><td>FV 3000</td> CMLラテックスビーズの<td>イメージングに使用される共焦点スキャニングユニット</td></tr><tr><td>、4% w/v、1.0 & micro;m</td><td>Invitrogen</td><td>C37483</td><td>ポリスチレン微小球</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Thorlabs</td><td>CG15CH2</td><td>22 mm x 22 mm カバースリップ 細胞播種用</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>ウシ胎児血清 (熱不活性化)</td></tr> <tr><td>Flouview</td><td>オリンパス</td><td>FV31S-SW</td><td>レーザー走査型顕微鏡制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>BX precision</td><td>40543</td><td>SF-TRUのEOMに供給される矩形波関数を生成するために使用され、ストークスビームで変調を生成するために</td></tr><tr><td>金ナノ粒子</td><td>ナノ粒子 ナノパルツ</td><td>A11-60</td><td>球状金ナノ粒子、直径60 nm</td></tr><tr><td>入力出力インターフェース</td><td>オリンパス</td><td>FV30 アナログ</td><td>このユニットは、PMTおよびLockInからの電圧読み出しを共焦点スキャンソフトウェアに供給し、オリンパスの顕微鏡とSF-TRUの間でタイミングパルスを送信することを可能にします単位。</td></tr><tr><td>InSight X3</td><td>Newport</td><td>Spectra-Physics</td><td>デュアル出力フェムト秒パルスレーザー。チューナブル(680&ndash;1300 nm)および固定(1045 nm)レーザー出力、繰り返し周波数80 MHz</td></tr>。<tr><td>顕微鏡フレーム</td><td>オリンパス</td><td>IX83</td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>マウス4T1細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td>マウス乳がん細胞</td></tr><tr><td>NA 1.2 水浸対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UPLSAPO60XW/IR</td><td>多光子60倍対物レンズの作動距離は0.28mmです。他の同様の目的を使用することができます。</td></tr><tr><td>NA 1.4 コンデンサー</td><td>ニコン</td><td>CSC1003</td><td>励起対物レンズよりも高いNAを持つ他のコンデンサーも使用できます。</td></tr><tr><td>PMT</td><td>浜松</td><td>R3896</td><td>PMTは、CARSのmcrsocopy</td></tr><tr><td>のPMTコネクタ</td>浜<td>松</td><td>C13654-01-Y002PMT</td>電源<td>用コネクタ</td></tr>RS <tr><td></td><td></td><td>RSPD-3303 C</td><td>PMTに正しい電圧を供給するために使用されるプログラマブル電源</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>A10491-01</td><td>それ以来、ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地は、さまざまな哺乳類細胞に適していることがわかっています。</td></tr><tr><td>SF-TRU</td><td>ニューポート・スペクトラ・フィジックス</td><td>SF-TRU</td><td>システムは、2つのレーザー出力の時間遅延と分散を制御し、SRSに必要なビーム変調を行うために設計されています</td></tr></tbody></table>。

マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング

Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy

生体系における金ナノ粒子(AuNP)の調査は、AuNPと生体組織との相互作用を明らかにするために不可欠です。さらに、誘導ラマン散乱(SRS)、2光子励起蛍光(TPEF)、過渡吸収(TA)などの非線形光信号をイメージングプラットフォームに統合することで、細胞構造とAuNPの生体分子コントラストをマルチモーダルに明らかにすることができます。本稿では、マルチモーダル非線形光学顕微鏡法を紹介し、それを応用して癌細胞におけるAuNPの化学的特異的イメージングを実行します。このイメージングプラットフォームは、より効率的に機能化されたAuNPを開発し、それらが腫瘍、細胞周囲、または細胞空間を取り巻く血管系内にあるかどうかを判断するための新しいアプローチを提供します。

スペクトル集束タイミングおよび再結合ユニット(SF-TRU)モジュールは、デュアル出力フェムト秒レーザーと修正レーザー走査型顕微鏡の間に導入されます。この研究で使用された調整可能な超高速レーザーシステムには、1つのビームを固定1,045 nmの波長で提供し、もう1つのビームを680〜1,300 nmの範囲で調整可能な2つの出力ポートを備えています。SF-TRUモジュールとマルチモーダルイメージングプラットフォームの詳細な回路図を 図1に示します。SF-TRUは、2つのフェムト秒レーザービームをピコ秒パルスにチャープするために使用され、2つのビームを空間的および時間的に重ね合わせます。ハイパースペクトル誘導ラマン散乱(SRS)イメージングは、ピコ秒ポンプとストークスパルスの間の遅延をスキャンすることによって実行されます。
すべてのサンプルは、修正された倒立顕微鏡上の高開口数(NA)対物レンズを通してパルスレーザーによって照らされます。SRSおよびTPEF信号は、高NAコンデンサを使用して順方向に収集されます。SRS顕微鏡では...

