Name: タンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクスを研究するための高分解能中性子分光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶ中性子後方散乱分光法を用いたタンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクス解析。リゾチーム凝集時の動態とタウ線維形成時の水和水動態を解明し、神経変性疾患の分子機構理解に貢献する。

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著者らは、ドイツのガルヒングにあるハインツ・マイヤー・ライプニッツ・ツェントルムにあるユーリッヒ中性子科学センターのミカエラ・ザンポーニ氏に、SPHERES装置で行われた中性子散乱実験の一部に感謝している。この研究は、欧州連合がHPRI-2001-50065およびRII3-CT-2003-505925の契約に基づいて資金提供する重水素化研究所(DLAB)コンソーシアムの活動、および英国工学物理科学研究評議会(EPSRC)が資金提供する助成金GR/R99393/01およびEP/C015452/1に基づくラウエランジュバンEMBL研究所内の活動から恩恵を受けています。主要行動を通じた第7次枠組みプログラムに基づく欧州委員会による支援:欧州研究領域、研究インフラストラクチャの強化が認められています[契約226507(NMI3)]。ケビン・ポウノットとクリスチャン・ベックは、ポスドクフェローシップの資金提供について、連邦教育研究省(BMBF、助成金番号05K19VTB)に感謝します。

著者は、開示すべき利益相反はありません。

中性子分光法は、重水素化を使用した場合のタンパク質のサイズや溶液の複雑さに関係なく、タンパク質サンプルのアンサンブル平均ps-nsダイナミクスをプローブできる唯一の方法です6。具体的には、溶液中でのタンパク質集合体の自己拡散を調べることにより、そのような集合体の流体力学的サイズを明確に決定することができる。それにもかかわらず、この方法は一般に中性子束が低いために制限され、これは長い取得時間と、割り当てられたビーム時間内に良好な信号対雑音比を得るために大量のサンプル(通常は100 mgのタンパク質)を必要とすることを意味します。
サンプル調製(プロトコルステップ1および2)。 液体状態サンプルの場合、使用できる最小濃度は~50 mg/mLです(取得時間を延長する代わりに、より低い濃度を使用できます)。タンパク質濃度が高いとフィブリル化速度が速くなり、割り当てられたビーム時間で測定を適合させるのに役立ちますが、凝集経路にも影響を与える可能性があります44。し...

