Name: 慢性腰痛の機構的検討のためのラットの背部機械的感受性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: 学ぶラットの背部機械的感受性評価法（BMSテスト）を用いた慢性腰痛モデルの長期的研究手法。Von Frey法を応用し、治療介入効果の評価に有用で、実験者の標準化により再現性のある結果が得られます。

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この研究は、ケベック州カイロプラティック財団とカナダ自然科学工学研究評議会からの助成金(MP:助成金#06659)によってサポートされました。香港の貢献は、ケベック大学トロワリビエール大学(PAIRプログラム)によってサポートされました。BPの貢献は、ケベックアンサンテ財団(FRQS)とケベックカイロプラティック財団によってサポートされました。TPの貢献は、カナダ自然科学工学研究評議会によってサポートされました。NEとEKの貢献は、ケベックカイロプラティック財団によってサポートされました。MPの貢献はFRQSによってサポートされました。

実験プロトコルは、ケベック大学トロワリビエール大学の動物飼育委員会によって承認され、カナダ動物飼育評議会のガイドラインおよび国際疼痛学会(IASP)の研究および倫理問題委員会のガイドラインに準拠しました。本研究では、6匹の雄のWistarラット(体重:320〜450 g、年齢:18〜22週)を使用しました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。これらのラットからのデータは、以前の研究30のより大きなサンプルからのものである。
1. 実験準備
<ol><li>動物を標準的な動物施設の温度管理された部屋に収容し、食物と水を 自由に 利用でき、14時間から10時間の明暗サイクルで飼育します。実験当日、すべての動物が健康であることを確認してください。</li>
	<li>以下の手順に従って慢性腰痛動物モデルを生成します。<ol><li>慢性腰痛を誘発するには、以前の報告14,30,31に続いて、背中の筋肉に完全フロイントアジュバント(CFA)の筋肉内注射を行います。</li>
		<li>イソフルラン(誘導のために4%および維持のために2%〜2.5%)を使用して動物を麻酔する。</li>
		<li>27 Gの針を使用して、プロトコルのニーズに応じて、すぐに使用できるCFAの油中水型エマルジョン( 材料の表を参照)150 μLを片側または両側の傍脊髄筋に注入します。</li>
		<li>注射が完了した後、少なくとも3分間注射針を所定の位置に保ちます。対照群の動物については、同様の手順30を使用するが、CFAの代わりに滅菌生理食塩水(150μL、0.9%)の溶液を注入する。</li>
	</ol></li>
	<li>テストケージを製作します。<ol><li>動物ごとに1つのチャンバーで構成される2匹の動物用のテストケージを作成します。 注:本研究では、各チャンバーの寸法は、長さx幅x高さ:50 x 20 x 7 cmです( 材料の表を参照)。</li>
		<li>2つの隣接するチャンバーを長さ33cmのプレキシガラスの4本の脚に取り付けます。チャンバーの壁には透明なプレキシガラスを使用しますが、動物がお互いを見るのを防ぐために、チャンバーを分離するには黒いプレキシガラスを使用します。</li>
		<li>テストケージの床と天井を作るために、1mmのワイヤーで8mmのワイヤーで作られたステンレス鋼メッシュを使用します(図1)。</li>
	</ol></li>
</ol>2.バックメカニカル感度(BMS)テスト
<ol><li>最初の試験の前に、動物を30分/日、5〜7日間連続して試験ケージに慣れさせます。必要に応じてテストを繰り返します。</li>
	<li>2%イソフルラン31 を使用して動物を麻酔します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>イソフルラン麻酔下で腹臥位で、動物の毛髪トリマーを使用して、関心のある領域の後ろ毛(T6からL6の椎骨レベル)を剃ります( 材料の表を参照)。繰り返し測定する場合は、行動評価なしで1日3日ごとに後ろ髪を剃り、常に肌に直接刺激が与えられるようにします。異なる日にテストを繰り返すときにフィラメントが常に同じ領域に適用されるように、永久マーカーで皮膚に黒いマークを描きます。</li>
	<li>試験当日、動物が落ち着くまで、試験前に動物を試験ケージに15〜30分間入れます。</li>
	<li>テスト中、フォンフレイフィラメント(0.07、0.16、0.4、0.6、1、2、4、6、10、15、および26 g)を背面に垂直に適用し、常に2 gフィラメントから始めて、アップダウン法15 を使用します( 材料の表を参照)。動物の後ろからフィラメントでゆっくりと動物の背中に近づきます。<ol><li>動物が目を覚ましていて、4本の足で立っていて、動いていないときにのみフィラメントを塗ります。フィラメントを、棘突起から10 mmの関心のある領域に2秒間、15〜30秒ごとに30秒間適用します。 注:動物がフィラメントの適用中または適用直後に次の1つ以上の行動を示す場合、反応は陽性と見なされます:(1)筋肉のけいれん、(2)アーチ(背中の伸展)、(3)背中を見るための首の回転、(4)背中を引っ掻くまたはなめる、および(5)逃げる。</li>
	</ol></li>
	<li>前述の15のように、フィラメントの適用で応答が観察されない場合は、直列でより高い力で次のフィラメントを適用します。応答が観察された場合は、直列の力が低い次のフィラメントを使用します。最初の行動変化の後に4つの読み取り値が得られるまでこの手順を続けます(一連の「応答なし」の後の応答または一連の「応答」の後に応答なし)。</li>
	<li>データ収集が完了したら、次の式を使用して、Chaplanら15で説明されているように、機械的しきい値の50%を表す値を計算します。 50% 閾値 (g) = 10(Xf+kδ)/10 000 注:この式では、「Xf」は最後に使用されたフォンフレイフィラメントのハンドルマークです。「k」は動物の応答パターン15に基づく表の値であり、「δ」はフォンフレイフィラメント間のハンドルマークの増分の平均です。実験デザインと実験のニーズに応じて、脊椎の片側のみを評価して1つの閾値を報告することも、両側を評価して閾値を別々に、または平均として報告することもできます。計算テンプレート32については別表1を参照されたい。</li>
</ol>3.動物の回復
<ol><li>筋肉内注射が完了したら、麻酔を中止し、回復のために動物を標準のハウジングケージに単独で入れます。</li>
	<li>回復期間中は、動物の行動を調べ、放置しないでください。</li>
	<li>動物が麻酔から回復し、5分以内に正常に動くことを確認します。次に、動物を他の動物と一緒に通常の飼育ケージに戻します。 注:実験の終わりに、動物は深いイソフルラン麻酔(5%)下で10%ホルマリン溶液で心臓を通して灌流されます。次に、注射部位の背筋を抽出して、組織学と炎症性変化を確認します。</li>
</ol>

