Name: マイクロRNA処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶマイクロRNA処理によるマウスミュラーグリアから網膜前駆細胞への変換法。初代培養を用いてin vivo応用前に効率を評価し、再生医療の基礎研究に活用できます。

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著者らは、Ann Beaton博士とすべての研究室メンバーに原稿へのインプットに感謝します。シアトルのワシントン大学でのポスドク研修中に、MG初代文化をスクリーニングツールとしてS.G.W.に紹介してくれたTom Reh博士、Julia Pollak博士、Russ Taylor博士に特に感謝します。この研究は、S.G.W.へのEmpire Innovation Program(EIP)グラントとSUNY検眼からS.G.W.へのスタートアップ資金、およびNational Eye Institute(NEI)からS.G.W.へのR01EY032532賞によって資金提供されました。

この報告書の調査結果の一部を含む特許は、ワシントン大学によって発明者ニコラス・ジョルスタッド、ステファニー・G・ウォル、トーマス・A・レーと共に出願されました。特許のタイトルは「網膜再生を刺激する方法および組成物。

このプロトコルは、miRNAを用いたリプログラミング研究のために、解離したマウス網膜からMGを増殖させる方法を記載している。様々な先行研究で示され、確認されたように、これらの培養物中に見出された細胞の大多数(80%〜90%)はMG20、23、24である。この方法は非常に堅牢で信頼性の高い技術であり、プロトコルが正しく守られていれば結果を簡単に再現できます21,27。しかし、文化の成長と再プログラミングの効率化は、さまざまな要因に依存します。
第一に、マウスの年齢は、細胞増殖の成功に重要な役割を果たしている。したがって、MG培養物がレポーターマウスなどの野生型に類似した野生型マウスまたはトランスジェニックマウスから増殖する場合、コンフルエントなMG単層を増殖させる最新の年齢はP12で...

ミュラーグリア(MG)は、神経網膜における優勢なグリアである。それらは、水とイオンの恒常性の維持、ニューロンの栄養補給、組織の保護など、中枢神経系の他の部分の他のグリアと比較して同様の機能を有する。MGにはもう一つの魅力的な特徴があります:成熟したグリアですが、発達後期に網膜前駆細胞(RPC)で発現する多くの遺伝子を発現しています1,2。この類似性は、網膜損傷後の魚網膜における天然に存在するMGベースのニューロン再生の理由であると仮定される3,4。このプロセスの間、MGは細胞周期に再突入し、RPCに脱分化し、その後、6種類の網膜ニューロンすべてに分化する。この現象は魚類では自然に起こるが、哺乳類のMGはニューロン5,6に変換されない。ただし、再プログラムすることはできます。MGをRPC/ニューロンに再プログラムする様々な要因が示されている。これらの因子の中には、魚の再生に関与する基本的なヘリックス・ループ・ヘリックス(bHLH)転写因子アカイテ・スキュートホモログ1(Ascl1)がある7,8。マウスでは、Ascl1は網膜形成中にRPCでのみ発現するが、成熟MGまたは網膜ニューロン9には存在しない。
インビボで細胞を直接リプログラミングすることは、方法論的に難しいだけでなく、施設の動物ケアおよび使用委員会からの承認も必要とします。承認を受けるには、使用または変更された因子、濃度、オフターゲット効果、根底にあるメカニズム、毒性、および効率に関する予備データが必要です。細胞培養システムは、in vivoモデルでの使用前にこれらの基準を試験することを可能にする。さらに、MGは網膜細胞集団10全体の約5%しか占めていないので、MG培養物は、遊走12、13、増殖14、傷害/損傷に対するストレス反応15、16、ミクログリア17または網膜神経節細胞(RGC)などの他の細胞型との相互作用を含む、それらの機能11ならびにそれらの挙動の研究を可能にする18、 またはそれらの神経原性潜在能力19、20、21。多くの研究者は、無限の増殖性を有し、容易に維持およびトランスフェクトすることができるため、不死化細胞株を研究に使用している。しかし、初代細胞は、真の細胞特性(遺伝子およびタンパク質の発現)を有し、さらに重要なことに、それらは発達の特定の段階を表し、したがって「年齢」を有するため、不死化細胞よりも生物学的に関連するアッセイに好ましい。動物の年齢(そしてその結果として動物から得られた細胞の年齢)は、細胞の可塑性が発達段階の進行とともに減少するため、細胞のリプログラミングにおいて特に重要な要素である22。
このプロトコルは、再生を研究するための現在の in vitro 法として、miRNAで原発性MGを再プログラムする方法を詳細に説明しています。このMG初代培養モデルは、P53ノックアウトマウス(trp53-/-マウス)におけるMGの細胞増殖特性を評価するために2012年に設立されました23。培養MGはグリアの特徴(すなわち、免疫蛍光標識 を介して 評価されたS100β、Pax6、およびSox2タンパク質の発現)を維持し、 in vivo MG(FACS精製MGのマイクロアレイ)に類似していることが示された23。その後まもなく、グリアmRNAおよびタンパク質発現が検証され、ウイルスベクター20を用いた別のアプローチで確認された。数年後、MG特異的 Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl レポーターマウス24を用いて、これらの培養物に見られる細胞の大部分がMGであることを確認した。さらに、FACS精製MGおよび培養初代MGの両方におけるmiRNAのセットの定量は、MG miRNA(mGLiomiRs)のレベルが増殖期中の培養MGにおいてあまり変化しないことを示した。しかし、培養期間が細長いと、miRNAが翻訳調節因子であるため、miRNAレベル、ひいてはmRNAレベルおよびタンパク質発現の変化を引き起こす25。