中性子は電荷のない巨大な粒子であり、基礎物理学から生物学まで、さまざまな分野のサンプルを調べるために長年にわたって成功裏に使用されてきました1。生物学的用途では、小角中性子散乱、非弾性中性子散乱、中性子結晶構造解析および反射率測定が広く使用されています2,3,4。非弾性中性子散乱は、特定の標識自体を必要とせずにダイナミクスのアンサンブル平均測定を提供し、サイズやタンパク質に依存しない信号品質を提供します5。測定は、重水素化細菌ライセートやin vivoなどの細胞内培地を模倣する研究中のタンパク質の非常に複雑な環境を使用して行うことができます3,6,7。ダイナミクス、すなわち、i)飛行時間によるサブps-psダイナミクスへのアクセス、ii)後方散乱によるps-nsダイナミクスへのアクセス、iii)nsから数百nsまでのダイナミクスへのアクセスなど、さまざまな実験セットアップを使用してダイナミクスを研究することができます。中性子後方散乱は、ブラッグの法則2d sinθ = nλを利用しており、dは結晶内の平面間の距離、θは散乱角、nは散乱次数、λは波長です。検出器への後方散乱に結晶を使用することで、エネルギーの高分解能(通常~0.8μeV)を達成することができます。エネルギー交換を測定するには、後方散乱で結晶を運ぶドップラードライブを使用して入射中性子波長8、9、10を定義および調整するか(図1)、エネルギー分解能の低下を犠牲にして飛行時間型セットアップを使用できます11。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> 図1:ドップラー駆動の中性子後方散乱分光計のスケッチ。入射ビームは位相空間変換(PST)チョッパ42に当たり、試料位置における磁束を増加させる。次に、ドップラードライブによってサンプルに向かって後方散乱され、ドップラードライブはエネルギーE1(シアンの矢印)を選択します。次に、中性子はサンプルによって散乱され(矢印の色で表される異なるエネルギーで)、Si 111結晶で作られた分析装置は、特定のエネルギーE0(ここでは赤い色の矢印)の中性子のみを後方散乱します。したがって、運動量移動qは検出器アレイ上の中性子の検出位置から得られ、エネルギー移動は差E1-E0から得られます。PSTによって生成された中性子パルスに予想される飛行時間は、検出器管に向かって直接散乱された中性子からの信号を破棄するために使用されます。略語:PST =位相空間変換。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
後方散乱分光法では、タンパク質などの水素プロトンに富むサンプルからのシグナルへの主な寄与は、散乱強度Sinc(q、ω)が式(1)12で示されるインコヒーレント散乱から来ています
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
ここでσincは考慮される元素のインコヒーレント断面であり、k'は散乱波ベクトルのノルム、kは入射波ベクトルのノルム、q(= k - k')運動量移動、r j(t)時間tにおける原子jの位置ベクトル、ωは入射中性子と系との間のエネルギー移動に対応する周波数である。角括弧はアンサンブル平均を示します。したがって、インコヒーレント散乱は、原子位置のアンサンブル平均単粒子自己相関を時間とプローブし、システム内のすべての原子と異なる時間起源(アンサンブル平均)で平均化された自己ダイナミクスを提供します。散乱関数は、中間散乱関数 I(q, t) のときのフーリエ変換であり、式 (2) で示されるファンホーブ相関関数の空間でのフーリエ変換と見なすことができます。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
ここで、ρ(r,t)は、位置rと時間t13で原子を見つける確率密度です。
フィッキアン拡散過程の場合、自己拡散関数は、γ = Dq2で与えられる線幅のローレンツ分布からなる散乱関数の二重フーリエ変換の後に生じます(式(3)を参照)。
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
より洗練されたモデルが開発され、ps-ns内部タンパク質ダイナミクス14のSingwiとSjölanderによるジャンプ拡散モデルや、水和水15,16,17のSearsによる回転モデルなど、有用であることがわかりました。
フランスのグルノーブルにあるILLの中性子後方散乱(NBS)装置IN16B 8,9(補足図S1)では、タンパク質で一般的に使用されるセットアップは、入射波長を調整するためのドップラードライブを備えたアナライザー用のSi 111結晶で構成され(補足図S2A)、それによって運動量伝達範囲~0.2 Å-1 &lt; q &lt; ~2 Å-1および-30 μeVのエネルギー伝達範囲にアクセスできます&lt; <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;">&lt; 30μeV-数psから数nsの範囲のタイムスケールと数Åの距離に対応します。さらに、IN16Bは、固定エネルギー伝達でのデータ収集を含む弾性および非弾性固定ウィンドウスキャン(E/IFWS)10を実行する可能性を提供します。中性子を扱う場合、磁束が制限されるため、E/IFWSは1回のエネルギー伝達で磁束を最大化できるため、満足のいく信号対雑音比を得るために必要な取得時間を短縮できます。より最近のオプションは、後方散乱および飛行時間型分光計(BATS)モード11であり、ドップラー駆動よりも高い磁束で、広範囲のエネルギー移動(例えば、-150μeV&lt;&lt; <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150μeV)の測定を可能にしますが、エネルギー分解能は低くなります(補足図S2B)。
中性子散乱の重要な特性は、インコヒーレント断面積σincが水素に対して重水素よりも40倍高い値を持ち、生物学的サンプルに一般的に見られる他の元素に対しては無視できることです。したがって、液体環境におけるタンパク質の動態は、重水素化緩衝液を用いて研究することができ、粉末状態は、D2Oで水和した水素化タンパク質粉末によるタンパク質内部動態の研究、またはH2Oで水和した過重化タンパク質粉末の水和水の研究を可能にする。液体状態では、中性子後方散乱は通常、タンパク質の重心自己拡散(フィッキアン型拡散)とその内部ダイナミクスに同時にアクセスすることができます。後者は、通常、いわゆるジャンプ拡散モデルなどによって記述されるバックボーンおよびサイドチェーン運動です3,18。水素化タンパク質粉末では、タンパク質の拡散は存在せず、内部ダイナミクスのみをモデル化する必要があります。水和水の場合、水分子の並進運動および回転運動の寄与は、運動量移動qに対して異なる依存性を示し、これは、データ分析プロセスにおけるそれらの区別を可能にする17。
この論文は、β鎖のスタックからなる標準的な形に展開し、凝集し、いわゆるクロスβパターン19,20-そして細長い繊維を形成することができることが判明したタンパク質の研究による中性子後方散乱法を示しています。これはいわゆるアミロイド凝集であり、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患における中心的な役割のために広く研究されています21,22。アミロイドタンパク質の研究は、それらが果たすことができる機能的役割23,24または新規生体材料の開発のためのそれらの高い可能性によっても動機付けられています25。アミロイド凝集の物理化学的決定要因は依然として不明であり、過去数年間の驚異的な進歩にもかかわらず、アミロイド凝集の一般理論は利用できません21,26。
アミロイド凝集は、タンパク質の構造と経時的な安定性の変化を意味し、その研究は当然、タンパク質の立体構造安定性、タンパク質機能、およびタンパク質エネルギーランドスケープに関連するダイナミクスを意味します27。ダイナミクスは、最速の運動28のエントロピー寄与を通じて特定の状態の安定性に直接関連しており、タンパク質の機能は、光感受性タンパク質29 のサブpsからドメイン運動のmsまで、ピコ秒-ナノ秒のダイナミクス30によって促進されるさまざまなタイムスケールの運動によって維持できます。
中性子後方散乱分光法を使用してアミロイドタンパク質を研究する2つの例、1つはタンパク質のダイナミクスを研究するための液体状態、もう1つは水和水のダイナミクスを研究するための水和粉末状態の2つの例を紹介します。第1の例は、リゾチームのμmサイズの球体(微粒子と呼ばれる)への凝集に関するものであり、続いてリアルタイムで5、第2の例は、ヒトタンパク質タウ31の天然状態および凝集状態における水動態の比較に関するものである。
リゾチームは免疫防御に関与する酵素で、129個のアミノ酸残基で構成されています。リゾチームは、pD10.5および90°Cの温度で重水素化緩衝液中で微粒子を形成することができます。 中性子散乱により、リゾチームの重心拡散係数の時間発展がチオフラビンT蛍光(アミロイド交差βパターンの形成をモニターするために使用される蛍光プローブ32)の単一の指数関数的速度論に従うことを示し、粒子形成上部構造と交差βパターンが同じ速度で1つのステップで発生することを示しています。さらに、内部ダイナミクスは凝集プロセス全体を通して一定であり、これはNBS装置では観察できない速い立体構造変化、または凝集時にタンパク質の内部エネルギーに大きな変化がないことによって説明できます。
ヒトタンパク質タウは、いわゆる2N4Rアイソフォームの441アミノ酸からなる天然変性タンパク質(IDP)であり、アルツハイマー病に特に関与しています33。過重水素化タンパク質タウの粉末に対する中性子後方散乱を用いて、繊維状態で水和水ダイナミクスが増加し、並進運動を受ける水分子の集団が多いことを示しました。この結果は、水和水エントロピーの増加がタウのアミロイド細動を引き起こす可能性があることを示唆している。

