Name: レーザーマイクを用いた線虫組織の単離 - JoVEジャーナル
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 本研究は、レーザーマイクロディセプシングとCEL-Seq2を組み合わせた新規アプローチを用いて線虫組織を単離し、RNAシーケンスを促進する方法を詳述しています。

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この研究は、DFへのNIH(R01GM141395)およびNSF(1656736)助成金とAWへのNIHフェローシップ(F32GM136170)によって資金提供されました。 図 1 は、 BioRender.com の助けを借りて作成されました。

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</ol>

すべての著者は、利益相反がないと宣言します。

メソッドの重要な手順 正しく実行すれば、ここで説明する方法は、比較的少数のレーザー解剖サンプル(この例では70テールチップ)で堅牢なRNAプロファイルを取得します。しかし、発生中の動物からのサンプルの場合、サンプル間のばらつきを減らすためには、緊密な同期が不可欠です。このため、プロトコルではワーム同期のハッチオフ方式を推奨しています。ここで、研究者は、個人間の年齢差(本プロトコールでは1時間)を決定し、正確に制御することができる。さらに、ハッチオフ法は、胚が漂白剤に敏感であっても、L1が停止しない、またはL1停止からの回復が可変であっても、任意の種に適用可能である。ハッチオフによる同期を成功させるためには、洗浄ステップが重要です:すべての成虫と幼虫は孵化期間の初めに除去されなければならず、孵化期間の終わりに新しく孵化したL1と一緒に胚を洗い流すべきではありません。これは、プレートの寒天表面が亀裂、穴、または気泡によって損傷を受けておらず、プレート上の細菌芝生が新鮮で厚すぎず、液体が非常に穏やかに添加および攪拌される場合にのみ成功する。
男性と...

線虫、特にモデル系Caenorhabditis elegansに関連する横紋線虫は、多くの理由で進化発生生物学(EDB)のための動物の素晴らしいグループです1,2。利点には、少数の細胞、定義済みで一貫した細胞系譜、透明性、および培養および飼育の容易さが含まれる。また、複数の種のための高品質のゲノム、およびC. elegansのための、広範な分子遺伝学的ツールおよび発生、遺伝学、解剖学、および生理学に関する知識を含む多くの利用可能なリソースがあります3,4,5,6。
他の多くの生物と同様に、単一組織または単一細胞におけるトランスクリプトームダイナミクスを特徴付ける能力は、C. elegans 7,8,9,10における発生の分析に革命をもたらしました。線虫間で単一細胞トランスクリプトームを比較できれば、これらの生物を用いてEDBを同様に変換するであろう。例えば、このような比較は、保存された文字(形質)、発散した文字、または独立して進化した文字について、遺伝子調節ネットワークがどのように進化したかについての洞察を提供するであろう。