2013年、このMG培養モデルを用いて、MGを網膜ニューロンに再プログラムする能力に関して様々な転写因子を試験した20。Ascl1は非常に堅牢で信頼性の高いリプログラミング因子であることが判明しました。ウイルスベクターを介したAscl1の過剰発現は、形態学的変化、ニューロンマーカーの発現、およびニューロン電気生理学的特性の獲得を誘導した。さらに重要なことに、これらの最初のインビトロ実験から得られた洞察と結果は、インビボアプリケーション22,26に首尾よく転送され、初代MG培養物がインビボ実装前の初期因子スクリーニングおよびグリア特徴の評価のための固体で信頼性の高いツールを表すことを実証した。
数年前、網膜ニューロンでも高発現している脳富化miRNA miR-124が、培養MG21でAscl1発現を誘導できることが示されました。生細胞におけるAscl1発現を、Ascl1レポーターマウス(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)を介して可視化した。レポーターマウスは、DNAにレポーター遺伝子が挿入された遺伝子操作マウスです。このレポーター遺伝子は、本研究における赤色蛍光タンパク質であるtdTomatoであるレポータータンパク質をコードする。このレポータータンパク質は、目的の遺伝子(この場合はAscl1)の発現を報告する。つまり、Ascl1 を発現する細胞は赤色に変わります。Ascl1はRPCs9でのみ発現するため、このAscl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/flマウスは、RPCを発現するAscl1へのMG変換の追跡を可能にし、変換細胞が赤色蛍光tdTomatoレポータータンパク質を発現することを意味する。これらの細胞のDNAが改変されるため、これは不可逆的な標識である。その結果、tdTomato標識が分化細胞に残るため、その後の神経分化は視覚化されます。MG由来RPC(tdTomato標識を有する)を発現するAscl1がニューロンに分化したとしても、これらのニューロンは依然として赤色のラベルを有する。したがって、このマウスは、生細胞イメージングのためのMG由来RPCの標識を可能にするだけでなく、これらのMG由来(赤色)RPCの運命マッピングおよび系統追跡も可能にする。より最近では、RPC中のmiRNAのセットが同定され、Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPCレポーターマウスのMG培養物を用いて、これらのmiRNAがリプログラミング能力および効率に及ぼす影響をスクリーニングおよび試験した27。候補の1つであるRPC-miRNA miR-25は、培養したMGをAscl1発現細胞(Ascl1-Tomato+)にリプログラミングできることを見出した。これらの再プログラムされた細胞は、ニューロンの形態(小さなソマタおよび短いまたは長い微細プロセスのいずれか)、scRNA-Seqを介して測定されたニューロン転写産物の発現、ならびに免疫蛍光標識を介して検証されたニューロンタンパク質の発現を含む、経時的なニューロンの特徴を採用する27。
ここで、プロトコルは、以前の研究21、24、27から適応したP12マウスからMGを増殖およびトランスフェクトする方法を詳述する。このプロトコールのために選択されたのは、前述のmiRNA miR-25であり、RPCにおいて高発現し、MGまたは網膜ニューロンにおいて低い発現レベルを有するmiRNAである。miR−25を過剰発現させるために、マウスmiR−25模倣体、すなわち、人工miRNA分子が使用される。対照として、Caenorhabditis elegansからのmiRNAの模倣物が選択され、哺乳動物細胞では機能を持たない。MGのRPCへの変換の可視化は、RPCレポーターマウス(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)、バックグラウンドが混在するマウス(C57BL/6、S129、およびICR株)を介して達成された。しかしながら、この培養は、野生型株を含むすべてのマウス株を用いて行うことができる。過去数年間で、元のプロトコルは、成長期の持続時間と全体的な培養期間を短縮し、より堅牢なグリア細胞の状態を確保し、長期の培養期間に起こる細胞変性の程度を最小限に抑えるように変更されました。通常のトランスフェクション時間枠も3時間から2日に延長されました。前述のように、現在のプロトコルはMG培養物を再生研究のためのツールとして記述しているが、この方法は初期化因子の試験に有用であるだけでなく、MG遊走性または増殖性挙動、傷害/細胞損傷関連のパラダイム、および/または根底にあるメカニズムおよび経路の同定に関する研究を含む他の用途にも適応させることができる。

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascl1-CreERTマウスAscl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#012882</td><td>Ascl1-CreERTマウスとtdTomatoマウスを交配しましたtdTomato-STOPfl</td></tr><tr><td>/flマウス&nbsp;B6です。Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#007914</td><td>Genotypingは、Ascl1CreER陽性マウス</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen、&ge;98% Z 異性体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td>エタノール、凍結アリコートで再構成</td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド (PFA) 水溶液</td><td>VWR</td><td>100504-782</td> 2<td>% PFA リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS) で作られ、凍結アリコート</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>希釈 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>705-606-147</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>抗ヒト Otx2 抗体、R&D Systems</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF1979</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>抗ウサギ MAP2 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942-200UL</td><td>希釈率 1:250</td></tr><tr><td>抗赤色蛍光タンパク質 (RFP) 抗体 Antibodies-Online</td><td></td><td>ABIN334653</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72132</td><td>PBS、凍結アリコート</td></tr><tr><td>B-27 サプリメントに再構成</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>17-504-044</td><td>冷凍アリコート</td></tr><tr><td>脳物理学ニューロン媒体</td><td>STEMCELL</td><td>テクノロジー05790</td>セクション<td>1.2でニューロン媒体として使用され、4°で保存します。C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 イメージング キット</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>C10340</td><td>次のマニュアル、4 を再構成します&deg;C</td></tr><tr><td>ジブチリル-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73886</td><td>ジメチルスルホキシド (DMSO) で再構成され、凍結アリコート</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>MT35010CV</td><td>凍結アリコート</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>51-985-034</td><td>4°Cで保管。C</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp;トリプLE発現酵素(1X)、トリ</td>プシンを含む溶液として使用されるフェノールレッド<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-605-028</td><td>、4°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-025-134</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>ラミニンマウスタンパク質、天然</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-017-015</td><td> 冷凍アリコート、(https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) </td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>25-030-081</td><td>冷凍アリコート</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA Mimic ネガティブコントロール</td><td>ホライズン</td><td>CN-001000-01-50</td><td>RNase 遊離水 (200 &micro;M)、凍結アリコート</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNAマウスmmu-miR-25-3p模倣</td><td>ホライゾン</td><td>C-310564-05-0050</td>を<td>RNaseフリー水(200&micro;M)、冷凍アリコート</td></tr><tr><td>N-2サプリメント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>17-502-048</td><td>冷凍アリコート</td></tr><tr><td>ニューロベースルミディアム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-103-049</td>セクション<td>1.1の成長培地に使用され、4°で保管します。