<ol><li>Hartvigsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+low+back+pain+is+and+why+we+need+to+pay+attention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">What low back pain is and why we need to pay attention.</a> Lancet. 391 (10137), 2356-2367 (2018).</li>
<li>Manchikanti, L., Singh, V., Falco, F. J., Benyamin, R. M., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+low+back+pain+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of low back pain in adults.</a> Neuromodulation. 17, Suppl 2 3-10 (2014).</li>
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<li>Kawakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathomechanism+of+pain-related+behavior+produced+by+allografts+of+intervertebral+disc+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Pathomechanism of pain-related behavior produced by allografts of intervertebral disc in the rat.</a> Spine. 21 (18), 2101-2107 (1996).</li>
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<li>Paquette, T., Eskandari, N., Leblond, H., Piché, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+neurovascular+coupling+is+preserved+despite+time+dependent+alterations+of+spinal+cord+blood+flow+responses+in+a+rat+model+of+chronic+back+pain%3A+implications+for+functional+spinal+cord+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Spinal neurovascular coupling is preserved despite time dependent alterations of spinal cord blood flow responses in a rat model of chronic back pain: implications for functional spinal cord imaging.</a> Pain. , (2022).</li>
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</ol>

著者は、利益相反につながる可能性のある競合する利益または関係を宣言しません。

重要な手順 BMSテストは、変化が起こると予想されるとき(疼痛モデル)、または薬理学的または非薬理学的介入後に、ある時点で、または数日または数週間にわたって繰り返し、ラットの背中の機械的感受性を評価する簡単な方法です。この方法の重要な問題には、ラットが快適であるがあまり動かないことを保証しなければならない試験ケージが含まれる。動物の背中は、再現可能な機械的刺激のためにメッシュ天井からアクセス可能なままでなければなりません。閾値評価のばらつきを制限するには、機械的刺激が皮膚に直接適用されるように、調査中の背部を剃る必要があります。さらに、機械的刺激が同じ領域に適用されるように皮膚にマークを付ける必要があります。最後に、実験者は、動物に見られないように、動物の後ろからフィラメントを皮膚に近づける必要があります。
後足15,16での機械的感度を評価するために使用されるフォンフライテストと比較して、BMSテストで陽性応答を生成するため...