<table><tbody><tr><td>アルミ製サンプルホルダー</td><td></td><td></td><td>市販されていません。装置のローカル連絡先がそれらを提供できるか、またはローカル連絡先から提供できる技術図面に基づいて製造することができます。</td></tr><tr><td>塩化重水素、35重量%、D2O、&ge;99 原子 % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> 543047</td><td></td></tr><tr><td>酸化重水素 (D, 99.9%)</td><td>ユーリソトップ</td><td>DLM-4DR-PK</td><td></td></tr><tr><td>ダウ コーニング 高真空シリコーングリース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 96%, EMSURE Reag.Ph Eur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.5901</td><td></td></tr><tr><td>ガラス乾燥器</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 75871-660</td><td></td></tr><tr><td>ガラス乾燥器プレート、140 mm</td><td>VWR</td><td>89038-068</td><td></td></tr><tr><td>インジウム ワイヤー、直径 1.0 mm (0.04 インチ)、Puratronic、99.999%</td><td>Alfa Aesar</td><td>00470.G1</td><td></td></tr><tr><td>鶏卵白のリゾチームを透析、凍結乾燥、粉末、~100,000 U/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62970</td><td></td></tr><tr><td>nPDyn</td><td></td><td>v3.x</td><td>は、github.com/kpounot/nPDyn、モデル機能fotフィッティングもソフトウェア</td></tr><tr><td>OHAUS AX324 Adventurer天びん、内部校正</td><td>Dutscher</td><td>92641</td><td></td></tr><tr><td>五酸化リン、ReagentPlus、99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214701</td><td></td></tr><tr><td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &mu;L</td><td>Starlab</td><td>S7100-0510</td><td></td></tr><tr><td>ピペット ErgoOne 100-1,000 &mu;L</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>ピペット ErgoOne 20-200 &mu;L</td><td>Starlab</td><td>S7100-2200</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ TipOne 1,000 &mu;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ TipOne 10 &mu;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-3200</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ TipOne 200 &mu;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>重水素ナトリウム溶液、40 wt. % in D2O、99.5 原子% D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372072</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクスを研究するための高分解能中性子分光法