C</td></tr><tr><td>パパイン解離システム</td><td>ワージントン 生化学的</td><td>LK003153</td> ア<td>ールの平衡塩溶液で再構成され、凍結アリコート</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15-140-122</td><td>凍結アリコート</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P4538-50MG</td>を<td>滅菌水で再構成し、凍結アリコート</td></tr><tr><td>組換えヒトBDNFタンパク質</td><td>R&滅菌</td><td>PBSおよびFBSで再構成</td>されたD Systems <td>248-BDB-050/CF</td>、凍結アリコート</tr><tr><td>Recombinant Mouse EGF</td><td>Protein Fisher Scientific</td><td>2028EG200</td> 滅菌<td>PBSで再構成、凍結アリコート</td></tr><tr><td>Recombinant Rat GDNF Protein</td><td>Fisher Scientific</td><td>512GF010</td> 滅菌<td>PBSで再構成、凍結アリコート</td></tr><tr><td>ローダミンレッド 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-296-150</td><td>希釈率 1:1,000</td></tr><tr><td>スライド マウンティング メディウム フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬 (リポフェクタミン 3000)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>サイエンティフィック L3000015</td><td>4 °C で保管します。C</td></tr><tr><td>プラスチック製品/消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 mL微量遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;Lのヒント&nbsp;滅菌フィルター&nbsp;ピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-439</td><td></td></tr><tr><td>100 & マイクロ;Lのヒント&nbsp;滅菌フィルター ピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-431</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L TIP滅菌フィルターピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL微量遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-408-138</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;Lのヒント&nbsp;滅菌フィルターピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>可変容量ピペット(2.5、10、20、100、200、1000&マイクロ;L)</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル トランスファー ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-669-12</td><td></td></tr><tr><td>蓋付きマルチウェル平底プレート、ウェル数=12</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>蓋付きマルチウェル平底プレート、ウェル数=24</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>ピペット&nbsp; 滅菌フィルター 10ML ディスポーザブル・セロジカルピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>ピペット&nbsp; 滅菌フィルター 50ML 使い捨て血清ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>13-676-10Q</td><td></td></tr><tr><td>ピペット&nbsp; 滅菌フィルター 5ML 使い捨て血清ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>パウダーフリーニトリル検査用手袋</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>19-130-1597B</td><td></td></tr><tr><td>丸型カバースリップ(直径12 mm、厚さ0.17 - 0.25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22293232</td><td></td></tr><tr><td>真空フィルター、細孔サイズ= 0.22 & マイクロ;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-761-106</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1300 B2 バイオセーフティキャビネット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>オールインワン蛍光顕微鏡 キーエンス BZ-X 