腰痛(LBP)は、世界中の障害の主な原因であり、個人的、経済的、社会的に劇的な影響を及ぼします1,2,3,4。毎年、人口の約37%がLBP5の影響を受けています。LBPは通常数週間以内に解消しますが、個人の24%〜33%で再発し、症例の5%〜10%で慢性化します2。LBPのメカニズムと影響、およびさまざまな治療介入の効果を理解するために、臨床状態またはLBP6のいくつかの成分を模倣したLBPのいくつかの動物モデルが使用されてきました。これらのマウスおよびラットモデルは、以下のカテゴリーの1つ以上に分類することができる:(1)椎間板形成性LBP7,8、(2)神経根性LBP 8,9,10,11、(3)椎間関節変形性関節症12、および(4)筋肉誘発性LBP 13,14.痛みはヒト以外の種では直接測定できないため、これらのモデルで痛みのような行動を定量化するために多数のテストが開発されています8。これらのテストは、有害な刺激(機械的力15,16,17、熱刺激18,19,20,21,22,23,24,25)によって引き起こされる、または自発的に生成された行動を評価します26,27,28,29。
機械的刺激を使用する方法には、フォンフレイテスト15,16およびランドールセリットテスト17が含まれます。熱刺激を使用する方法には、テールフリックテスト18、ホットプレートテスト19、ハーグリーブステスト20、およびサーマルプローブテスト21が含まれます。低温刺激を使用する方法には、コールドプレート試験22、アセトン蒸発試験23、および冷足底アッセイ24が含まれる。自発的行動のための方法には、しかめっ面スケール26、穴掘り27、体重負荷および歩行分析28、ならびに自動行動分析29が含まれる。これらの多数の利用可能なテストにもかかわらず、それらのどれも腰痛モデルのために特別に設計されていません。
この研究の目的は、ラットの背中の機械的感受性を評価するための簡単でアクセス可能なテストを設定することです。この技術は、主に後足15,16の足底表面に適用されるフォンフライテストに基づいています。フォンフライテストの基本原理は、一連のモノフィラメントを関心領域に使用し、一定の事前に決定された力を提供することです。ラットが侵害行動を示した場合、応答は陽性と見なされます。次に、機械的閾値は、応答を誘発したフィラメントに基づいて計算することができる。本研究では、ラットの背中の機械的感受性を決定するために、フォンフライテストから適応された簡単でアクセス可能な方法が提供されます。

<table><tbody><tr><td>Aerrane(イソフルラン、USP) - 獣医用のみ</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>吸入麻酔薬;DIN 02225875、麻酔</td></tr>完全<tr><td>フロイントアジュバント(CFA)</td>を誘導するためのフィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>#77140</td><td>完全フロイントアジュバント(CFA)の油中水型エマルジョンで、Mycobacterium butyricumの細胞を殺しました。</td></tr><tr><td>オスのWistarラット</td><td>チャールズリバー研究所</td><td></td><td>の体重:320&ndash;450グラム;年齢:18-22週。</td></tr><tr><td>ペンロンシグマデルタ気化器</td><td>ペンロン</td><td>990-VI5K-SVEEK</td><td>麻酔に使用されるペンロンシグマデルタ気化器</td></tr><tr><td>シャーピー永久マーカー</td><td>シャーピー</td><td>BC23636</td><td>永久マーカー、ファインポイント、ブラック</td></tr><tr><td>テストケージ</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>幅:20cm;&nbsp;長さ:50 cm;下から上までの高さ:40 cm;下部メッシュからケージの上部までの高さ:7 cm;壁の厚さ:5 mm;メッシュ:1mmのワイヤーと8mmのワイヤー間距離&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>フォン・フレイ・フィラメント・</td><td>アエステジオ、精密触覚感覚評価器</td><td>514000-20C</td><td>フィラメント、0.07gから26gまでのウォール</td></tr><tr><td>・プロフェッショナル・アニマル、ARCOコードレス・ペット・クリッパー、トリマー・グルーミング&nbsp;</td><td>Wahl</td><td>Kit #8786-1201</td><td>髭剃り用動物用毛剃り機、ゼロブレード&nbsp;</td></tr></tbody></table>