本稿では、スペクトル集束モジュールとデュアル出力パルスレーザーを統合し、金ナノ粒子と癌細胞の高速ハイパースペクトルイメージングを可能にする方法について説明します。この研究は、標準的なレーザー走査型顕微鏡でマルチモーダル非線形光学技術の詳細を実証することを目的としています。

Probing gold nanoparticles (AuNPs) in living systems is essential to reveal the interaction between AuNPs and biological tissues. Moreover, by integrating ...

私たちのプロトコルは、マルチモーダル、非線形、光学顕微鏡を提示し、癌細胞内の金ナノ粒子の化学的特異的イメージングを実行するためにそれを適用します。当社のイメージングシステムの主な利点は、細胞構造と金ナノ粒子の生体分子コントラストをマルチモーダルな方法でレビューするために使用できることです。まず、リモコンボックスを除くすべての機器のプラグをオンにします。次に、ボックスの背面のスイッチを入れ、コントロールボックスのリモートライトが青色になったら、[操作の開始]を押します。その後、レーザー走査型顕微鏡のPCの電源を入れ、共焦点顕微鏡ソフトウェアを実行します。次に、コンピューターソフトウェアを使用して顕微鏡の光路を確認し、タッチスクリーンまたはリモコンノブまたはコンピューターソフトウェアを介して焦点を制御します。ズーム、ピクセル単位の画像サイズ、ピクセル滞留時間など、ソフトウェアで目的の画像設定を選択し、ピクセル滞留時間が積分時間よりも長いことを確認します。水浸対物レンズの上に蒸留水の液滴を置き、レーザービームをサンプルに集束させ、コンデンサーとサンプルの間に集束させてイメージングします。次に、コンデンサーの高さをサンプルから約1ミリメートル上に調整して最大量の光を収集し、可動マウントに配置されたSRS検出器をビームパスから移動させて、白色光を使用してサンプルに焦点を合わせます。ソフトウェア設定を使用して、ポンプビームを選択し、レーザー波長をCH振動の場合は802ナノメートル、アミドIピークの場合は898ナノメートルに変更し、ラマンシフトの大きな変化を説明します。ラマンシフトを微調整するには、原稿に記載されているようにSFTRUユニットの遅延段をスキャンします。ハイパースペクトル データ セットの場合は、[トリガー] タブを選択し、[ttl トリガーで開始] をクリックして、[フレームごとにトリガー] を選択します。次に、[系列] タブで、時系列をオンに設定し、Z 系列をオフに設定します。さらに、ATMソフトウェアのステップ数と一致するように時系列のフレーム数を設定します。次に、ATMソフトウェアの[実行]タブに移動し、CHの遅延ステージ位置を90.25と92.25に設定し、アミドI領域をミリメートル単位で設定し、ハイパースペクトルスキャンの開始位置と停止位置に対応し、ステップ数がコンピューターソフトウェアのフレーム数と一致することを確認します。正しい設定を確認した後、最初に[取得]に移動し、[スキャンの開始]をクリックして、コンピューターソフトウェアでハイパースペクトルスタックを開始します。次に、ATMソフトウェアで[開始]をクリックすると、選択した開始位置と停止位置の間の遅延ステージ位置が徐々に増加する一連の画像の収集が開始されます。次に、さまざまな遅延ステージ位置で時系列の画像を撮影して、ハイパースペクトルスキャンを生成します。アナログユニットを使用して、SFTRUシステムとの間でTTL信号を送受信し、画像の取得と遅延ステージの動きを同期させます。CH振動領域のイメージングをアミドI振動領域に切り替えるには、レーザーソフトウェアのポンプ波長を802ナノメートルから898ナノメートルに変更します。さらに、ATM ソフトウェアのストークス分散設定を 30 ミリメートルから 5 ミリメートルに変更します。ミラーマウントの下部ノブを調整して、ミラー角度を段階的に変更することにより、SFTRUボックス内のポンプビーム分散経路のミラーを微調整します。ポリスチレンミクロスフェアの化学的選択性を検証するために、ハイパースペクトル刺激ラマン散乱と自発ラマンスペクトルが記録されました。スペクトルは、相対強度に観察された違いを除いて同一であった。4T1癌細胞の刺激ラマン散乱イメージングは、脂質、タンパク質、およびDNA生体分子の炭素-水素伸縮振動帯に対応する2,852,2,930および2, 968波数で行われた。金ナノ粒子を投与した4T1がん細胞のマルチモーダルイメージングを行い、がん細胞におけるナノ粒子分布を調べた。取得した誘導ラマン散乱画像は、CH2およびCH3チャネル、LysoTracker蛍光プローブ、およびオフレゾナンス刺激ラマン散乱チャネルについて取得されました。覚えておくべき最も重要なことは、レーザーソフトウェアで振動領域、ポンプリファレンス、およびプロトコル中のストークス分散設定を変更することです。このシステムは、光学アライメントに影響を与えることなく、フェムト秒領域からピコ秒領域に簡単に切り替えることができます。この機能により、多光子コヒーレントラマン散乱およびポンププローブ分光法とその応用を行うことができます。このマルチモーダルイメージングプラットフォームは、ナノメディシンへの新しい洞察を提供し、細胞、組織、および金ナノ粒子の分子イメージングへの道を開きます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ナノ粒子の細胞の生体内分布を評価するために使用されるバイオイメージングの方法はnanoformulated化合物の治療と診断監視に適用できます。本明細書に記載の方法は、組織学的coregistrationで評価した場合、感度と特異性です。方法論は、げっ歯類から人間のアプリケーションへの翻訳経路を提供しています。...