810</td><td>キーエンス</td><td>9011800000</td><td></td></tr><tr><td>双眼ズーム 実体顕微鏡</td><td>ビジョンサイエンティフィック</td><td>VS-1EZ-IFR07</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てシャーレ(直径100mm)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>2231000508</tr><tr><td>ファインハサミ-シャープ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>マクファーソンバンナスハサミ、8 cm</td><td>ワールド精密機器</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>メタルビーズバス</td><td>ラボアー</td><td>マー74309-714</td><td></td></tr><tr><td>章動ミキサー、電気= 115V、60Hz、速度= 24 rpm</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンコーティング解剖シャーレ(90 mm直径)</td><td>リビングシステム機器</td><td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット、エコノミー #5</td><td>世界の精密機器</td><td>501979</td><td></td></tr><tr><td>水ジャケット付きCO2インキュベーター</td><td>VWR</td><td>10810-744</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロrna処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

ミュラーグリア(MG)は、神経網膜における優勢なグリアであり、網膜ニューロンの再生源として機能することができる。魚などの低脊椎動物では、MG駆動の再生が自然に起こります。しかし、哺乳類では、特定の要因による刺激または遺伝的/エピジェネティックな操作が必要です。MGは網膜細胞集団のわずか5%しか含まないので、この細胞集団の研究を排他的に可能にするモデル系が必要である。これらのモデルシステムの1つは、再現性があり、分子/因子のスクリーニングおよび同定、化合物または因子の試験、細胞モニタリング、および/または機能試験を含む様々な用途に使用できる一次MG培養物である。このモデルは、人工miRNAまたはその阻害剤のトランスフェクション を介して マイクロRNA(miRNA)の補充または阻害後に網膜ニューロンに変換するマウスMGの可能性を研究するために使用される。MG特異的レポーターマウスを免疫蛍光標識および単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)と組み合わせて使用することにより、これらの培養物に見られる細胞の80%〜90%がMGであることを確認した。 このモデルを使用して、miRNAがMGを網膜前駆細胞(RPC)に再プログラムし、その後ニューロン様細胞に分化できることが発見された。この技術の利点は、miRNA候補を in vivoアプリケーションで使用する 前に、その効率と結果についてテストできることです。

このプロトコルは、P12マウス網膜からMGを増殖させる方法と、Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPCレポーターマウスを使用して、miR-25でこれらの細胞を網膜ニューロンに再プログラムする方法を説明しています。この方法は、MGをRPCに再プログラムし、次いでニューロン細胞特性を採用するために、他の適切なmiRNA(模倣物または阻害剤、単一分子として、または組み合わせて)を詳細に報告する以前の研究で使用された27。この方法は、培養物をより速く増殖させ、したがって時間の経過とともに人工環境によって引き起こされる細胞変化を最小限に抑えるように改変されている24、28、29。
初代MG培養物の網膜解離および成長期 最初のMGは、光...

マウス網膜から得られたミュラーグリア初代培養物は、マイクロRNA処理後の網膜前駆細胞へのグリア変換を研究するための非常に堅牢で信頼性の高いツールです。単一分子または組み合わせは、 その後のin vivo アプローチの適用前に試験することができる。

マイクロRNA処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

このプロトコルは、マイクロRNAなどの特定の因子で処理した後に網膜前駆細胞に変換するミュラーグリアの可能性と能力を研究することを可能にします。この技術の利点は、マイクロRNA候補をin vivoアプリケーションで使用する前に、その効率と結果をテストできることです。手順のデモンストレーションを支援するのは、ステファニー・ウォルの研究室の博士課程の学生であるソヨン・カンです。まず、動物からの細菌の持ち越しを避けるために、除去した眼球をエタノールを含むチューブに短時間浸します。次に、氷上の24ウェルプレートに入れる前に、10センチメートルのペトリ皿で眼球を簡単に洗います。眼球を取り外して洗浄したら、光源付きの解剖顕微鏡の下に置かれた解剖皿に片目を置きます。次に、デュモン5の細かい鉗子で強膜の周りの視神経と周囲の結合組織をつかんで片眼球を固定し、解剖皿に注意深く押し付けます。次に、30ゲージの針を使用して角膜中央に穴を開け、静脈ハサミにアクセスしやすくします。次に、静脈ハサミを使用して毛様体の周りの角膜を解剖し、デュモン5細鉗子で角膜、水晶体、虹彩、硝子体を慎重に取り除きます。