しかし、線虫から特定の組織または細胞を単離することは、大きな課題の1つです。多くの生物にとって、単一細胞を組織から解離させて公平な方法で採取するか、蛍光タンパク質の組織特異的発現で標識し、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって選別することができる11。C. elegansでは、丈夫な外側のキューティクル(および静水圧骨格)が幼虫および成虫からの細胞分離を妨げているため、細胞のハイスループット(HTP)単離は主に胚に限定されてきた。この課題を回避するために、いくつかの方法は、組織特異的mRNAタグ付け12、および細胞型13に影響を及ぼす野生型と変異体との間の差次的発現比較など、C. elegansワーム全体における遺伝的ツールを採用している。より最近の方法は、キューティクルを溶解して核14または細胞全体を単離することによって課題を克服している8、9、15。しかし、細胞単離および細胞培養には明らかな欠点があり、細胞が自然な発生的または解剖学的文脈から(例えば、細胞間シグナル伝達および細胞外マトリックスとの接触から離れるなど)除去され、遺伝子発現プロファイルに影響を与えることが予想される15。さらに、遺伝的ツールおよび組織特異的マーカーは種特異的である(すなわち、それらはC. elegansにおいてのみ使用することができる)。
LMDは、細胞の自然な文脈を破壊することなく組織を単離するための代替方法を提供する。EDBにとって有意に、LMDはまた、これらの種のゲノムまたはトランスクリプトーム配列全体が利用可能な場合、種固有の遺伝的ツールキットを必要とせずに、異なる種の相同組織からのトランスクリプトームを比較することを可能にする。LMDは、直接顕微鏡観察によって組織を標的化し、顕微鏡の光学系に統合されたレーザーマイクロビームを使用して、関心組織を切り出して採取(捕捉)することを含む16。LMDの限界は、それが非常にHTPアプローチに役立たないということです (ただし、テールチップの転写プロファイル, このプロトコルに記載されているように, 〜で堅牢でした 70 サンプル), 特定のサンプルを解剖するのが難しいかもしれません, そして、カットは、レーザーの精度と顕微鏡で視覚化することができるものに制限されています.
本プロトコールの目的は、LMD、それに続く単一組織RNA-Seqが、線虫から段階的および組織特異的トランスクリプトームデータを取得するためにどのように使用できるかを記述することである。具体的には、 C. elegansの第4段階幼虫(L4)から尾先を単離するためのLMDを実証する。しかしながら、この方法は、他の組織およびもちろん、異なる種に適合させることができる。
C. elegansでは、男性と雌雄同体の両方で尾の先端を作る4つの細胞があります。男性のL4段階では、雌雄同体ではそうではないが、尾先細胞は形を変え、前方および内側に移動する。このプロセスは、他の一部のラブディチッド線虫種でも起こるが、すべてではない。したがって、尾の先端は性的二型形態形成の進化のための良いモデルである。その位置のために、尾先端もLMDによって分離することが容易である。
テールチップからトランスクリプトームプロファイルを得るために、本プロトコルは、単一細胞のために開発されたRNA-seq法であるCEL-Seq2を使用する17、18。この方法は、LMD由来組織に対していくつかの利点を有する。CEL-Seq2は、mRNA読み取りの簡単な定量を可能にする一意の分子識別子(UMI)、線形増幅を保証する ためのインビトロ 転写、および個々の組織サンプルの多重化を可能にするバーコードを使用して、非常に高感度で効率的です。CEL-Seq2の唯一の制限は、回収された読み取りがmRNAの3'末端に偏っており、したがってほとんどのアイソフォームが区別できないことです。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;0.5 以上M PEN メンブレン ガラス スライド RNase フリー</td><td>ライカ</td><td>11600288</td><td>LMD</td></tr><tr><td>500 &micro;L PCRチューブ(ヌクレアーゼフリー)</td><td>Axygen</td><td>732-0675</td> テール<td>チップを40</td></tr><tr><td>倍対物レンズとDIC</td><td></td><td></td>でコンパウンド顕微鏡にカット <td>ワームの年齢をチェックするために</td></tr><tr><td>デスクトップ加湿器</td><td>透過</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光ベース付き解剖顕微鏡</td><td>すべての</td><td></td><td>ワームワーク</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>ワームピックの</td><td>任意の</td><td></td>ハンドル</tr><tr><td>スライドガラスとカバースリップ</td><td></td><td></td><td>ワームの年齢を確認するために</td></tr><tr><td>LMD6 マイクロダイセクションシステム</td><td>ライカ</td><td>マルチプル</td><td>テールチップをカットする</td></tr><tr><td>LoBindチューブ 0.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 バッファー</td><td></td><td></td><td>WormBook</td></tr><tr><td>のレシピ メタノール 99.8%</td><td>シグマ</td><td>322415ワー</td><td>ムを固定する</td></tr><tr><td>NGM 成長培地</td><td>US生物学的</td><td>N1000</td><td>バッファーと塩を追加する必要があります:WormBook</td></tr><tr><td>P10ピペットの</td>レシピ <td>可変容量(例:Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000ピペット 可変容量</td><td>例:Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2ピペット 可変容量</td><td>例:Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 1,000 & micro;L</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ1-10&micro;L</td>は<td>、任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラチナイリジウム</td><td>ワイヤーTritech</td><td>PT-9010</td><td>をろ過して、ワームピック</td></tr>を<tr><td>滅菌し、ヌクレアーゼフリーの1mLセントフュージチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr>任意の<tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>M9バッファーに非常に少量を追加して、ワームがピペットチップに付着するのを防ぎます</td></tr> ベン<tr><td>ト6mmプラスチックペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CEL-Seq2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation システム、高感度 RNA および DNA 検出用試薬付き</td><td>Aligent</td><td></td><td>自動電気泳動システム</td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td>DNA クリーンアップビーズ</td></tr><tr><td>ビーズ結合バッファー&nbsp; 20% PEG8000、2.5 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2 プライマー (表 S1 を参照)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>サーマルサイクラー、プログラム可能な蓋とブロック付き、200 & micro;Lチューブ。</td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 10 mM</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA リガーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT PCR Product Clean-Up</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>エキソヌクレアーゼ溶液</td></tr><tr><td>MEGAscript T7転写キット</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>For step 4.6.1</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>PCR mix step 4.9.7</td></tr><tr><td>random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>a primer with 6 nucleotides that are random</td></tr><tr><td>RNA Fragmentation buffer</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA フラグメンテーションストップバッファー</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA PCR Index Primers (RPI1&ndash;RPI48)</td><td>Illumina、NEB、またはIDT</td><td></td><td>RPIX(プロトコルステップ4.9.7)、Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>またはその他の類似製品</td></tr>から入手可能な配列 <tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinantリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Second Strand buffer</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>逆転写酵素</td></tr></tbody></table>