診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

このプロトコルは、生体機能化されたプルシアンブルーナノ粒子の合成と、それらをマルチモーダルな分子イメージング剤として使用することを説明しています。ナノ粒子は、ナノ粒子コア内のガドリニウムイオンまたはマンガンイオンがMRIコントラストを生成するコアシェル設計をしています。生体機能シェルには、蛍光イメージング用の蛍光色素と分子ターゲティング用のターゲティングリガンドが含まれています。...

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

可飽和散乱と逆可飽和散乱は、単離されたプラズモニック粒子で発見され、超解像顕微鏡における新しい非漂白コントラスト法として採用されました。ここでは、非線形散乱を検出して抽出する実験手順と、飽和励起顕微鏡を使用して分解能を向上させる方法について詳しく説明します。...

シングルプラズモニックナノ粒子からの散乱非線形性の測定

ここでは、従来の暗視野顕微鏡を用いて、細胞膜上の金ナノロッド(AuNRs)のダイナミクスを監視する方法を示す。単一の AuNR の位置と向きは ImageJ および MATLAB を使用して検出され、AuNRs...

単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。...

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

この研究では、非線形光学分光法と質量分析イメージングを使用して、軟組織中の薬物の相関イメージングの方法を提示します。高解像度の皮膚イメージングと高感度の薬物検出を組み合わせることで、優れた局所製品の開発に不可欠な、皮膚内の薬物分布を研究するための貴重なアプローチが提供されます。...

軟組織切片における薬物分布を可視化するための相関光学分光法および質量分析イメージング法

ラベルフリーの光学イメージングモダリティを組み合わせたマルチモーダルプラットフォームを利用して、細胞のダイナミクスと代謝を視覚化および定量化するためのプロトコルを開発しました。多光子蛍光、第2高調波発生、および誘導ラマン散乱顕微鏡によるイメージングを通じて、細胞および分子環境の全体像を生成することができます。...

細胞代謝研究のためのマルチモーダル光学イメージングプラットフォーム

このプロトコルは、生きたヒト乳がん細胞のラベルフリー、非侵襲的な表現型解析のためのラマン分光法と断層撮影位相顕微鏡を組み合わせたマルチモーダルアプローチを提示します。これには、迅速で定量的な形態化学分析のためのユーザーフレンドリーでヒューマンバイアスのない分析パイプラインが含まれており、がん研究や細胞生物学への応用で詳細な分子および構造の洞察を提供します。...

生きたラベルフリー乳がん細胞の表現型解析を進めるためのマルチモーダルイメージングフレームワーク

このプロトコルは、レーザー光源の生成方法、組織サンプルの調製方法、イメージングの実施方法、およびデータの分析方法の詳細を含む、同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡技術のステップバイステップガイドを提供します。SLAMは、組織微小環境を調査するために4つの相補的なラベルフリーコントラストを測定することにより、非線形顕微鏡を進歩させます。...

同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡

学ぶマルチモーダル非線形光学顕微鏡法で、がん細胞内の金ナノ粒子を化学的特異的にイメージングする手法です。高速ハイパースペクトルイメージングにより生体分子コントラストを詳細に評価できます。

マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング

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