慢性腰痛の機構的検討のためのラットの背部機械的感受性評価

Back Mechanical Sensitivity Assessment in the Rat for Mechanistic Investigation of Chronic Back Pain

腰痛は世界中の障害の主な原因であり、個人的、経済的、社会的に劇的な結果をもたらします。新規治療法の開発には、トランスレーショナルな観点から新規治療法のメカニズムと有効性を調べるための動物モデルが必要です。現在の調査では、腰痛のいくつかのげっ歯類モデルが使用されています。しかし、驚くべきことに、腰痛モデルの機械的感度を評価するための標準化された行動テストは検証されていませんでした。これは、腰痛と推定される動物が侵害受容刺激に対して局所的な過敏症を示すことを確認し、腰痛を和らげるように設計された介入中の感度を監視するために重要です。この研究の目的は、ラットの背中の機械的感受性を評価するための簡単でアクセス可能なテストを設定することです。この方法のために特別にテストケージが製造されました。長さx幅x高さ:50 x 20 x 7 cm、上部にステンレス鋼メッシュがあります。このテストケージは、背中に機械的刺激を加えることを可能にします。試験を実施するには、動物の背中を関心領域で剃り、必要に応じて異なる日に試験を繰り返すように試験領域にマークを付ける。機械的閾値は、前述のアップダウン法を利用して、傍脊髄筋に適用されるフォンフレイフィラメントによって決定されます。肯定的な反応には、(1)筋肉のけいれん、(2)アーチ(背中の伸展)、(3)首の回転、(4)背中を引っ掻く、または舐める、(5)逃げるなどがあります。この行動テスト(背部機械的感受性(BMS)テスト)は、腰痛の予防と管理のための治療的介入の開発のための腰痛のげっ歯類モデルを用いた機構研究に役立ちます。

この方法は以前の研究で使用され、CFAと対照ラット30の間の機械的感受性を比較するために完全なデータと統計が提示されました。前の研究に含まれる6匹のラットからの代表的な個体データ(左右の閾値の平均)を 図3 および 表1に示す。ベースラインでは、機械的感受性は群間で類似していた。腰部筋肉へのCFAの筋肉内注射は、CFA注射後7日から28日にかけて機械的感受性の著しい増加(閾値の低下)を引き起こした。対照的に、対照(CTL)ラットはこの変化を示さなかった。 図3に示すように、この種の行動評価で予想されるように、動物内および動物間で変動が観察されました。しかし、過敏性CFAラットは変動性の減少を示した。以前の研究30に基づいて、16匹の動物(8 CFAおよび8 CTL)は、5つの時点(η2p = 0.38)にわたってグループ間の有意な...

腰痛の予防と管理のための新しい治療的介入を開発するためには、動物モデルがトランスレーショナルの観点からこれらの治療法のメカニズムと有効性を調べる必要があります。本プロトコールは、ラットにおける背部機械的感受性を評価するための標準化された方法であるBMS試験を記載する。

Low back pain is the leading cause of disability worldwide, with dramatic personal, economic, and social consequences. To develop novel therapeutics, ...