種にとらわれない単一組織アプリケーションのためのレーザーマイクロダイセクション

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

単一細胞方法論は、特定の細胞型のトランスクリプトームの解析に革命をもたらしました。しかし、それらはしばしば、蛍光タンパク質の組織特異的発現を駆動するプロモーターなどの種特異的な遺伝的「ツールキット」を必要とする。さらに、個々の細胞を単離するために組織を破壊するプロトコルは、細胞をそれらの天然環境から除去し(例えば、隣人からのシグナル伝達)、ストレス応答または他の天然遺伝子発現状態からの他の相違をもたらし得る。本プロトコールにおいて、レーザーマイクロダイセクション(LMD)は、雄尾先端形態形成中の遺伝子発現の研究のために個々の線虫尾先端を単離するように最適化されている。
LMDは、細胞破壊または種固有のツールキットを必要とせずに動物の一部を単離することを可能にし、したがってあらゆる種に適用可能である。その後、CEL-Seq2などの単一細胞RNA-seqライブラリー調製プロトコルをLMD単離単一組織に適用し、適切に注釈付きのゲノムまたはトランスクリプトームが種に利用可能であることを考えると、標準的なパイプラインを使用して分析することができます。このようなデータは、異なる種におけるその組織の発達の根底にあるトランスクリプトームがどれほど保存されているか、または異なっているかを確立するために使用することができる。
制限には、目的の組織を切り出す能力とサンプルサイズが含まれます。検出力解析では、80%の検出力に必要なテールチップは条件ごとにわずか70個であることが示されています。同じ発達段階でこの数の動物を得るためには、発達の緊密な同期が必要です。したがって、1時間間隔で動物を同期させる方法も記載されている。

レーザー捕獲微小解剖に続いて、4つの時点における男性および雌雄同体(L3 22時間後;L4 24、26、および28時間後)を、CEL-Seq2プロトコルを用いたRNAシーケンシングのために調製した。CEL-Seq2プライマーには、特定のサンプル(この場合は個々のテールチップ)からのシーケンシング読み取りをバイオインフォマティカルに識別できる独自のバーコードが含まれています。この方法でシーケンシングデータは、合計557本の尾先(4つの発達時点にわたる266頭の雌雄同体と291人の男性、性別および時間点ごとに59〜78人の尾)について生成された。CEL-Seq2バーコードは、これらのテールチップの97%(すなわち、543)について回収された(補足表S2)。ほとんどの図書館では、回復率は99-100%でした。しかし、男性の1つの時点については88%でした。COVID-19関連の遅延のために、22時間、24時間、および28時間の時点からのオスの尾の先端の約半分が、〜4ヶ月間-80°Cで保存されたことは注目に値します。これは、サンプリングの直後にシーケンシングライブラリを調製することが理想的である一方で、解剖され...