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

中性子散乱は、重水素以外の標識なしに、非破壊的な方法で広範囲のエネルギーのサンプル内のダイナミクスをプローブする可能性を提供します。特に、中性子後方散乱分光法は、複数の散乱角度で同時に散乱信号を記録し、ps-nsタイムスケールでの生物系のダイナミクスの研究に適しています。D2Oおよび場合によっては重水素化緩衝液成分を使用することにより、この方法は、液体状態のタンパク質の重心拡散と骨格および側鎖運動(内部ダイナミクス)の両方をモニタリングすることを可能にする。
さらに、水和水の動態は、H2Oで水和された過重水素化タンパク質の粉末を使用することによって研究することができる。この論文では、タンパク質と水分補給の水動態を調査するために、ラウエランジュバン研究所(ILL)の装置IN16Bで採用されたワークフローを紹介します。蒸気交換を用いた溶液サンプルおよび水和タンパク質粉末サンプルの調製について説明する。タンパク質と水和水ダイナミクスの両方のデータ解析手順は、中性子後方散乱分光計で取得できるさまざまなタイプのデータセット(準弾性スペクトルまたは固定ウィンドウスキャン)について説明されています。
この方法は、アミロイドタンパク質を含む2つの研究で示されています。リゾチームのμmサイズの球状凝集体(微粒子と表記)への凝集は、IN16Bで調査された空間および時間範囲でのワンステッププロセスで発生することが示されていますが、内部ダイナミクスは変化しません。さらに、タウの水和水の動態を過重水素化タンパク質の水和粉末で研究した。水の並進運動はアミロイド線維の形成時に活性化されることが示されている。最後に、他の実験的生物物理学的方法に関するダイナミクスの研究に関して中性子散乱がどのように位置付けられているかに関して、プロトコルの重要なステップが議論されます。

リゾチームの微粒子への凝集は、重水素化緩衝液(pD 10.5で0.1 M NaCl)中で50 mg/mLのタンパク質濃度で90°Cで実施しました。微粒子の形成は、90°Cへの温度上昇によって引き起こされ、6時間以内に発生します(補足図S8)。データ取得は、上記のプロトコルで説明されているように、IN16Bで実行されました(データはILLによって永続的にキュレーションされ、http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 でアクセスできます)。
初期状態を完全に特徴付けるために、7°CでQENSスペクトルを取得しました。その後、温度を90°Cに上昇させ(通常、IN16Bでは~30分、 補足図S9)、集約プロセスをトリガーしました。QENSスペクトルのスライディング平均を使用して速度論を追跡できるため、エネルギー伝達の全範囲にアクセスできますが、時間の分解能は限られています。時間分解能は、4つのエネルギー伝達値5で、EFWSを使用して...

中性子後方散乱分光法は、タンパク質とその水和水のps-nsダイナミクスへの非破壊でラベルフリーのアクセスを提供します。このワークフローには、アミロイドタンパク質に関する2つの研究、すなわち凝集中のリゾチームの時間分解ダイナミクスと、繊維形成時のタウの水和水ダイナミクスに関する研究が提示されています。