このプロトコルは、背面の機械的感度をテストするのに役立ちます。慢性腰痛のラットモデルにおける縦断的デザインにとって特に興味深いものであり、有害な刺激に対する背中の感受性を低下させるための介入の有効性を調べることが目標です。この方法はシンプルでアクセスしやすく、訓練を受けた実験者でも再現性のある結果が得られます。これは主に、後足の機械的感度を評価するために一般的に使用されるフォンフライテストに基づいています。他の行動テストに関しては、実験者はフィラメントの適用を標準化する練習をし、機械的刺激によって生成された行動が他の行動と容易に区別されるまで練習する必要があります。それ以外の場合、テストは単純であり、それを使用するのに大きな問題はないはずです。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるナシム・エスカンダリです。ラットに慢性腰痛を誘発するには、背中の筋肉に完全フロイントアジュバント(CFA)の筋肉内注射を行います。27ゲージの針を使用して、すぐに使用できるCFAの油中水型エマルジョン150マイクロリットルを片側または両側の傍脊髄筋に注入します。針を少なくとも3分間所定の位置に保ちます。次に、長さ33センチメートルのプレキシガラスの脚4本に2つの連続したチャンバーを取り付けることにより、各動物に1つのチャンバーを含む2匹の動物用の試験ケージを作製します。チャンバーの壁には透明なプレキシガラスを使用し、チャンバーを分離するには黒いプレキシガラスを使用して、動物がお互いを見るのを防ぎます。次に、8ミリメートルのワイヤ間距離を持つ1ミリメートルのワイヤで作られたステンレス鋼メッシュを使用して、テストケージの床と天井を作成します。最初の試験の前に、ラットを1日30分間、5〜7日間連続して試験ケージに慣れさせます。イソフルラン麻酔下で腹臥位で、動物の毛髪トリマーを使用して、約10の椎骨レベルにわたって関心のある領域の後ろ髪を剃ります。繰り返し測定する場合は、行動評価なしで3日ごとに後ろ髪を剃り、刺激が常に皮膚に直接適用されるようにします。異なる日にテストを繰り返すときにフィラメントが常に同じ領域に適用されるように、永久マーカーで皮膚にマークを描きます。試験当日、ラットが落ち着くまで、試験前にラットを試験ケージに15〜30分間入れます。次に、フォンフレイフィラメントを背面に垂直に適用し、常に2グラムのフィラメントから始めて、アップ/ダウン法を使用します。背骨から10ミリメートルの関心領域に両側に2秒間フィラメントを適用し、ラットが目を覚まし、その4本の足で立っていて、動かないときに15〜30秒ごとに処理されます。フィラメントを適用しても応答が見られない場合は、シリーズ内でより高い力で次のフィラメントを適用します。背中をアーチ状にする、なめる、筋肉のけいれん、フィラメントから離れる、回転などの肯定的な反応が観察された場合は、シリーズの力が低い次のフィラメントを使用してください。最初の行動変化後に4つの測定値が得られるまで手順を続けます。この研究では、CFAと対照ラットの間の背部機械的感受性を調査しました。ベースラインでは、機械的感受性は群間で類似していた。腰部筋肉へのCFAの筋肉内注射は、7日から28日まで機械的感受性の著しい増加を引き起こした。対照的に、対照ラットは有意な変化を示さなかった。さらに、組織学的検査により、明確な白血球浸潤を伴うCFAを注射した筋肉に慢性炎症性変化が存在することが確認された。生理食塩水の筋肉内注射後の対照ラットからの健康な背筋が基準として示されている。機械的過敏症は、背中の筋肉に加えて、標準的なフォンフレイテストで後足で観察されました。フィラメントが常に背中に垂直に同じ方法で適用されていること、およびフィラメントを適用するときに動物が動いていないことを確認することが非常に重要です。実験者はまた、現代の動きに対する行動反応を区別することに自信を持っているはずです。

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Research

JoVE Journal

Behavior

行動

我々は、ラットの脊髄損傷の急性または慢性期には2つの触覚感覚のテスト方法について説明します。これらの検証の手順は、異痛症のような感覚の開発と保守を検出することができます。...

ラット脊髄損傷後の急性および慢性の触覚官能検査

手術のシンプルかつ堅牢な行動の結果により、坐骨神経の慢性収縮は、神経因性疼痛の卓越した動物モデルの一つです。手術後24時間以内に、疼痛過敏症は、von...

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ラットにおける複雑な局所疼痛症候群タイプIに対する慢性虚血後疼痛モデル

機械的競合回避アッセイは、マウスの疼痛感受性の非反射的読み出しとして使用され、様々なマウス疼痛モデルにおける情動動機付け応答をよりよく理解するために使用することができる。...

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腰痛に関連する生体力学的変化:リハビリテーションにおける運動パターン評価と治療評価のための革新的なツール

このプロトコルでは、マウスの膝の痛覚過敏を測定する方法が説明されています。急性膝痛のマウスモデルと変形性関節症(OA)のモデルで例を示しています。...

Pressure Application Measurementを用いたマウスの膝痛覚過敏の評価

学ぶラットの背部機械的感受性評価法（BMSテスト）を用いた慢性腰痛モデルの長期的研究手法。Von Frey法を応用し、治療介入効果の評価に有用で、実験者の標準化により再現性のある結果が得られます。

慢性腰痛の機構的検討のためのラットの背部機械的感受性評価

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