レーザーマイクロダイセクションを使用してRNAシーケンシングのために個々の線虫組織を単離するプロトコルが記載されている。このプロトコルは、種固有の遺伝子ツールキットを必要とせず、単一組織サンプルのレベルで異なる種間で遺伝子発現プロファイルを比較することを可能にする。

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

レーザーキャプチャマイクロダイセクションとCEL-Seq2と呼ばれる単一細胞RNAシークプロトコルを組み合わせて、小さな個々の組織サンプルのトランスクリプトームデータセットを生成します。この技術により、従来の細胞選別法では研究できない組織や種における遺伝子発現を研究することができます。さらに、バルクRNA-seqアプローチよりも特異性を提供します。ここでは、C.elegansの第4幼虫期の雄および雌雄同体のうちの4つの細胞尾先端についてこの技術を実証した。しかし、このアプローチの美しさは、それが非モデル種にも適用できることです。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるRaya Jallad氏と、現在テネシー州チャタヌーガのBaylor学校で生物医学科学者を率いるAntonio Herrera博士です。まず、1 ~ 2 ミリリットルの M9 バッファーをプレートの壁にそっとピペッティングし、噴出させません。プレートを渦巻いてワームを取り除きます。穴を突かないように、ピペットチップを寒天の端にあるプレートの壁に押し付けて、すべての液体とワームを取り除いて捨てます。このビデオは、母親と幼虫が取り除かれる前のプレートを示しています。母親と幼虫が取り除かれた後、胚だけが残されるべきです。L1幼虫は、1時間ほど孵化した後に現れ始めます。次に、プレートを摂氏25度に置きます。1時間後、プレートをインキュベーターから取り出します。寒天上に1ミリリットルのM9バッファーを慎重に落とし、プレートを渦巻いてL1を排出しますが、胚は取り除きません。チューブを遠心分離し、L1sを播種したプレートの細菌芝生に直接ピペットで送ります。ワームは摂氏25度に保ちます。30〜50倍の倍率の解剖顕微鏡下で、同期プレートから別々の非装着プレートにオスと雌雄同体をピッキングし始める。男性は、雌雄同体の尾の尖った形と暗い色と比較して、雄の尾の膨らんだ形と明るい色によって雌雄同体と区別されます。0.01%洗剤を含むM9バッファーで予備洗浄したピペットチップを使用して、1〜2ミリリットルのM9バッファーでプレートからワームを洗い流します。ワームを1ミリリットルの遠沈管に移し、1分間回転させ、1ミリリットルのM9バッファーを加える。もう一度、1分間回転します。氷冷70%メタノールを1ミリリットル加え、よく混ぜる。1ミリリットルのメタノールで洗浄を繰り返し、よく混ぜる。それを1分間回転させ、500マイクロリットルの70%メタノールを加える。それを混ぜて、摂氏4度で1時間から一晩保存します。固定されたワームのピペット20マイクロリットルをポリエチレンナフタレートまたはPEN膜スライドガラスのコーティング側に。メタノールが蒸発するのを待ちます。ステージ上のプラスチックシールドを取り外し、上向き矢印の付いたアンロードボタンをクリックして、メンブレンスライドをロードします。スライドが完全に乾いていることを確認し、メンブレンが下を向くように反転してスライドを挿入します。「標本の変更」ウィンドウで「続行」をクリックします。スライドホルダーが動きます。次に、画面の下部にあるプラスチックシールドを交換し、スライドが入っているスライドホルダーを選択し、下向き矢印の付いたアンロードボタンをクリックしてチューブをロードします。トレイを引き出し、チューブブロックを取り外します。4 本の 500 マイクロリットル PCR チューブのチューブキャップをホルダーに挿入し、チューブを下に折り畳みます。