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

中性子後方散乱は、放射線による損傷なしに、タンパク質と水和水のグローバルな拡散と内部ダイナミクスを測定します。中性子分光法は、分子レベルで空間相関と時間相関に同時にアクセスします。ソフトマターや生体材料では、これらの長距離障害システムの局所秩序に関する間接的な情報を得ることは特に興味深い。したがって、中性子後方散乱は、生物学、化学、または物質感覚のダイナミクスを研究するために使用できます。もう一つの得意分野はエネルギーで、例えば電池や燃料電池に関する研究があります。中性子後方散乱は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患に関与するタンパク質の分子動力学の研究に成功しています。得られた結果は、これらの病状の分子的特徴をよりよく理解するのに役立ち、より良い診断を開発する道を開く可能性があります。サンプルホルダーを準備するには、平らなアルミニウムサンプルホルダーとそのインジウムワイヤーシールとネジを水で完全に洗浄し、次にエタノールで洗浄してから乾燥させます。底面、蓋、インジウム線など、サンプルホルダーのさまざまな部分を精密天秤で別々に計量します。1ミリメートルのインジウムワイヤーシールをサンプルホルダーの底部の溝に配置し、両端が結合する場所に小さな重なりを残します。約100ミリグラムの凍結乾燥タンパク質を、サンプルホルダーの底部の内面を満たすように添加します。次に、サンプルホルダーを五酸化リン粉末を含むペトリ皿を備えたデシケーターに24時間置き、タンパク質粉末を完全に乾燥させます。インジウムシールと乾燥粉末とを入れた試料ホルダーの乾燥底部を秤量し、乾燥試料の質量を求める。デシケーターから五酸化リンを取り出し、粉末を水和するために、酸化重水素とサンプルが入ったペトリ皿を中に入れます。乾燥と水和を3回繰り返して、水素から重水素への完全な交換を行います。粉末の質量を定期的に測定して水和レベルを確認し、水和が目的のレベルをわずかに上回ったら、質量がゆっくりと減少するのを待ちます。希望の水和が得られたら、底部にすばやく蓋をし、最初に4本のネジでサンプルホルダーを閉じて蒸気交換を停止します。底部と蓋の間に隙間が見えなくなるまで、残りのネジをすべて配置して締めます。密閉されたサンプルホルダーの重量を量って、中性子実験後の漏れによる潜在的な水和損失がないか確認します。液体状態サンプルを調製するには、タンパク質を重水素化バッファーに溶解します。水を使用して、サンプルホルダーに入れる液体の適切な量を決定します。材料を取り扱う前に、電離放射線量が毎時100マイクロシーベルト未満であることを確認してください。次に、サンプルスティックを完全に乾かし、以前のサンプルをすべて取り除きます。サンプルスティックにサンプルを置き、ビームの中心に対して適切なセンタリングがあることを確認し、サンプルスティックをクライオ炉に挿入します。Nomadでデータを取得するには、実行タブに移動し、炉のクライオスタットコントローラーをランチパッドにドラッグアンドドロップします。温度を200ケルビンに設定します。高速モードと30分のタイムアウトを使用して、温度が安定する時間を確保します。リフレッシャーアイコンをクリックして、温度低下中のデータ収集のためにバックグラウンドで温度ランプを実行します。IN16ドップラー設定コントローラーをランチパッドにドラッグアンドドロップします。速度プロファイルを正確な速度に設定し、設定値を最大デルタEに設定し、エネルギーオフセットを0.00マイクロ電子ボルトに設定し、チャネル数を128に設定して、弾性固定ウィンドウスキャン構成を取得します。カウントコントローラーをランチパッドにドラッグアンドドロップし、字幕フィールドにデータを簡単に識別できる名前を入力し、60回の繰り返しで30秒のスキャンを設定します。次に、IN16ドップラー設定コントローラーをランチパッドにドラッグアンドドロップします。速度プロファイルを符号に設定し、設定速度を毎秒4.5メートルの値で設定し、チャネル数を2048に設定して、準弾性中性子散乱構成を取得します。カウントコントローラーをドラッグアンドドロップし、データを簡単に識別できる名前を字幕フィールドに入力します。4回の繰り返しで30分のスキャンを設定します。温度ランプの場合は、炉のクライオスタットコントローラーをドラッグアンドドロップし、温度を310ケルビンに設定し、ランプをデルタ0.05ケルビンの設定値に設定値に6秒間設定します。200 分のタイムアウトを使用します。for ループを 65 回繰り返します。内部に、IN16ドップラー設定コントローラーを挿入し、続いてカウントコントローラーを挿入し、30秒のシングルスキャンを設定します。続いて、前述のようにIN16ドップラー設定を挿入しますが、1.5マイクロ電子ボルトと1024チャンネルのエネルギーオフセットを使用します。次に、カウントコントローラーを挿入し、1回のスキャンを3分に設定します。312ケルビンの最後の準弾性中性子散乱を取得するには、前述のように構成されたIN16ドップラー設定とカウントコントローラーをドラッグアンドドロップします。次に、スタートボタンを押してスクリプトを実行します。リソソーム弾性および非弾性固定ウィンドウスキャンは、低運動量移動および低エネルギー移動でシグナルの増加を示し、高エネルギー移動および低運動量移動でのシグナルは減少した。最初の質量拡散係数の中心はナノ秒あたり15オングストロームの2乗であり、その後、時間の経過とともに指数関数的に減少しました。220ケルビンを超える温度では、タウ繊維の周りの水和水は、タウモノマーの周りよりも有意に可動性がありました。並進運動を受ける水分子の割合と水分子の並進拡散係数と回転拡散係数の両方が繊維周辺で増加した。タンパク質濃度は、中性子束またはサンプルホルダーバッファーバックグラウンドからの中性子後方散乱の制限により、タンパク質化タンパク質の場合は2000ミリグラム/ml、またはタンパク質化タンパク質の場合は少なくとも20ミリグラム/mlである必要があります。中性子後方散乱は、例えば、自然の環境タンパク質である水を、例えば薬物送達のようなバイオ技術応用のための合成ポリマーによって完全に置き換える方法を理解するために最近適用されている。

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