その後、視神経に達するまで静脈ハサミで強膜を解剖し、デュモン5ファイン鉗子を使用して網膜を注意深く抽出します。次に、2番目のDumont 5ファイン鉗子を使用して網膜を押し、硝子体を完全に取り除きます。滅菌トランスファーピペットの先端の約2.5センチメートルに切断した網膜を移し、直径を拡大する。このチップを使用して、組織を損傷することなく網膜全体を拾い上げ、網膜を冷たいHBSSを備えた新しい滅菌ペトリ皿に移し、皿を揺り動かします。次に、新しい滅菌トランスファーピペットを用いて、網膜を慎重に押し回し、網膜色素上皮細胞を洗い流す。単離された網膜を、解剖中に24ウェルプレートを氷上に保ちながら、1ミリリットルのHBSSで満たされた24ウェルプレートの新しいクリーンウェルに直ちに配置します。パパインDNase I解離混合物を原稿に記載されているように調製する。拡大したチップトランスファーピペットで、網膜を拾います。網膜が先端の底に落ち着くまで待ち、過剰なHBSSなしで網膜をパパインDNase I混合物を含むチューブに放出します。次に、チューブをインキュベーター内のニューテーターに置き、摂氏37度で5%二酸化炭素で10分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのピペットで慎重に上下にピペッティングして細胞を解離します。細胞が解離した後、パパイン解離キットから275マイクロリットルのオボムコイドプロテアーゼ阻害剤を加えてパパインを中和し、上下にピペッティングして穏やかに混合します。チューブを遠心分離機に入れ、摂氏4度で相対遠心力300で8分間回転させます。摂氏37度に予熱した成長培地の計算量に上皮成長因子を加える。チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。チューブの底にあるペレットに触れることなく、上清を注意深く完全に取り除きます。次に、細胞ペレットを500マイクロリットルの上皮成長因子補充増殖培地で再懸濁します。次いで、細胞懸濁液を標識した12ウェルプレートの1ウェルに移す。さらに500マイクロリットルの上皮成長因子を添加した増殖培地でチューブをすすぎ、ウェルに加えます。ウェルプレートを注意深く揺り動かし、二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターにプレートを置きます。90%から100%のセルコンフルエンシーをチェックすることから始めます。次に、培地を取り出し、1ミリリットルの冷たいHBSSを加えて井戸を洗います。プレートをそっと揺り動かし、痕跡を残さずにHBSSを取り外します。その後、500マイクロリットルの予め温めたトリプシン含有溶液を加えて、細胞をウェルから剥離する。穏やかに揺り動かし、摂氏37度のインキュベーターで2分間インキュベートします。プレートをインキュベーターからバイオ安全キャビネットに移動した後、傾けながらトリプシン含有溶液を吸引します。細胞が完全に剥離するまで、ウェル上に数回注意深くゆっくりと分散させます。次に、この細胞懸濁液を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移し、チューブを遠心分離機に入れます。摂氏4度で8分間300倍gで回転し、チューブをバイオ安全キャビネットに戻します。ペレットに触れずに上清を取り除きます。次に、600マイクロリットルの事前に温めた増殖培地を追加し、約30〜40回上下にピペッティングすることにより、細胞ペレットを注意深く再懸濁します。最後に、得られた細胞懸濁液100マイクロリットルを24ウェルプレートの6つのコーティングカバースリップの中央に播種する。プレートをインキュベーターに置き、マイクロRNA模倣物を使用して細胞を沈降させ、その後のトランスフェクションを行います。この図は、トランスフェクションの5日後に、いくつかのAscl1-Tomato陽性細胞が存在する対照条件を示しています。しかし、miR-25処理後、さらに多くのAscl1-トマト陽性細胞が見つかります。定量により、miR-25処理ウェルのAscl1-Tomato陽性細胞数が対照と比較して4倍に増加したことが明らかになりました。最も重要なことは、riR-25処理ウェルで見つかったAscl1-トマト陽性細胞の大部分がニューロン形態を採用していることです。このニューロン形態の特徴には、細胞体細胞サイズの縮小、微細なプロセスの発達、および小さなネットワークの形成が含まれていました。定量の結果、Ascl1-Tomato陽性細胞の約70%が神経細胞の特徴を持っていることが明らかになりました。免疫蛍光標識により、神経形態を有するAscl1-Tomato陽性細胞が神経マーカーOTX2およびMAP2を発現し、神経細胞の同一性を確認することが示されました。これらの細胞の定量により、miR-25過剰発現後、対照では1視野あたり5個の神経細胞と比較して、1視野あたり約40個のAscl1-Tomato陽性ニューロンが存在することが明らかになりました。同定された神経細胞は、miR-25処理サンプルの全Ascl1-Tomato陽性細胞集団の約70%を構成します。さらに、OTX2およびMAP2共発現ニューロンの絶対数の定量化は、miR−25処理後、対照における1野当たり10ニューロンと比較して、野当たり約60ニューロンが見出されたことを示した。清潔で無菌の道具を使って清潔で消毒された環境で作業し、過酷な治療を避けて慎重に作業することが不可欠です。ダウンストリームアプリケーションは、例えば、タンパク質定量、DNAまたはRNA分析、または電気生理学的研究であり得る。この手法は、再生医療の分野に属する核初期化に関する最初の疑問を探求するのに役立ちました。そして、新しい質問を探求するためにテストできる要因と条件は長々とあります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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