ブロックをトレイに戻し、トレイを顕微鏡ステージに戻します。変更コレクターデバイスのポップアップウィンドウで、PCR チューブを選択し、「OK」をクリックします。コレクタデバイスのチューブキャップの下にある画面の左下にある空のチューブ位置をクリックし、顕微鏡コントロールパネルで透過光明視野照明用のTLBFを選択します。2.5Xレンズを使用して、ワームとPEN膜の表面構造が見えるまでフォーカスを調整します。20Xレンズに切り替えて、ステージをワームのない領域に移動します。膜内の気泡のような構造が黄色がかった色になるように焦点を調整して、レーザーを正しい焦点面に焦点を合わせ、レーザーパラメータを設定します。テールチップについては、速度20のパワー45アパーチャ30から始めます。レーザーコントロールパネルで、キャリブレーションを選択し、指示に従います。次に、コレクターデバイスのチューブキャップで画面の下部で位置Aをクリックし、画面の右側で単一の形状を選択し、次に描画してカットします。次に、ポイントツーポイントを選択し、線を描きます。レーザーが膜を切断するように「切断開始」をクリックします。ワームを見つけて、移動と切断に切り替えます。尾を切り取るためにマウスを使用してください。解剖顕微鏡で膜切片を見つけ、下流のサンプル処理を続行します。ここでRNAシーケンシングはCEL-Seq2を用いた。1.2マイクロリットルのCEL-Seq2プライマーマスターミックスをピペットでサンプルの上に直接置き、チューブを閉じます。プライマー番号でラベルを付け、直ちにチューブキャップをドライアイスの上に直接置き、サンプルをフラッシュフリーズさせて RNA の分解を防ぎます。すべてのサンプルが収集されるまで繰り返します。最後に、チューブをマイナス70°Cで保管します。孵化後21〜23時間のC.elegans L3雌雄同体および雄は、それらの尾の形態によって解剖顕微鏡下で区別することができる。雌雄同体の物語は狭く、男性の物語は腫れてはっきりと見えます。PEN膜スライド構造とワームテールの外観は、これらの画像に示されています。ここでは、顕微鏡の20Xレンズと40Xレンズの焦点が正しいです。PEN膜を公平に切り取った解剖された尾がここに見えます。カットの隙間を閉じた後、膜ピースはスライドの下のチューブキャップに落ちます。解剖された尾先を含むPEN膜セクションを備えたチューブキャップがここに示されています。グラフィカル画像は、異なる時点および性別について、個々の尾先端あたりの自然対数変換された一意の分子識別子またはUMIカウントを表す。powsimRソフトウェアは、さまざまな発現レベルで差次発現またはDE遺伝子を検出するために必要な独立したサンプルの数を決定するために使用されます。ここでのグラフィカル画像は、条件ごとに異なるサンプルサイズを組み込んだ4つの異なるシミュレーションについて、2つの条件間でDE遺伝子を検出するための真陽性率を表しています。破線は 80% の真陽性率を示します。ここでは、誤検出率と同じ 4 つのシミュレーションを示します。破線は、10% の誤検出率を示します。グラフは、1条件あたり70テールチップのサンプルサイズが、非常に低い発現レベルの遺伝子を除いて、DE遺伝子を検出するのに十分であることを示した。適切な同期のために、胚のみがプレート上に存在することを確認してください。サンプルの損失を防ぐために、プライマーミックスをキャップのPEN膜セクションに直接ピペットで送り、キャップを閉じる際に非常に穏やかにしてください。種にとらわれないため、このプロトコルを使用して、異なる種の相同構造のために遺伝子調節ネットワークがどのように進化したかを調べることができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

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